Общей и наиболее значительной особенностью этого нового класса антибиотиков является их исключительная активность как противоопухолевых агентов. Так, каликеамицин ?11 примерно в 4000 раз более активен, чем наиболее мощный применяемый в клинике антибиотик адриамипин. Сам он из-за своей высокой токсичности не может применяться в медицине, однако конъюгаты его производных с моноклональными антителами, селективными по отношению к опухоли, обнаруживают многообещающие свойства: высокую активность против опухолей при низкой токсичности (поясним, что использование подобных антител обеспечивает возможность целевой доставки агента к тканям-мишеням, т. е. в данном случае к опухоли. Само по себе это не влияет на общую токсичность антибиотика, но позволяет резко снизить терапевтическую дозу). Эсперамицин A1 обнаруживает мощную активность против ряда модельных опухолей мышей при исключительно низких дозах (примерно 100 нг/кг) и сейчас проходит II фазу клинических испытаний.

Многочисленными экспериментами in vitro и in vivo было установлено, что биологической мишенью ендииновых антибиотиков является ДНК и что повреждение, вызываемое ими, состоит в разрыве цепей ДНК, причем в зависимости от природы агента могут происходить как одно-, так и двунитевые разрывы. На характер действия антибиотика влияет также природа углеводных фрагментов молекулы. Например, нативный эсперамицин вызывает однонитевое расщепление ДНК, тогда как его аналог, полученный частичным гидролизом углеводной цепи, обнаруживает способность осуществлять двунитевое расщепление ДНК.

Ендииновые антибиотики по характеру воздействия на ДНК сайт-селективны. Например, при обработке ДНК каликеамицином ?11 основная часть разрывов приходится на фрагменты (сайты) ТССТ и СТСТ. Узнавание сайтов ДНК и эффективность связывания с ними определяется взаимодействием ДНК с углеводными и/или ароматическими остатками антибиотика. Так, согласно результатам исследования с помощью ЯМР, антибиотик в растворе принимает развернутую и высоко организованную конформацию, особенно хорошо приспособленную для связывания с малой бороздкой ДНК. При этом критически важным для селективности и эффективности связывания является контакт с олигосахаридным доменом антибиотика. Деструкция ДНК может достигаться также и при действии каликеамицинона, агликона антибиотика. В этом случае требуется гораздо более высокая концентрация агента, а реакция протекает неселективно и преимущественно путем расщепления единичной нити. В то же время было показано, что синтетический олигосахарид, идентичный углеводной составляющей, связывается с тем же сайтом ДНК, что и исходное природное соединение, и такое связывание может полностью блокировать расщепление ДНК антибиотиком.

Ендииновый фрагмент, являющийся наиболее заметной и характерной структурной особенностью описанных антибиотиков, ответственен за расщепление нитей ДНК, вызываемое этими агентами. Само расщепление представляет собой конечный результат последовательности нескольких реакций ендииновой системы.

Наличие в этих антибиотиках ендииновой группировки и гемолитический характер вызываемых ими повреждений ДНК привели к заключению о ключевой роли циклоароматизации Бергмана в химизме взаимодействия этих агентов с ДНК. Правомерность такого предположения была подтверждена изучением различных аспектов реакционной способности ендииновых антибиотиков в сочетании с данными по их реакциям с нативной ДНК или синтетическими олигонуклеотидами. На основании результатов таких исследований было сформулировано вполне удовлетворительное общее для всей этой группы антибиотиков описание химических событий, ведущих в конечном счете к расщеплению молекулы ДНК.

Разумеется, приведенное выше образное описание представляет собой известное упрощение, поскольку при функционировании ендииновых антибиотиков в определенной степени происходит взаимодействие упоминавшихся систем и «устройств». Тем не менее, выяснение основных принципов, использованных Природой при изобретении этого вида «оружия», значительно облегчило поиски, направленные на разработку искусственно созданных аналогов ендииновых антибиотиков с аналогичной или модифицированной картиной биологической активности. Конечная цель этих исследований состоит в том, чтобы создать действующую модель упомянутых антибиотиков, способную осуществлять аналогичное повреждение ДНК опухолевых клеток и пригодную в качестве противоракового лекарственного средства. В химических терминах это означает, что такие потенциальные лекарственные средства должны обладать следующими особенностями:

а) содержать фрагмент, способный в мягких условиях претерпевать циклизацию Бергмана;

б) содержать фрагмент, способный играть роль предохранителя и спускового механизма, запускающего эту реакцию в подходящий момент;

в) нести функциональную группу, которая пригодна для присоединения дополнительных остатков, необходимых для эффективной доставки агента к мишени и образования сайт-селективного интеркаллята ДНК/лекарство.

Предварительные исследования в этой области были направлены на выяснение структурных предпосылок, определяющих легкость и эффективность циклизации Бергмана. В терминах использованной нами военной аналогии эту часть общей проблемы можно рассматривать как конструирование «боеголовки».

Кратко рассмотренные здесь текущие исследования в этой области являются ярким примером функционально ориентированного дизайна, выполняемого на строго рациональной основе. В самом деле, в результате первоначальных исследований механизма повреждения ДНК природными антибиотиками было построено вполне удовлетворительное описание химии отдельных стадий, ведущих в конечном счете к расщеплению нити ДНК. Благодаря достигнутому пониманию сущности химических событий, происходящих при взаимодействии антибиотиков с ДНК, общая проблема создания искусственных систем с такой же биологической активностью могла быть сформулирована в структурных терминах и превращалась в чисто химическую задачу дизайна структур, несущих определенный набор надлежащим образом расположенных функциональных групп.

Следует подчеркнуть, что до сих пор все успехи в этой области ограничивались дизайном упрощенных аналогов, способных воспроизводить только само расщепление ДНК природными прототипами. Между тем, структуры всех ендииновых антибиотиков содержат также домены, составляющие элементы систем доставки агента к мишени и его селективного связывания с этой мишенью. Функционирование этих систем управляется гораздо более прихотливыми взаимодействиями между вовлеченными в события молекулами, которые пока затруднительно недвусмысленно интерпретировать в терминах «причины и следствия». Поэтому рациональный дизайн структурных фрагментов, которые следует присоединить к молекуле аналога с тем, чтобы он и в этом отношении функционировал подобно природному образцу, представляет несравненно более трудную задачу. Пока что достижения в этом направлении не слишком выразительны и основаны главным образом на чисто эмпирическом варьировании природы «привесков» (таких, как ароматические циклы или углеводные остатки). Тем не менее, есть все основания ожидать, что накопление экспериментальных данных в конечном итоге принесет реальный прорыв в понимании основных особенностей явлений молекулярного узнавания и связывания, что сделает возможным создание более изощренных моделей, наделенных способностью к специфическому связыванию с ДНК.

Кажется очевидным, что невозможно жестко отграничить структурно-ориентированный молекулярный дизайн от функционально-ориентированного. Эта искусственно введенная классификация до некоторой степени удобна для более или менее организованного изложения огромного и разнообразного материала, накопленного в этой области. Нетрудно было бы показать, что почти любая структура или необычный дизайн, представляют непосредственный или по крайней мере потенциальный интерес для функционально-ориентированного дизайна. Интересно, что последний (функционально-ориентированный дизайн) не только базируется (в значительной степени) на достижениях дизайна структурно-ориентированного, но и, в свою очередь, может быть источником импульсов к созданию новых структурных типов.

Раздел V. Экспериментальная часть

5.1 Методика исследования

Таблетки ацетилсалициловой кислоты 0,5 г

Состав на одну таблетку:

· Ацетилсалициловой кислоты - 0,5 г

· Вспомогательных веществ - достаточное количество

Описание. Таблетки белого цвета, слабокислого вкуса.

Подлинность. 0,5 г порошка растертых таблеток кипятят в течение 3 минут с 5 мл раствора едкого натра, затем охлаждают и подкисляют разведенной серной кислотой; выделяется белый кристаллический осадок. Раствор сливают в другую пробирку и добавляют к нему 2 мл спирта и 2 мл концентрированной серной кислоты; раствор имеет запах уксусноэтилового эфира. К осадку добавляют 1--2 капли раствора хлорида окисного железа; появляется фиолетовое окрашивание.

0,2 г порошка растертых таблеток помещают в фарфоровую чашку, добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты, перемешивают и добавляют 1--2 капли воды; ощущается запах уксусной кислоты. Затем добавляют 1--2 капли формалина; появляется розовое окрашивание.

Свободная салициловая кислота. Навеску порошка растертых таблеток, соответствующую 0,3 г ацетилсалициловой кислоты, растворяют в 5 мл спирта и разводят 25 мл воды (испытуемый раствор). В один цилиндр помещают 15 мл этого раствора, в другой -- 5 мл того же раствора, 0,5 мл 0,01% водного раствора салициловой кислоты, 2 мл спирта и доводят водой до 15 мл (эталонный раствор). Затем в оба цилиндра добавляют по 1 мл кислого 0,2% раствора железоаммониевых квасцов.

Окраска испытуемого раствора не должна быть интенсивнее эталонного раствора (не более 0,05% в препарате).

Количественное определение. Около 0,3 г (точная навеска) порошка растертых таблеток взбалтывают с 10 мл нейтрализованного по фенолфталеину спирта в течение 10 минут. Затем жидкость охлаждают до 8--10° и титруют с тем же индикатором 0,1Н раствором едкого натра до розового окрашивания.

1 мл 0,1Н раствора едкого натра соответствует 0,01802 г ацетилсалициловой кислоты, которой соответственно должно быть 0,475--0,525 г, считая на средний вес одной таблетки.

Хранение. В хорошо укупоренной таре.

5.2 Результаты исследования