Роль лабораторного техника в диагностике ВИЧ-инфекции

Этапы иммуноблоттинга:

1. Разделение белков методомгель-электрофореза

2. Перенос белков на мембрану

3. Блокирование

4. Детекция

1. Разделение белков методом гель-электрофореза. Наиболее распространенный способ разделения белков -- электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS) по методу Лэммли. Подлежащие анализу белки в присутствии додецилсульфата натрия приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы. Предварительно денатурированные белки вносят в карманы «треков» (дорожек) акриламидного геля с низкой концентрацией (концентрирующий гель), что позволяет их сконцентрировать перед переходом в разделяющий гель (с более высокой концентрацией), где происходит разделение белков в зависимости от молекулярной массы. Белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее. Как правило, одну из «дорожек» оставляют для маркеров молекулярной массы (смеси белков с известными массами). Отличия в скорости продвижения -- электрофоретической подвижности приводит к разделению белков на полосы. Концентрация акриламида определяет разрешающую способность геля -- чем выше концентрация акриламида, тем лучше разделение низкомолекулярных белков. Низкая концентрация акриламида улучшает разрешающую способность гель-электрофореза для высокомолекулярных белков.

2. Перенос белков на мембрану. В методе электроблоттинга перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF) происходит под действием электрического тока. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого процесса (от англ. Blotting-промокание) белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны и доступны для дальнейшего связывания с антителами. Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки. Связывание белков основано как на гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком.Э

Ффективность электроблоттинга значительно повышается при использовании системы Транс-блот Turbo, позволяющей существенно уменьшить время переноса белков из геля на мембрану (7 мин. против 2 часов).В связывании комплекса белок-SDS с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле. Эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Coomassieblue или Ponceau S. Предпочтительно используется краситель Ponceau S, который обладает большей чувствительностью и лучше растворим в воде, что упрощает последующую отмывку и нанесение антител.

3. Блокирование. Блокирование неспецифичных связываний достигается инкубацией мембраны в разбавленном растворе белка -- обычно бычьего сывороточного альбумина или обезжиренного сухого молока с небольшим процентом детергента типа Tween 20 или Triton X-100. Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех местах, где нет исследуемого белка. В результате антитела при их добавлении могут связываться только с специфичными сайтами связывания на исследуемых белках. Блокирование позволяет достигать чистого фона и исключает получение ложноположительных результатов.

4. Детекция. После блокирования мембраны 3-х кратно отмывают буфером. Затем исследуемые белки детектируют с использованием антител методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые в свою очередь связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой). Визуализация исследуемого белка достигается путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяется колориметрическим, хемилюминесцентным, флюоресцентным методами детекции. Хемилюминесцентнаядетекция обладает более высокой чувствительностью по сравнению с колориметрическим методом. Взаимодействие люминола и пероксида в присутствии пероксидазы хрена, конъюгированной с вторичными антителами, приводит к образованию окисленного люминола, который обладает люминесцентным свечением при 425 нм. Интенсивность хемилюминесценции пропорциональна количеству исследуемого белка (антигена). Детекция хемилюминесценции (как и флуоресценции) осуществляется с помощью гель-документирующей системы ChemiDocMP, которая обладает высоким разрешением и чувствительностью. Система ChemiDocMP снабжена CCD камерами высокого разрешения и мощной системой охлаждения, что позволяет точно фиксировать нечеткие, расплывчатые полосы. Наличие программного обеспечения позволяет проводить качественный и количественный анализ полученных данных по сравнению со стандартными белками.

2.3 Анализ эпидемиологической ситуации

В мире:

По состоянию на конец 2011 года заразились ВИЧ-инфекцией 60 миллионов человек, из них:

· 25 миллионов умерли

· 35 миллионов живут с ВИЧ-инфекцией.

Из 35 миллионов живущих с ВИЧ-инфекцией часть в живых благодаря приёму антиретровирусной терапии. Необходимые лекарства получают менее половины из 9,5 млн. носителей, нуждающихся в противовирусной терапии. Более двух третей ВИЧ-инфицированных населяют Африку к югу от пустыни Сахары. Эпидемия началась здесь в конце 1970-х -- начале 1980-х. Центром считается полоса, протянувшаяся от Западной Африки до Индийского океана. Затем ВИЧ перекинулся южнее. За исключением стран Африки быстрее всего ВИЧ распространяется сегодня в Центральной Азии и Восточной Европе. С 1999 по 2002 годы количество инфицированных здесь почти утроилось. Эти регионы сдерживали эпидемию до конца 1990-х, а затем количество заражённых стало резко увеличиваться -- в основном за счёт инъекционных наркоманов. Значительно ниже среднего распространенность ВИЧ-инфекции в Восточной Азии, Северной Африке и на Ближнем Востоке. В масштабе всей Земли эпидемия стабилизировалась: не возросла доля эпидемии в отношении всего населения, снижается количество новых случаев ВИЧ-инфекции (с 3,5 миллионов новых случаев в 1997 году до 2,7 миллионов в 2007 году).

В России:

На 1 января 2013 года в России зафиксировано 719 445 ВИЧ-инфицированных, в том числе детей до 14-ти лет -- 6,306 тыс. В связи с отсутствием профилактики ВИЧ, за год число заразившихся ВИЧ россиян увеличилось на 69,28 тыс.. Показатель распространённости ВИЧ-инфекции среди взрослых достиг значения ~1,1 %.. От болезней, связанных с ВИЧ и СПИД в 2006 году умерли 19 347 человек, среди них 353 ребёнка. На 1 декабря 2012 года в России зафиксировано 125 тыс. случаев смерти от СПИДа. Около 60 % случаев ВИЧ-инфицирования среди россиян приходится на 11 из 86 российских регионов (Иркутская,Саратовская, Калининградская,

Ленинградская, Московская, Оренбургская, Самарская, Свердловская и Ульяновская области, Санкт-Петербург и Ханты-Мансийский автономный округ).

По данным на конец 2012 года: за последние 5 лет число ВИЧ-инфицированных увеличилось в 2 раза. Но многие люди могут и не знать, что болеют. По разным методам оценки, реальное количество ВИЧ-инфицированных может составлять от 950 тыс. до 1 млн. 300 тыс. человек.

По данным на конец 2013 года, в России активизировался выход эпидемии из уязвимых групп населения в общую популяцию. В эпидемию вовлечены социально адаптированные люди трудоспособного возраста. Максимальная пораженность ВИЧ-инфекцией зарегистрирована среди женщин в возрастной группе 25-34 года, среди мужчин в возрастной группе 30-34 года. Основные пути заражения следующие:

· 58 % -- внутривенное введение наркотиков нестерильными инструментами

· 40 % -- гетеросексуальный контакт.

В Дальневосточном федеральном округе:

В последние годы существенно увеличился охват лечением ВИЧ-инфицированных пациентов ДВФО, что, в первую очередь, связано с реализацией приоритетного национального проекта в сфере здравоохранения. Так, в целом по округу в 2013 году из 2821 инфицированных, нуждающихся в лечении, его получили 2804 человека, или 99,4% (в 2007 г. - 88,3%, в 2008 г. - 98,9%, в 2009 г. - 99,4%, в 2010 г. - 99,2%, в 2011 г. - 99,1%, в 2012 г. - 99,3%) - табл. 9. На большинстве административных территорий Дальневосточного федерального округа охват лечением составил 100%.(Таблица 4). По состоянию, на конец 2013 года подлежало диспансерному наблюдению 10444 ВИЧ-инфицированных пациентов ДВФО (в 2009 г. - 7384, в 2010 - 8394, в 2011 г. - 9024, в 2012 г. - 9514). Из них 9312 человека (89,2%) было охвачено таким наблюдением. На территории Амурской, магаданской областей, Чукотского автономного округа, охват диспансерным наблюдением ВИЧ-инфицированных составил 100% (таблица 5). Профилактика вертикального пути передачи ВИЧ-инфекции в ДВФО в 2013 году проводилась 188 беременным женщинам из 177 нуждающихся в ней, охват составил 94,2%. На территории республики Саха (Якутия), Камчатского и Хабаровского краев, Сахалинской и Амурской области охват химиопрофилактикой составил 100%. Из 189 ребенка, рожденного от ВИЧ-инфицированных матерей, химиопрофилактика была проведена 186 детям, что составило 98,4%. (таблица 6). Одним из критериев оценки состояния иммунной системы и качества лечения ВИЧ-инфицированных пациентов является определение иммунного статуса и уровня вирусной нагрузки ВИЧ. В 2012 году в ДВФО на иммунный статус было обследовано 7557 ВИЧ-инфицированных, а определение вирусной нагрузки - 7359 ВИЧ-инфицированным (таблица 7).

Анализ результатов серологических исследований на антитела к ВИЧ за 2013 г.

В 2013 году в Дальневосточном федеральном округе было проведено 1265277 обследований на антитела к ВИЧ (в 2011 г. - 1275893, в 2012 г. - 1297188, в 2013 г. - 1219560), число анализов составило 1369427.

Охват населения ДВФО тестированием на антитела к ВИЧ в 2012 г. составил 18,6%, в 2012 г. - 17,8%, в 2013 г. - 18,5%, в 2009 г. - 17,7%, в 2010 г. - 18,4%. Наибольший охват тестированием был в Магаданской, Сахалинской областях, Камчатском и Хабаровском краях, республике Саха (Якутия) - 23,7, 23,3, 21,7, 20,3, 19,6% соответственно (таблица 8).

В структуре населения ДВФО, обследованного на антитела к ВИЧ в 2012 году, так же, как и в предыдущие годы, преобладали лица, обследованные по клиническим показаниям, и лица из группы «Прочие» - 29% и 27,4% соответственно (таблица 9). Достаточно высокий удельный вес среди обследованных пациентов продолжают занимать беременные (21,6%) и доноры (12,6%). Доля обследованных лиц из мест лишения свободы и потребителей инъекционных наркотиков осталась практически на прежнем уровне (2,1 и 0,7% соответственно), при этом низким остается объем обследования ПИН, лиц с гомо- и бисексуальной ориентацией и лиц из очагов эпидемиологического обследования. При анализе структуры обследованных на ВИЧ-инфекцию детей, подростков и лиц, обследованных анонимно, выявляются определенные особенности (таблица 10). Так, среди детей наибольший объем занимают лица, обследуемые по клиническим показаниям, а среди анонимно обследованных лиц - больные ИППП и группа «Прочие». Структура обследованных подростков более однородна, чем группа детей. Отмечается относительно высокий объем обследования подростков, обследованных по клиническим показаниям (37,9%), из группы «прочие» (36,7%), беременных (14,2%).Анализ эффективности обследования населения Дальневосточного федерального округа в 2013 году в целом показал некоторое ее увеличение по сравнению с 2012 годом (таблица 11).

Так, выявляемость антител к ВИЧ в реакции иммуноблока составила в 2005 году, в среднем, 90,82 на 100 тысяч обследований, в 2006 г. - 92,25, в 2007 г. - 89,76, в 2008 г. - 94,35, в 2009 г. - 101,6, в 2011 г. - 111,4, а в 2013 году аналогичный показатель составил 130,0 на 100 тысяч обследований. Наиболее высокой остается эффективность обследования населения Дальневосточного федерального округа при эпидемиологическом обследовании очагов ВИЧ-инфекции и среди лиц, употребляющих наркотические препараты, - соответственно 8404,7 и 1396,9 на 100 тысяч обследований в 2013 году. При этом эффективность обследования наркопотребителей увеличилась в сравнении с предыдущим годом. Обращает на себя внимание увеличение числа положительных находок при обследованиях в 2013 г. в таких группах, как потребители наркотиков, больные ИППП, лица из мест лишения свободы, медперсонал, работающий с ВИЧ-инфицированными, обследованные при эпидрасследовании и группа «прочие». Снижение эффективности обследования наблюдалось в группе беременных. Таким образом, наибольшая выявляемость антител к ВИЧ наблюдается среди контингентов, занимающих наименьший объем в структуре обследованного населения округа. Напротив, очень низкая эффективность обследования отмечается среди большого числа обследованных доноров, беременных, лиц с клиническими показаниями и лиц из группы «Прочие». В целом по ДВФО процент подтверждения положительного результата ИФА в реакции иммуноблота (таблица 12) составил в 2013 г. 25,1%, что несколько выше, чем в 2012 г. (24,4%).

Заключение

Все должны знать и понимать, что СПИД войдет с нами в XXI век. И для того, чтобы выжить, уменьшить риск заражения и распространения заболевания, как можно больше людей во всех странах должны многое знать о СПИДе - о развитии и клинических проявлениях заболевания, его профилактике и лечении, уходу за больными, психотерапии больных и инфицированных. Каждую минуту в мире не менее 15 человек заражаются вирусом иммунодефицита человека. Одновременно многие из них осознают крушение своей жизни и мрачно вглядываются в неопределенное будущее. Каждую минуту эти несчастные сталкиваются не только с собственным страхом, но и с непониманием со стороны родственников, друзей, коллег по работе. Да и общество начинает относиться к ним не как к обычным людям, а как к больным «СПИДом». ВИЧ-инфекция - это хроническая пожизненная инфекция, поэтому, сегодня необходимо решать две большие проблемы:

- как противостоять распространению вируса иммунодефицита человека;

- как относиться к людям, инфицированным ВИЧ;

Единственный способ противостоять распространению вируса - сделать акцент на профилактику, а единственным реальным средством профилактики как самой ВИЧ-инфекции, так и негативных ее последствий является изменение поведения на безопасное или менее опасное. Просветительной работе, касающейся ВИЧ и СПИДа, должно уделяться особое внимание, особенно работе с молодежью. В США уже требуют, чтобы в школах проводились занятия, посвященные ВИЧ/ СПИДу и занятия эти начинались с детьми 9-11- летнего возраста. Сегодня в средствах массовой информации преобладают сообщения о статистике эпидемии, чаще всего без какого-либо разъяснения, что нагоняет страх среди населения. Читая газету или глядя в телевизор, человек не должен испытывать чувство обреченности. Ведь науке удалось многого добиться. Благодаря глобальным эпидемиологическим исследованиям выяснено, как вирус передается от человека к человеку. К счастью, пути передачи ограничены, следовательно, эти факторы можно контролировать, а значит сдерживать и предотвращать распространение болезни - все зависит главным образом от сознательного поведения человека.

Отношение общества к людям, инфицированным ВИЧ, определяет успех или неудачу борьбы против инфекции на национальном уровне. Безусловно, эти люди должны находиться в обществе, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, они не представляют опасности для окружающих, если только не вступают в половые связи, не сдают кровь или не используют общих с другими игл и шприцев для инъекций. Во-вторых, изолировав ВИЧ-инфицированных от общества, или применив к ним более строгие меры, мы загоним болезнь внутрь и сведем на нет результаты санитарного просвещения. Чем сильнее мы стремимся изолировать ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, тем большей угрозе мы подвергаем общество. И задача российских средств массовой информации придерживаться именно такого подхода.В России разрабатывается проект «Профилактика, диагностика, лечение СПИДа». В мероприятия проекта включены три масштабные образовательные кампании, направленные на все население в целом, и специально - на молодежь, на определенные группы риска: потребителей наркотиков, лиц, оказывающих платные сексуальные услуги, гомосексуальное сообщество. В рамках просветительской работы проект предусматривает проведение рекламных кампаний по пропаганде безопасного секса среди молодежи, создания сетей региональных телефонных линий доверия, которые будут круглосуточно бесплатно предоставлять консультации населению по всем проблемам ВИЧ-инфекции и инфекций, передаваемых половым путем на анонимной основе. Идеологическая суть проекта заключается в том, чтобы путем активных целенаправленных мероприятий постепенно снять нарастающий страх людей перед ВИЧ-инфекцией и внушить им на основе приобретенных знаний трезвое, взвешенное отношение к проблеме в целом и собственному здоровью, прежде всего, это касается всего населения.

Работа с группами риска будет проводиться индивидуально. Сегодня 90% ВИЧ-инфицированных в России - наркопотребители. Это в основном молодые люди, число которых уже превысило три миллиона человек. Совсем недавно сочли бы диким предложение обучить потребителей наркотиков их безопасному введению. Тем не менее, это - одна из реальных возможностей пресечь передачу инфекции в самой большой группе риска. Другой эффективный метод снижения вреда при потреблении наркотиков станет обмен шприцев. С одной стороны это исключает многократный обмен шприцев, а с другой - открывает возможность непосредственно вступить в прямой диалог с людьми из этой группы риска, обменяться с ними информацией об опасности заражения. Такая открытая работа на территории «противника», входя в его доверие, непременно приводит к позитивному результату.

Таким образом, все компоненты проекта, а их количество весьма значительно, дают возможность решать проблему борьбы со СПИДом комплексно. «Заразишься или не заразишься - зависит только от тебя», - таков основной девиз международной профилактической кампании. Только таким путем каждый человек может избежать ВИЧ-инфицирования, сохранить здоровье и жизнь.

Список использованной литературы

1. Голенков А.В. Причины негативного отношения медицинских работников к ВИЧ-инфицированным и пути его преодоления - 2008. -№8. -С. 8-11.

2. Голенков А.В., Андреева С.В. Взаимоотношения среднего медработника с ВИЧ-инфицированными - 2008.- №4.-С. 41-43.

3. Плавинский С.Л., Савина В.А. Нозокомиальная передача гемоконтактных инфекций: Обзор литературы. - М., 2007. - 68 с.

4. В.В. Покровский, Г.М.Кожевникова, О.П. Фролова и др.,Эпидемиологический надзор за ВИЧ-инфекцией в Российской Федерации: Сборник нормативно-правовых актов и методических документов по вопросам диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИДа и сопутствующих заболеваний - М., 2007. - Том II. - 396 с.

5. Н.К. Шарова, А.Г. Букринская, Особенности взаимодействия белков в составе вирионов ВИЧ-1; Вопросы иммунологии, 1990, т.3, №3, с. 202-206.

6. Иванов С.М., “Возможно выделен новый тип вируса иммунодефицита человека - ВИЧ-3”; Вопросы вирусологии, 1990, т.35, №1, с. 82.

7. Л.А. Кожемякин, В.Г. Бондаренко; Нестабильность генома и СПИД. Биохимия, 1992, т. 57, в. 9, с. 1417-1426.

8. В.П. Кузнецов. Система интерферона при ВИЧ-инфекции. Вопросы вирусологии. 1991, т. 36, №2, с. 92-96.

9. Папырин. А.С., Сильнее профилактики пока средства нет, Медицинская газета №62 2011.- 38 с.

10. Бочаров. Е.Ф. О профилактике ВИЧ-инфицированности, Медицинская газета, №4 2012. - 17с.

11. ШевелевА.С., СПИД - загадка века; М.,1991г.

12. Веркин Б.И., ВолянскийЮ.Л.,. Марчук Л.М и др., Синдром приобретенного иммунодефицита. Возможные механизмы взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клетками организма; Харьков, 1988.

13. М. Адлер, Азбука СПИДа; М.: Мир, 1991.

14. Н.К. Шарова, А.Г. Букринская, Особенности взаимодействия белков в составе вирионов ВИЧ-1; Вопросы иммунологии, 1990, т.3, №3, с. 202-206.

15. “Возможно выделен новый тип вируса иммунодефицита человека - ВИЧ-3”; Вопросы вирусологии, 1990, т.35, №1, с. 82.

16. Л.А. Кожемякин, В.Г. Бондаренко; Нестабильность генома и СПИД. Биохимия, 1992, т. 57, в. 9, с. 1417-1426.

17. В.П. Кузнецов. Система интерферона при ВИЧ-инфекции. Вопросы вирусологии. 1991, т. 36, №2, с. 92-96.

18. Т.А. Бектимиров. Вирус иммунного дефицита человека типа 2. Вопросы вирусологии. 1990, т. 35, №3, с. 180-183.

19. М.И. Букринский. Строение генома и экспрессия генов вируса иммунодефицита человека (обзор иностранной литературы). Вопросы вирусологии. 1987, т.32, № 6, с. 649-656.

Приложения

Таблица 4. Охват лечением ВИЧ-инфицированных пациентов ДВФО в 2013 г.

Таблица 5. Охват диспансерным наблюдением ВИЧ-инфицированных Дальневосточного федерального округа в 2013 г.

Таблица 6. Профилактика вертикальной передачи ВИЧ-инфекции в Дальневосточном федеральном округе в 2013 г.

Таблица 7. Определение иммунного статуса и вирусной нагрузки ВИЧ-инфицированным Дальневосточного федерального округа в 2013 г.

Таблица 8. Охват населения Дальневосточного федерального округа тестированием на антитела к ВИЧ в 2013 г.

Таблица 9. Сравнительный анализ структуры обследованного на антитела к ВИЧ населения Дальневосточного федерального округа по кодам контингентов в 2012 и 2013 гг.

Таблица 10. Структура обследованных в 2013 г. на антитела к ВИЧ детей, подростков и лиц, обратившихся анонимно

Таблица 11. Эффективность обследования населения Дальнего Востока в 2012, 2013 г.

Таблица 12. Процент подтверждения положительного результата ИФА в иммуноблоте.

Рис. 2. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)

Размещено на Allbest.ru