Явление люминесценции

14. Флуоресцентная микроскопия

Исследование флуоресценции клеток, окрашенных специальными красителями-флуорохромами или флуоресцирующими антителами к определенным клеточным белкам, резко расширило возможности оптической микроскопии. В отличие от традиционных микроскопов, в которых клетки рассматривались в проходящем свете, во флуоресцентном микроскопе (Рис. 19) возбуждающий ультрафиолетовый или синий свет от ртутной лампы подается на объект через объектив сверху. Через этот же объектив свет флуоресценции попадает в глаза экспериментатора или на фотоприемник. Для того, чтобы вместе с флуоресценцией не проходил намного более интенсивный возбуждающий свет, отраженный от объекта, используют скрещенные светофильтры: пропускающий только ультрафиолетовый или синий свет в канале возбуждения и запирающий светофильтр, не пропускающий коротковолновый возбуждающий свет, в канале регистрации. Запирающий светофильтр может или пропускать весь свет с длиной волны, большей, чем длина волны возбуждающего света (длинноволновый или long-pass светофильтр), или селективно пропускать только свет в заданном узком диапазоне. Последним свойством отличаются интерференционные светофильтры, имеющие полосу пропускания порядка 10-20 нм. Для разделения света с разной длины также используется дихроическое зеркало, отражающее коротковолновый возбуждающий свет, и пропускающее длинноволновый свет флуоресценции.

А

Б

Рис. 19. Флуоресцентный микроскоп. А. современный флуоресцентный микроскоп Observer (K. Zeiss, FRG). Б. Схема флуоресцентного микроскопа. 1 - ртутная лампа, возбуждающая флуоресценцию; 2 - светофильтр возбуждения; 3 - дихроическое зеркало, отражающее коротковолновый возбуждающий свет, и пропускающее длинноволновый свет флуоресценции; 4 - объектив микроскопа; 5 - объект исследования на предметном столике; 6 - запирающий светофильтр; 7 - сферическое зеркало с отверстием; 8 - зеркало; 9 - окуляр; 10 - зеркало; 11 - коллимирующая линза; 12 - лампа накаливания для наблюдения в проходящем свете; 13 - фотоприемник (видеокамера, цифровая фотокамера, фотоаппарат или фотоумножитель)

Обычная световая микроскопия, основанная на поглощении света, не свободна от недостатков:

o оптическое разрешение менее половины длины световой волны:

d = 0,61/NA=0,61/n sin ,

где NA= n sin - числовая апертура, n - показатель преломления среды, - угол раскрытия, т.е. максимальный угол, под которым лучи от объекта могут попасть в объектив;

o невысокий контраст: кроме изучаемой, видны окружающие структуры;

o высокие требования к системе освещения и ее настройке;

o различные аберрации и т.д.

Флуоресцентная микроскопия свободна от многих этих недостатков:

• видны только флуоресцирующие структуры на темном фоне;

• разрешение не ограничено;

• система освещения не участвует в построении изображения;

• отсутствуют хроматические аберрации.

Однако, флуоресцентное изображение не очень четкое, так как к флуоресценции каждого элемента объекта добавляется рассеянное флуоресцентное излучение других элементов, лежащих вне фокальной плоскости.

15. Лазерная сканирующая конфокальная и мультифотонная микроскопия

В 1957 году М. Мински запатентовал принцип конфокального микроскопа, в котором ход лучей при рассматривании точечного объекта в канале наблюдения совпадает с ходом лучей возбуждающего света и имеет общий фокус. Это позволяет исключить флуоресцирующие элементы, находящиеся вне плоскости фокуса. Внефокусные лучи снижают контраст и четкость изображения. В современном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе (Рис. 20) используются лазеры, дающие параллельный монохроматический луч, который можно сфокусировать объективом в плоскости препарата до диаметра порядка половины длины волны, т.е. до 1 мкм и менее в соответствии с дифракционными ограничениями (теоретически до /2). Микронный объем, в котором возбуждается флуоресценция, называется вокселем. Если в плоскость промежуточного изображения ввести диафрагму (pinhole) с диаметром, соответствующим диаметру изображения этого вокселя, то она будет пропускать только лучи, исходящие из освещаемого объема, но не лучи, из точек, лежащих выше или ниже фокальной плоскости (Рис. 20). Сканирование лучом в плоскости фокусировки и «собирание» точечных изображений компьютером дает полное изображение объекта в «оптическом срезе» клетки толщиной всего около 1 микрометра. Поскольку рассеянная флуоресценция выше- и нижележащих слоев объекта не регистрируется, то изображение получается очень четким. Перемещение объекта по вертикальной оси Z позволяет получить стопку оптических срезов, по которым с помощью компьютера можно восстановить четкое трехмерное изображение объекта. Более того, это изображение можно поворачивать и рассматривать с разных сторон и под разными углами, что недостижимо в обычной оптической микроскопии.

Использование нескольких лазеров позволяет одновременно регистрировать флуоресценцию от нескольких флуорохромов, селективно окрашивающих разные клеточные структуры. Наложение этих изображений дает многоцветное изображение клетки, где разные цвета показывают геометрию различных клеточных компонентов (Рис. 21). Таким образом, использование конфокальности позволяет повысить четкость изображения, а сканирование и компьютерная реконструкция позволяют получить трехмерное изображение образца.



Рис. 20. Схема конфокального микроскопа. Через диафрагму (pinhole) на фотоумножитель проходят только лучи, исходящие из точки фокусировки лазерного луча (синие), но не лучи из точек, лежащих выше или ниже плоскости фокусировки (красные) (по: Л.П. Незлин. Leica Microsystems)

Рис. 21. Построение многоцветного изображения клеток

Дальнейшим развитием сканирующей микроскопии явилась разработка мультифотонных микроскопов. Они основаны на эффекте двух- или трехфотонного возбуждения молекул. Например, двухфотонное поглощение квантов с длиной волны 800 нм соответствует по энергии поглощению квантов света с удвоенной энергией, т.е. с длиной волны порядка 400 нм. Поэтому воздействуя на объект инфракрасным светом, можно получить такой же эффект, как и при действии фиолетового или ультрафиолетового излучения.

Рис. 22. Возникновение двухфотонного эффекта при фокусировке луча только в малой области вблизи фокальной плоскости, где интенсивность излучения превышает пороговую. Однофотонное возбуждение происходит по всему ходу луча - в фокусе и за его пределами

Двух- или трехфотонное поглощение происходит только при очень больших интенсивностях света. Это достигается при очень малой длительности импульса. Для мультифотонной микроскопии используются импульсно-периодические лазеры, генерирующие импульсы длительностью 10^-13 с высокой частотой (порядка 100 МГц). При этом энергия импульса и средняя мощность излучения обычно невелики, сравнимы с таковыми при однофотонном возбуждении. Другой фактор, повышающий интенсивность облучения - фокусировка луча в маленькое пятно микронных размеров. При этом интенсивность превышает пороговую, требуемую для двухфотонного возбуждения только в малой области вблизи фокуса луча (Рис. 22). Эта область начинает флуоресцировать, как если бы ее облучали коротковолновым синим или ультрафиолетовым светом. Ее размер по высоте вдоль оси Z заметно меньше, чем при однофотонном возбуждении в конфокальном микроскопе. Поэтому конфокальная диафрагма не требуется, а при сканировании получается еще более тонкий «оптический срез» и более четкая картина.

Хотя в сканирующем мультифотонном микроскопе не используется конфокальный эффект, он конструктивно не отличается от сканирующего конфокального микроскопа за исключением инфракрасного лазерного блока. Используемое в нем инфракрасное излучение слабо поглощается тканями и клетками и практически не повреждает их, поэтому его лучше применять для исследования живых клеток. Оно глубоко проникает в ткани, что позволяет изучать толстые срезы биологических тканей и даже проводить опыты на живых органах in situ. Инфракрасное излучение не вызывает выцветание красителей, что позволяет дольше изучать флуоресценцию и является еще одним преимуществом мультифотонной микроскопии.

16. Флуоресцентные зонды

Сильная зависимость флуоресценции от микроокружения флуоресцирующих молекул лежит в основе метода флуоресцентных зондов. Флуоресцентные зонды слабо флуоресцируют в воде, но их флуоресценция резко усиливается при изменении определенных физико-химических свойств микроокружения или при связывании с определенными веществами - ионами или молекулами. Это позволяет охарактеризовать микросреду вокруг молекулы флуорофора, оценить ее параметра и визуализировать молекулы, особенно сильно влияющие на флуоресценцию зонда. Этот интенсивно развивающийся метод стал одним из мощнейших инструментов изучения биомолекул и клеток и получил широкое распространение в последние годы.

Потенциометрические зонды

Некоторые красители, такие как 1-анилинонафталин-8-сульфонат (ANS, Рис. 23) очень чувствительны к полярности их микроокружения. Квантовый выход флуоресценции ANS в воде равен 0,004, а в липидном слое мембраны - 0,29, на два порядка выше. Длительность его флуоресценции также возрастает от 0,55 в воде до 7,0 нс в мембране. Поэтому ANS является чувствительным индикатором на присутствие гидрофобной фазы. Он выявляет присутствие гидрофобных полостей в белковых глобулах, конформационные изменения белков, их сворачивание в глобулы. ANS также широко используется для исследования мембран. Например, ковалентно пришивая к молекуле ANS гидрофобные «хвостики» разной длины, внедряющиеся в липидный слой, можно погрузить зонд на определенную глубину в мембрану и по изменению ее флуоресценции зондировать свойства мембраны на разной глубине.

2-аминонафталин-6-сульфонат (ANS)
Производное аминонафтилэтенилпиридина (di-4-ANEPPS) Раздел 1.01
Тетраметилродамин, метиловый эфир (TMRM) Раздел 1.02

Рис. 23 Примеры потенциометрических флуоресцентных зондов



Рис. 24. Регистрация потенциала действия в мышечной клетке сердца кролика с помощью флуоресцентного потенциометрического зонда di-4-ANEPPS. _возб 488 нм. (А). Регистрация флуоресценции двумя фотоумножителями на 540 (зеленый сигнал) и >610 нм (красный сигнал). (В). Отношение зеленого и красного сигналов лучше отображает изменения мембранного потенциала, чем измерения в каждом канале по-отдельности. На (С) для сравнения представлен потенциал действия, зарегистрированный с помощью микроэлектрода

Поскольку молекула ANS содержит отрицательно заряженную группу SO3-, то она чувствительна к электрическому полю, в частности к поверхностному потенциалу клеток или к трансмембранному потенциалу. При добавлении ANS в наружную среду его молекулы встраиваются в клеточную мембрану так, что анионная группа остается снаружи. Так как поверхность клетки заряжена отрицательно, то зонд погружается в мембрану на некоторую глубину и начинает флуоресцировать. При генерации потенциалов действия изменяется мембранный потенциал клетки, и это модулирует флуоресценцию ANS. Это позволяет оптически оценивать изменения мембранного потенциала клеток и даже регистрировать потенциалы действия в возбудимых клетках. На Рис. 24 приведен пример регистрации потенциала действия в мышечной клетке сердца кролика с помощью флуоресцентного потенциометрического зонда di-4-ANEPPS.

Таблица 2. Области применения потенциометрических флуоресцентных зондов, разработанных компанией Molecular Probes

Зонды	Области применения
Di-4 - ANEPPS Di-8-ANEPPS Di-2-ANEPEQ Di-8-ANEPPQ Di-12-ANEPPQ	Картирование пространственного распределения мембранных потенциалов в нервных и мышечных клетках; комбинированные потенциометрические оптические и электрофизиологические измерения, измерения уровня Са2+; визуализация биоэлектрической активности сердечных мышц
RH 237, RH 414 RH 421, RH 795	Трассировка нейронных отростков; Оценка активности синапсов и ионных каналов
RH 155	Измерение мембранных потенциалов в разных клетках; измерение активности потеницалзависимых Ca2+ каналов
DiOC5(3) DiOC6(3) DiSC3(5)	Измерение мембранных потенциалов в различных клетках; визуализация Ca2+ каналов; оценка активности митохондрий
JC-1 JC-9	Оценка активности митохондрий, апоптотической деполяризации митохондрий, митохондриальной регуляции уровня Са2+ в клетке
TMRM, Родамин 123	Измерения мембранного потенциала митохондрий, активации высокопроницаемых митохондриальных пор, регуляции уровня Са2+ в клетке митохондриями
DiBAC4(3) DiBAC4(5) DiSBAC2(3)	Комбинированные измерения мембранного потенциала и уровня Са2+ в клетке. Оценка активации АТФ-чувствительных К+-каналов
Мероцианин 540	Измерения мембранного потенциала митохондрий Оценка строения поверхности мембраны и липидной асимметрии мембран

В последние годы для этой цели разработан ряд более совершенных потенциометрических флуорохромов, позволяющих изучать распределение потенциалов в пределах одной клетки с пространственным разрешением, недостижимым для микроэлектродной техники. С помощью флуоресцентных зондов удалось зарегистрировать мембранные потенциалы маленьких клеток, в которые невозможно ввести микроэлектроды, например, в бактерий, и даже внутриклеточных органелл. Применение флуоресцентных зондов позволило экспериментально доказать, что при переносе протонов через внутреннюю мембрану митохондрии ее матрикс становится отрицательно заряженным относительно цитозоля, и измерить трансмембранную разность потенциалов. Для нейрофизиологии особенно интересна возможность одновременной оптической регистрации импульсной активности десятков нейронов. В таблице 2 приведены примеры различных областей применения потенциометрических флуоресцентных зондов.

Другое использование флуоресцентных зондов - визуализация различных внутриклеточных компонентов, с которыми они специфически связываются, и в ряде случаев измерение их концентраций. В настоящее время разработано множество флуоресцентных зондов на:

- различные биохимические компоненты клеток: нуклеиновые кислоты, липиды, различные белки и субстраты разных ферментов, активные формы кислорода, pH, различные ионы и т.д.;

- структурные элементы клеток: цитоскелет, хроматин, ионные каналы, рецепторы, клеточные органеллы - митохондрии, эндоплазматический ретикулум, лизосомы;

- клеточные функции: эндоцитоз, пролиферацию, сигнальную трансдукцию, окислительный стресс, апоптоз и т.д.

Рассмотрим несколько примеров.

Ca²⁺-чувствительные флуорохромы

Одним из важнейших достижений последних лет является использование флуоресцентных зондов Fura-2, Fluo-3 и других для измерения уровня ионов кальция в клетках, позволившее изучить пути регуляции уровня Ca²⁺ в клетках. Ca²⁺ - важнейший регулятор многочисленных клеточных процессов. Он контролирует функциональную активность клеток и процессы, ведущие к их смерти. Разработка флуоресцентных зондов позволила изучить роль Ca²⁺ в этих процессах. При этом были открыты новые явления: кальциевые волны, кальциевые спайки и др. Ca²⁺ зонды бывают двух типов: у одних, например, принадлежащих семейству Fura, к ионам кальция особенно чувствителен спектр возбуждения (Рис. 25А), а у других, например, принадлежащих к семейству Fluo, - спектр флуоресценции (Рис. 25Б). В первом случае, регистрируя флуоресценцию на длине волны 510 нм, определяют соотношение сигналов при возбуждении на длинах волн 340 и 380 нм, где зависимость от концентрации Ca²⁺ особенно выражена (Рис. 25А). Это надежный и чувствительный метод, но необходимость возбуждения флуоресценции на двух длинах волн в ультрафиолетовом диапазоне существенно усложняет его. Проще проводить измерения в видимом диапазоне на одной длине волны около 515 нм, что возможно при использовании красителей семейства Fluo (Рис. 35Б).

Красители Fluo отличаются большей фотостабильностью, поскольку синий свет (470 нм), используемый для возбуждения их флуоресценции не так сильно повреждает молекулы флуорохрома, как ультрафиолетовый свет, используемый для возбуждения флуоресценции Fura. Они отличаются повышенной яркостью флуоресценции, возбуждаемой видимым светом. Они хороши для оценки относительных изменений уровня Са²⁺ в клетке. Но точность измерений абсолютной концентрации у них ниже, чем у ратиометрических флуорохромов семейства Fura.



Рис. 25. Спектральные характеристики кальциевых флуоресцентных зондов. (А). Спектры возбуждения Fura2 (регистрация флуоресценции на длине волны 510 нм), (Б). Спектры флуоресценции Fluo-5N при разных концентрациях Ca²⁺ (длина волны возбуждающего света 470 нм)

FISH: анализ хромосом

Важным примером применения флуоресцентных зондов является разработка способов визуализации распределения ДНК в хромосомах и интерфазном клеточном ядре. С помощью различных красителей в хромосомах были выявлены устойчивые области с повышенной или пониженной плотностью хроматина, проявляющиеся в виде поперечных полос. Их распределение оказалось специфичным для разных хромосом. Оно было связано с распределением отдельных генов на хромосомах. Это позволило идентифицировать отдельные хромосомы и выявить некоторые патологические изменения в них.

Разработка метода многоцветного FISH анализа (fluorescence in situ hybridization) в 1990-х годах в сочетании с конфокальной микроскопией значительно расширила возможности изучения структуры и функций хромосом. В этом случае хромосомы окрашиваются несколькими флуорохромами, каждый из которых специфичен к определенным фрагментам ДНК, например, богатым А-Т или Г-Ц парами, связывается с малой бороздкой и т.д. Эта специфичность не очень высока, но совокупный анализ флуоресцентной картины для всех флуорохромов позволяет довольно точно идентифицировать различные хромосомы, присвоив каждой с помощью компьютерных методов определенный псевдоцвет, и даже разделить каждую хромосому на характерные полосы (Рис. 26 и 27). В качестве флуорохромов часто используют DAPI, FITC, Cy3, Cy5, красители ряда Alexa, Texas Red и некоторые другие (Табл.3). В настоящее время чаще используется семицветный FISH анализ. Для более точной регистрации флуоресценции разных флуорохромов и снижения перекрытия их полос, применяются узкополосные интерференционные фильтры.

Рис. 26. Пятая хромосома человека, раскрашенная псевдоцветами на 22 полосы методом FISH с использованием шести флуорохромов (По Рубцову и Карамышевой, 2000)

Таблица Примеры флуорохромов, используемых в FISH анализе

Лазерные линии, нм	Светофильтры	Флуорохромы	Альтернативные варианты
405	410-480	DAPI	Alexa 350
488	495-540	FITC	Alexa 488
561	566-586	Cy5	TAMRA, Alexa 555
594	600-625	Texas Red	Cy5
633	655-800	Cy5	Alexa 633



Рис. 27. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для идентификации хромосом как в митотических (Б), так и интерфазных клетках (В и Г). На схеме (А) показаны псевдоцвета, присваиваемые различным комбинациям из 7 флуорохромов, позволяющие различить разные хромосомы (Б). Срез на (Г) проходит через середину ядра, а на (В) - на 2 мкм выше. Многоцветная флуоресценция ядер (В и Г, слева) дает довольно нечеткую картину, но с помощью конфокальной микроскопии и компьютерной обработки изображений можно четко локализовать различные хромосомы в интерфазном ядре (Адаптировано из J. Walter et al. //Cytogenet. Genome Res., 2006, Vol. 114, P. 367-378)

Применение FISH в сочетании с конфокальной микроскопией и трехмерной реконструкцией изображений анализа позволило ответить на вопрос: что происходит с хромосомами после деления клетки? Оказывается, ДНК каждой хромосомы после деконденсации занимает определенное место в ядре (Рис. 27C и D, справа).

17. Зеленый флуоресцирующий белок (GFP)

Важным достижением последних лет было открытие в 1994 году так называемого зеленого флуоресцирующего белка GFP (green fluorescing protein) - природного флуорофора с очень яркой флуоресценцией. Этот белок из 238 аминокислот с общей молекулярной массой 27 кДа придает свечение тихоокеанской медузе Aequorea victoria. Его интенсивная зеленая флуоресценция возбуждается синим светом. В организме медузы белок GFP находится в комплексе с белком экворином (22кДа), излучающим синий свет (465 нм) при связывании ионов кальция и поэтому служащим Са²⁺-сенсором. Появление Cа²⁺ во флуоресцирующих клетках медузы вызывает синюю биолюминесценцию экворина, которая возбуждает зеленую флуоресценцию GFP.

Уникальной особенностью GFP является то, что его флуорофорная группа не является отдельным химическим соединением наподобие простетических групп в некоторых белках, а представляет собой короткую последовательность из трех аминокислот: серин-тирозин-глицин, которая закодирована генетически. В течение несколькие часов после синтеза этого белка она самопроизвольно, автокаталитически принимает циклическую форму (Рис. 38А), и после окисления тирозина приобретает способность интенсивно флуоресцировать. GFP имеет два максимума возбуждения флуоресценции лежит около 395 и 475 нм и максимум флуоресценции при 508 нм (Рис. 28А).

Флуорофорная группа в GFP окружена «бочонком» из 11 -структурных полипептидных цепей, защищающих ее от окружающей среды (Рис. 29). Флуоресценция GFP устойчива к нагреванию до 65 ^оС, обработке кислотами и щелочами, действию протеиназ и других повреждающих факторов. Белок GFP совершенно не токсичен и устойчив к фотообесцвечиванию, что позволяет проводить длительные исследования клеточной динамики.



Рис. 28. Спектральные характеристики (А) и внутриклеточное перераспределение GFP (Б)

Рис. 29. Структура зеленого флуоресцентного белка GFP. Хромофорная группа обозначена желтым цветом (по: Незлин Л.П., Leics Microsystems)

Недостаток GFP - флуоресценция в зеленой области, где некоторые клетки обладают заметной аутофлуоресценцией, скрывающей полезный сигнал. Поэтому с помощью методов направленного мутагенеза и генной инженерии были получены различные варианты белков флуоресцирующих в разных спектральных областях от синей до красной (Рис. 30). Красный флуоресцирующий белов был также выделен из кораллов.



Рис. 30. Различные формы флуоресцентных белков, флуоресцирующих в разных спектральных диапазонах от синего до красного

Встроив ген GFP в геном различных организмов, можно по его флуоресценции изучать локализацию белков в клетках, их динамику, взаимодействия между молекулами белка, репликацию и реорганизацию хромосом, активность промоторов и экспрессию разных генов и т.п. Особенно интересна возможность визуализации различных белков в клетках. Для этого с помощью методов молекулярной биологии осуществляют слияние интересующего белка с GFP. С этой целью в клетку вводят специально сконструированный отрезок ДНК, в котором последовательно соединены гены интересующего исследователей белка и GFP. Они контролируются общим промотором, транскрипция этого комплексного гена приводит к синтезу химерного белка, содержащего как интересующий белок, так и GFP. Во многих случаях присоединение GFP не нарушает функционирование белков, а белок не влияет на флуоресценцию GFP. По флуоресценции последнего можно проследить динамику внутриклеточных перемещений интересующего исследователей белка и его локализацию. К GFP можно присоединить сигнальные пептиды, направляющие белки в разные органеллы, а затем по флуоресценции определить расположение и перестройки этих органелл и даже клеток. Например, химерный белок, содержащий GFP и NMDA-рецептор, очень важный ионный канал, встроенный в плазматическую мембрану некоторых нейронов, позволяет визуализировать эти каналы, выявить их экспрессию и оценить распределение в разных частях нейронов и перераспределение при изменении функционального состояния клетки или при внешних воздействиях.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 31. Нейроны коры головного мозга мыши, экспрессирующие GFP (Препараты: J. Herms, M. Fuhrmann. University of Munich)

В качестве яркого примера использования GFP можно привести данные о морфологии нейронов коры головного мозга мышей, которую трудно проследить с помощью обычных гистологических методов из-за малой толщины дистальных частей аксонов и дендритов и их сложного переплетения. Используя метод мультифотонной флуоресцентной микроскопии, позволяющей изучать трехмерную структуру толстых образцов (несколько десятков микрометров), удалось визуализировать морфологию нейронов коры мозга мышей. Для этого получили комплекс GFP с белком MAP (microtubule-associated protein), который соединяется с микротрубочками. Так как в нервной клетке и особенно в ее отростках очень много белка тубулина, из которого состоят микротрубочки, то то и синтезированный клетками белок GFP распределился по цитоплазме и отросткам нейронов (Рис. 31).

Рис. 32. Перераспределение комплекса протеинкиназы С с YFP в сердечной клетке из цитоплазмы (А) к плазматической мембране (Б) после активации форболовым эфиром PMA, имитирующей естественную активацию диацилглицеролом (По данным L. Kaestner, 2008)

Другой пример, показывающий возможность в режиме on-line следить за локализацией определенных белков в клетках и их перемещениях при изменении функционального состояния клетки или ее реакции на внешнее воздействие, приведен на Рис. 32. На нем показано, что при активации форболовым эфиром PMA один из ключевых сигнальных белков протеинкиназа С, исходно локализующийся в цитоплазме, быстро перераспределяется к плазматической мембране, где он дополнительно активируется мембранными липидами.

Флуоресцирующие белки также эффективно используются при анализе внутримолекулярных конформационных превращений в белках и межмолекулярных белковых взаимодействий с помощью метода FRET (Рис. 33). В первом случае перенос энергии от, например, голубого флуоресцентного белка CFP к желтому YFP, присоединенных к разным концам белковой молекулы, и соответственно, появление флуоресценции с длиной волны 525 нм вместо 475 нм происходит в результате связывания лиганда (субстрата), конформационного превращения белка и сближения флуорофорных групп (Рис. 33А). Во втором - соответствующий перенос энергии происходит в результате образования надмолекулярного комплекса и, опять же, сближения флуорофоров (Рис. 33Б).

Рис. 3 Использование голубого (CFP) и желтого (YFP) флуоресцентных белков для оценки внутримолекулярных (А) и межмолекулярных взаимодействий (Б) белков, инициированных связыванием лиганда (красный треугольник)

За открытие GFP и разработку методов его использования О. Симомуре, М. Чалфи и Р. Тсиену в 2008 г. была присуждена Нобелевская премия.

18. Иммуно-флуоресцентная микроскопия

Для визуализации различных компонент клеток широко применяют иммуно-флуоресцентную микроскопию. При этом различают прямой и непрямой методы. В первом случае в клетку вводят антитела против изучаемых молекул-мишеней (антигенов), меченые ярко флуоресцирующими молекулами. Чаще всего ими служат уже упомянутые фотостабильные красители с высоким квантовым выходом флуоресценции (Табл.3). FITC, Cy3, Cy5, разновидности Alexa и другие. Но если молекул антигенов в клетке мало, а это как раз характерно для сигнальных белков, управляющих многими клеточными процессами, то их флуоресценция слаба. Поэтому используется непрямой метод, в котором после связывания первичных нефлуорохромированных антител добавляют вторичные антитела, выработанные против первичных антител с которыми ковалентно связано большое количество флуорохрома (Рис. 34).

Рис. 34. Принцип непрямой флуоресцентной микроскопии. 1 - антиген; 2 - первичное антитело; 3 - вторичное антитела, 4 - флуоресцентная метка

В настоящее время имеется широкий набор антител к самым разным клеточным белкам, что позволяет «увидеть» их экспрессию в клетках, локализацию и перемещения в процессе функционирования клеток. Это делает иммуно-флуоресцентную микроскопию одним из самых мощных методов современной клеточной биологии. В качестве примера на Рис. 34 приведено распределение микротрубочек, выявленных антителами к -тубулину, флуорохромированных с помощью красителя Cy5.

Рис. 34. Непрямая флуоресценция микротрубочек в клетках рака мозга человека (глиобластома D54Mg), окрашенных с помощью антитубулина и вторичного антитела, конъюгированного с флуорохромом Cy5



Рис. 35. Конфокальная микроскопия цитоскелета в смешанной популяции культивируемых нейронов (сверху) и глиальных клеток (снизу). Красная флуоресценция актинового цитоскелета обусловлена фаллоидином, связанным с флуорохромом Texas Red. Микротрубочки помечены анти-Я-тубулином и вторичным антителом с присоединенным флуорохромом Alexa Fluor 488, придающим им зеленую флуоресценцию. (по: J. Zmuda; Invitrogen)

Флуорохромирование клеток антителами к разным белкам с флуоресцентными метками разного цвета и различными флуоресцентными зондами расширяет возможности визуализации внутриклеточных структур и позволяет одновременно следить за локализацией и перераспределением различных внутриклеточных структур (Рис. 21 и 35)

19. Фосфоресценция

Фосфоресценция - испускание фотонов при переходе электрона с нижнего возбужденного триплетного уровня Т₁ на основной синглетный уровень S₀: T₁>S₀. Поскольку такие переходы с изменением спина электрона запрещены правилами отбора, то вероятность их низка. Отсюда высокое время жизни триплетных состояний: порядка 10^-6 - 10⁺² с. Такие состояния являются метастабильными. Соответственно, кинетика фосфоресценции на несколько порядков медленнее кинетики флуоресценции. Так как фотохимические реакции происходят только в электронно-возбужденном состоянии, то триплетные состояния с намного большим временем жизни, чем синглетные, отличаются значительно большей химической активностью. Другое отличие фосфоресценции от флуоресценции - длинноволновой спектральный сдвиг вследствие некоторой потери энергии фотонов. При этом спектры возбуждения флуоресценции и фосфоресценции одинаковы. Кроме того, фосфоресцентное излучение слабее флуоресцентного из-за низкой вероятности интеркомбинационной конверсии и высоких безизлучательных потерь энергии в течение длительного существования молекулы в триплетном состоянии. Поэтому фосфоресценция лучше регистрируется при низких температурах или в очень вязкой среде, где подвижность молекул ограничена и ниже вероятность безизлучательной дезактивации возбужденных состояний при столкновениях молекул. Другой фактор, снижающий интенсивность фосфоресценции, - тушение в течение длительного триплетного состояния путем передачи энергии другим молекулам (см. ниже). Очень эффективным тушителем фосфоресценции при комнатных температурах является кислород.

Обнаружить молекулы в триплетном состоянии можно путем регистрации фосфоресценции или сигналов электронного парамагнитного резонанса от бирадикальных триплетных молекул. Косвенным указанием на участие триплетных состояний в том или ином фотобиологическом процессе является зависимость последнего от присутствия кислорода в системе, так как молекулярный кислород, являющийся естественным бирадикалом, имеющим два неспаренных электрона, эффективно тушит триплетные состояния других молекул и ингибирует связанные с ними процессы.



Рис. 36. Схема фосфороскопа

Для выделения фосфоресценции из общего люминесцентного излучения пользуются фосфороскопом - прибором, создающим задержку между импульсом возбуждающего света и моментом регистрации фосфоресценции (Рис. 36). В нем вращающийся диск или цилиндр с одной или несколькими прорезями перекрывает пути возбуждающего света, и излученного света. Они открываются последовательно на короткое время, зависящее от ширины прорези: сначала путь возбуждающего света, а затем с задержкой, зависящей от скорости вращения и ширины щели, - путь излученного света на фотоприемник (ФЭУ). Меняя эти параметры, можно создать задержку, превышающую длительность флуоресценции, и регистрировать только фосфоресценцию. Время затухания фосфоресценции намного больше времени затухания флуоресценции и его измерить намного легче. С помощью фосфороскопа можно измерять спектры фосфоресценции при комнатной температуре даже при низкой интенсивности излучения.

Изучение фосфоресценции позволяет охарактеризовать триплетные состояния молекул. В некоторых случаях, когда флуоресценция молекул слаба, по фосфоресценции можно их обнаруживать и изучать их фотохимические свойства. Хорошим примером этого является регистрация синглетного кислорода по его фосфоресценции. Это было непростой задачей вследствие слабой фосфоресценции ¹О₂ и излучения в инфракрасной области (1270 нм), где требовалась специальная оптика. С помощью фосфороскопа создавалась задержка более 200 мкс, надежно отсекавшая как импульс возбуждающего света, так и флуоресценцию. В другом варианте экспериментальной установки использовался не фосфороскоп, а фазовая модуляция возбуждающего света, наподобие описанной в п. 3 и изображенной на Рис. 6. В современных установках для возбуждения люминесценции используются импульсные лазеры, дающие интенсивные и кратковременные световые импульсы длительностью порядка нано- и пикосекунд. Регистрация кинетических параметров фосфоресценции синглетного кислорода показала, что его время жизни в воде составляет около 3 мкс, а в неполярных органических растворителях (бензол) - около 30 мкс. Квантовый выход фосфоресценции ¹О₂ в водной среде был всего 10^-7 (А.А. Красновский, 2007).

Литература

1. Ремизов А.Н.: Медицинская и биологическая физика. - М.: Дрофа, 2005

2. Самарский А.А.: Математическое моделирование: Идеи. Методы. Примеры. - М.: Физматлит, 2005

3. Трубецков Д.И.: Введение в теорию самоорганизации открытых систем. - М.: Физматлит, 2005

4. Чалисова Н.И.: Нейроиммуноэндокринные механизмы действия пептидов и аминокислот в тканевых структурах. - СПб.: ДЕАН, 2005

5. Антонов В.Ф.: Физика и биофизика. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004

6. Жижин Г.В.: Саморегулируемые волны химических реакций и биологических популяций. - СПб.: Наука, 2004

7. Кудряшов Ю.Б.: Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). - М.: ФИЗМАТЛИТ, 2011

8. Липунова Е.А.: Система красной крови. - Белгород: БелГУ, 2009

9. МО РФ, БелГУ, каф. медико-биологических дисциплин; Сост. А.Г. Логвиненко: Программа промежуточной аттестации студентов по дисциплине «Физика». - Белгород: БелГУ, 2008

10. МО РФ, БелГУ, каф. медико-биологических дисциплин; Сост. А.Г. Логвиненко: Учебная программа дисциплины «Физика». - Белгород: БелГУ, 2004

11. Под ред.: Ю.И. Афанасьева, С.Л. Кузнецова, Н.А. Юриной; Рец.: Д.И. Медведев, Т.К. Дубовая: Гистология, цитология и эмбриология. - М.: Медицина, 2010

12. Ремизов А.Н.: Медицинская и биологическая физика. - М.: Дрофа, 2004

13. Харьковский национальный ун-т им. В.Н. Каразина; Сост.: Н.И. Буланкина, П.А. Калиман, А.Ф. Коченков, С.М. Куделко; Науч. ред.: В.А. Бондаренко, С.И. Посохов; Рец. И.И. Залюбовский: Академик Иван Николаевич Буланкин. - Харьков: Автоэнергия, 2004

14. А.М. Черныш и др; Под ред. В.Ф. Антонова; Рец.: Каф. биофизики биологического фак. МГУ им. М.В. Ломоносова и др.: Биофизика. - М.: ВЛАДОС, 2013

15. А.М. Черныш и др.; Под ред. В.Ф. Антонова; Рец.: Каф. биофизики биологического фак. МГУ им. М.В. Ломоносова и др.: Биофизика. - М.: Владос, 2013

16. А.Х. Тамбиев, Н.Н. Кирикова, О.В. Бецкий, Ю.В. Гуляев и др.; Под ред. Ю.В. Гуяева, А.Х. Тамбиева; Рец.: А.А. Красновский, А.Г. Шеин: Миллиметровые волны и фотосинтезирующие организмы. - М.: Радиотехника, 2003

17. МО РФ; БелГУ, каф. анатомии и физиологии человека и животных; Сост. С.Д. Чернявских: Программа промежуточной аттестации студентов по дисциплине «Физиология человека и животных». - Белгород: БелГУ, 2003

18. МО РФ; БелГУ, каф. анатомии и физиологии человека и животных; Сост. С.Д. Чернявских: Учебная программа дисциплины «Физиология человека и животных». - Белгород: БелГУ, 2013

19. Под ред. Ю.А. Ершова; Рец. Н.Е. Кузьменко: Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. - М.: Высшая школа, 2003

20. Ремизов А.Н.: Медицинская и биологическая физика. - М.: Дрофа, 2003

21. Ризниченко Г.Ю.: Математические модели в биофизике и экологии. - М.; Ижевск: Институт компьютерных исследований, 2013

22. БелГУ; Сост.: Г.И. Ткаченко, А.И. Никитин; Рец. Е.А. Антонов: Концепции современного естествознания. - Белгород: БелГУ, 2002

23. Блохина М.Е.: Руководство к лабораторным работам по медицинской и биологической физике. - М.: Дрофа, 2002

24. Блохина М.Е.: Руководство к лабораторным работам по медицинской и биологической физике. - М.: Дрофа, 2012

25. Под ред. Ю.А. Ершова: Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. - М.: Высшая школа, 2002

26. Фролов Ю.П.: Управление биологическими системами: надорганизменный уровень. - Самара: Самарский университет, 2012

27. Блохина М.Е.: Руководство к лабораторным работам по медицинской и биологической физике. - М.: Дрофа, 2001

28. В.Ф. Антонов, А.М. Черныш, В.И. Пасечник и др.: Практикум по биофизике. - М.: ВЛАДОС, 2006

29. Лахно В.Д.: Кластеры в физике, химии, биологии. - М.; Ижевск: Регулярная и хаотическая динамика, 2011

30. Мохан Р.: Биохимия мышечной деятельности и физической тренировки. - Киев: Олимпийская литература, 2011

Размещено на Allbest.ru