Классическая чума свиней. Особенности проявления и специфическая профилактика

Существуют рекомбинантные вакцины, полученные на основе вирусов осповакцины и псевдобешенства, но до настоящего времени применение их ограничено.

В настоящее время для повышения иммунного ответа широкое применение получили иммуностимуляторы, которые усиливают иммунный ответ и в ряде случаев снижают реактогенность, способствуя тем самым развитию более напряженного иммунитета. Установлено, что иммунизация свиней против КЧС совместно с натрием тиосульфатом значительно активизирует иммуноморфогенез у животных, что проявляется увеличением в периферических органах иммунной системы в 1,5-2,5 раза количества плазматических клеток и в 1,5 раза специфических антител в сыворотке крови. Титры специфических АТ у всех вакцинированных с натрием тиосульфатом животных достигали максимума через 3 месяца после вакцинации (80±10,13), против 56±8,67 у животных иммунизированных без него [14].

В ВНИИВВиМ разработаны: порошковидная вакцина для энтерального применения из штамма "ЛК-К", предназначенная для вакцинации диких и домашних свиней с активностью 3,0-3,8 lg БОЕ_50/0,1мл; сухая культуральная вирусвакцина против КЧС из штамма "ЛК-К" для аэрозольной вакцинации.

При скармливании диким кабанам (1300 голов) смеси, состоящей из 2 кг зерна и 18 г вакцины в расчете на одно животное дважды с интервалом в 3 дня, через месяц у исследованных животных наступал напряженный иммунитет у 69%, а через 3 месяца у 80--90% с титром ВНА 1:8, который сохранялся на удовлетворительном уровне не менее 3 месяцев, т. о. по эффективности пероральный метод не уступал парентеральному.

Групповые методы иммунизации - аэрозольный и пероральный, имеют ряд преимуществ перед внутримышечным: высокая производительность труда, физиологический путь введения, низкая реактогенность вакцин, быстрота наступления иммунитета. Недостатком этих методов является большой расход вакцин и поэтому в последние годы они используются очень редко.

В ВНИИВВиМ разработан и испытан с положительным эффектом способ пероральной вакцинации новорожденных поросят против КЧС.

В виду того, что поросята рождаются от иммунной свиноматки абсолютно интактными, практически стерильными и иммунологически компетентными так как ни один класс AT, циркулирующих в организме свиноматки, не передается плоду в силу строения плаценты (синдесмохориальный), обязательным условием является вакцинация тотчас после рождения до контакта с инфицированной средой и до одного приема молозива. Поросят допускают к соскам матки не ранее, чем через 30 мин после вакцинации последнего поросенка. Вакцинировать подсосных поросят, уже получивших молозиво иммунных свиноматок, не имеет смысла, так как при наличии колостральных AT поствакцинальный иммунитет у поросят не формируется. Вынужденная вакцинация поросят отъемного возраста чревата риском провокации инфекции, так как нейтрализуя остатки материнских AT, вакцина лишает поросят возможности защищаться в инфицированной среде. Следовательно, вакцинировать поросят до отъема еще рано, а после отъема уже поздно. При пероральном введении вакцинный вирус проникает в организм через естественные ворота инфекции, где организм биологически подготовлен к встрече с агентом, благодаря мощным лимфоидным образованиям глоточного кольца, которые сразу же запускают иммунный процесс. Кроме того, вакцинный вирус, блокируя чувствительные рецепторы, подчиняя метаболизм клетки и ее энергетический потенциал регулирующему влиянию генома вакцинного вируса, лишает полевой вирус обязательных условий, необходимых для проникновения и репродукции. Срабатывает механизм упреждения. Таким образом, ни последующее инфицирование поросят полевым вирусом, ни массированное поступление с молозивом AT, не способны прервать или повлиять на формирование полноценного (с секреторным компонентом) иммунитета против КЧС. Установлено, что однократной пероральной вакцинации новорожденных поросят живой вирусвакциной (ЛК-ВНИИВВиМ) достаточно, чтобы защитить их от заболевания в течение всего технологического цикла выращивания вплоть до сдачи на мясокомбинат.

Сотрудниками ВНИИВВиМ был выделен полевой изолят ВКЧС №187Л, обладающий низкой вирулентностью для 3-4-месячных поросят, но идентичный шт. Ши-Мынь.

Длительный эпизоотологический мониторинг позволил выявить причинно-следственную связь между вакцинацией против КЧС и возникновением отечной болезни поросят (ОБП). Оказалось, что ОБП может появляться как осложнение после воздействия на поросят не только вирулентного но и аттенуированного ВКЧС. При этом исход смешанного течения вакцинно-инфекционных процессов заканчивается лидерством ОБП и гибелью от нее части свиней [17].

Профилактическое применение живых вакцин против КЧС не допускает каких-либо отклонений от требований наставлений так как это может привести к серьезным последствиям - гибели молодняка, понижению напряженности иммунитета и др. Наиболее распространенными нарушениями в применении вакцин против КЧС является невыполнение требований инструкции (по профилактике и ликвидации КЧС) о исключении из цикла воспроизводства в неблагополучных по КЧС хозяйствах иммунизированных свиноматок после осеменения и в период беременности в 10-кратной дозе. Таким образом возникает необходимость поросят от таких свиноматок вакцинировать тоже в 10-кратной дозе, а так же не соблюдение обязательного временного разрыва между вакцинацией против КЧС и применением других биологических препаратов и лекарственных средств. Это вызывает неудовлетворительный физиологический статус привитых животных.

Эффективность вакцинации при КЧС во многом зависит от схемы иммунизации супоросных свиноматок, поросят различных возрастных групп и их ревакцинации. Схемы вакцинации разрабатывают с учетом иммунологического статуса вакцинированных свиней и эпизоотической ситуации. В Республике Беларусь предписана следующая схема вакцинации: с целью передачи потомству материнского иммунитета свиноматок рекомендуют вакцинировать за 10-14 дней до случки однократной дозой, а полученных от них поросят - на 30-45-й день жизни и ревакцинировать их в 85-100-дневном возрасте в той же дозе. Другие вакцины разрешается применять с интервалом не менее 14 дней до и после вакцинации против КЧС.

В хозяйствах, неблагополучных и угрожаемых по классической чуме свиней: - свиноматок - за 10-14 дней до случки в однократной дозе. Поросят подвергать вакцинации в 10-15-дневном возрасте первично 10-кратной дозой вакцины, а повторно- в 35-40-дневном возрасте однократной дозой и ревакцинировать их в 85-100-дневном возрасте в той же дозе вакцины. Другие вакцины разрешается применять с интервалом не менее 14 дней до и после вакцинации против КЧС [31, 40, 43].

Главным недостатком перечисленных выше живых вакцин является невозможность идентификации ВНА индуцированных вакцинными и полевыми штаммами ВКЧС. Эту проблему решает создание маркированных вакцин.

10.2 Маркированные вакцины

Новое направление в специфической профилактике КЧС - развитие маркированных вакцин, позволяющих дифференцировать инфицированных и вакцинированных свиней. В маркированной вакцине специфический вирусный компонент содержит, по крайней мере, на один антигенный белок или эпитоп меньше, чем полевой вирус. Компонентная маркированная вакцина содержит гликопротеин Е2 вируса КЧС, который экскретируется клетками насекомых, инфицированными рекомбинантным Е2-бакуловирусом. Бакуловирус инактивировали, а белок Е2 смешивали с водно-маслянным адъювантом. Эффективность вакцины зависела от количества белка Е2. Вакцинированных инфицированных и свиней различали при помощи ИФА, выявляющего антитела к Е^{r n s} белку. Однократная прививка животных дозой вакцины в 32 мкг (по другим источникам 20 мкг) Е2 в виде двойной водно-масляной эмульсии предохраняла поросят от клинического проявления болезни и гибели после контрольного заражения их через 3 недели после вакцинации. Вакцина была стабильной в течение, по крайней мере, 18 месяцев, полностью сохраняя свою иммуногенность. Компонентная вакцина Porcilis Pesti, приготовленная из гликопротеина Е2 содержала не менее 40 ед. Е2, и вызывала у свиней образование ВНА в титре не менее чем 1:32.

Создана также ДНК-вакцина против КЧС и стратегия первичной бустеризации, состоящая из введения сначала ДНК-вакцины, а затем аденовирусного рекомбинанта [47, 43].

В 1991 г. было осуществлено встраивание генов гликопротеинов ВКЧС в вектор (вирус осповакцины). Полученный рекомбинантный вирус оказался высокоиммуногенным. Изучая роль разных белков вируса в иммунитете против КЧС, свиней прививали рекомбинантными вирусами осповакцины экспрессирующими различные белки ВКЧС. Устойчивыми к контрольному заражению оказались только те животные, которые были привиты рекомбинантным вирусом вакцины, экспрессирующим Е^{r n s} и Е2. Гликопротеин Е^{r n s} - второй по значению протективного антигена ВКЧС. Конструкции рекомбинантного вируса, не содержащие гена, кодирующего Е2, не вызывали образования ВНА, но индуцировали протективный иммунитет.

В настоящее время получен рекомбинантный аттенуированный вирус БА, в котором ген, кодирующий белок gЕ, заменяли геном, кодирующим белок Е2 ВКЧС. Он вызывал у свиней выраженный иммунитет против обоих вирусов.

Позже создали живые комбинированные вакцины на основе аденовируса и вируса оспы свиней.

Маркированная вакцина также может быть основана на генно-инженерном живом делеционном мутанте вируса. Получены делеционные мутанты, в которых полностью или частично отсутствуют гены Е2 и Е^{r n s}. При введении таких вакцин свиньям репродукцию инфекционного вируса у привитых после заражения не обнаруживали.

Мутанты пестивирусов ВКЧС, ВДБС, вируса пограничной болезни имеют пониженную способность к репликации, выражающуюся в образовании мелких бляшек, и содержат мутации в 5'-нетранслируемой области генома. Разработана вакцина для профилактики классической чумы свиней, состоящая из специфических вирусных полипептидов, векторные вакцины, способные экспрессировать нуклеотидные последовательности, кодирующие такие полипептиды. Данные полипептиды и нуклеотидные последовательности могут использоваться и для диагностики обусловленной ВКЧС инфекции. Получено пять перекрывающихся синтетических пептидов, охватывающих последовательность области В/С (аминокислотные остатки 693-777) гликопротеина Е2 штамма Ши-Мынь ВКЧС. Отдельные пептиды конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином и иммунизировали полученными препаратами кроликов. На все пять пептидов получен ответ антител в высоких титрах. Комбинация этих же препаратов, введенных свиньям, индуцировала сильный и специфичный гуморальный ответ на все пять компонентов.

Получены химерные штаммы на основе С штамма ВКЧС, в котором Е2 или Е^{r n s} гены были заменены соответствующими генами вируса диареи крупного рогатого скота. Через 7 дней после введения химерных штаммов, они полностью защищали свиней против летальной инфекции вирусом КЧС.

Все эти вакцины позволяют различать инфицированных и вакцинированных свиней на основе антительного ответа на Е^{r n s}, если вакцина содержит ген, кодирующий Е2, или на основе антител к Е2, если вакцина содержит ген, кодирующий Е^{r n s} [47].

Однако, не смотря на разнообразие вакцин нового поколения, специфическая профилактика КЧС по-прежнему основывается на применении традиционных живых вакцин. Они эффективнее стимулируют выработку ВНА после иммунизации животных. Из-за отсутствия стандартизированных критериев оценки затруднена сравнительная оценка безопасности и эффективности вакцин нового поколения. Только субъединичную Е2 вакцину предложили для испытания в практических условиях.

10.3 Инактивированные вакцины

В 1935 году Дорсетом была предложена кристаллвиолетвакцина, которая представляла собой консервированную раствором глицерина с краской кристаллвиолет и инактивированную теплом дефибринированную кровь свиней, больных чумой. Вводилась вакцина двукратно с интервалом 10-14 дней, иммунитет наступал к 15-20 дню и длился у молодняка до 5 месяцев.

С 1967 г. этот препарат в странах СНГ не применяется, хотя попытки получения инактивированного и абсолютно безвредного препарата продолжают предприниматься. Так, например, установлено, что ВКЧС, выращенный любыми технологическими приемами, надежно инактивировался сернокислой медью (3-5 мМ) при 37°С в течение 98 ч с сохранением иммуногенных свойств. Использование других инактивантов (глутаральдегид, димер-этиленимина, тритон Х-100) не обеспечивает получения иммуногенных препаратов в нативном виде (максимальная доза АГ). Разработана инактивированная вакцина против КЧС, содержащая культуральный материал вирулентного шт. Ши-Мынь, сернокислую медь в качестве инактиванта и гидроокись алюминия. Вакцина создавала 100%-ную защиту привитых животных от контрольного заражения вирулентным вирусом (1000-10000 ЛД₅₀), в то время как аналогичные препараты из шт. ЛК обеспечивали, в общей сложности, 30%-ную защиту. Во Франции разработана инактивированная вакцина против КЧС. Культуральный вирус инактивировали глутаральдегидом (0,01-0,001%-ным при 25-35°С в течение 4-7 ч), а затем эмульгировали в масляном адъюванте. В ВНИТИБП были получены опытные образцы инактивированной вакцины против КЧС из шт. Гудзон, выращенного в культурах клеток РК-15, ПЭКр и первичной культуре клеток почки поросенка. Вирус инактивировали этиленамином и эмульгировали с разными масляными адъювантами. Вакцина обеспечивала 75-100%-ную защиту в экспериментальных условиях при контрольном заражении /10000 ЛД50. Имеется патент на вакцину, содержащую полипептид вируса КЧС [43, 47].

Во ВНИВИ (Россия) разработана радиоинактивированная вакцина "Гаммавак-ВНИВИ" против КЧС, сконструированная на принципиально новой основе. Она представляет собой комплексный препарат, содержащий культуральный инактивированный белок ВКЧС (шт. "Ши-Мынь") и высокомолекулярный водорастворимый иммуностимулятор ксимедон. Вирус культивировали на КК невриномы гассерова узла крысы (НГУК-1), накопление вируса достигало до 6,5-7 lg ИД₅₀/мл. Инактивировали биомассу на гамма-установке "Исследователь" дозой 25-30 кГр, источник ионизирующего излучения - радиоактивный изотоп ⁶⁰Со. Инактивированная гамма-лучами сухая культуральная вакцина против КЧС безвредна, авирулентна. Обладает антигенной активностью; ее введение индуцировало в организме привитых животных образование специфических антител к вирусу чумы в титре 1:8. Двукратная вакцинация приводила к титру 1:13. Схема иммунизации включала двукратную вакцинацию с интервалом 14 дней. Через 14 дней все ревакцинированные животные противостояли контрольному заражению [2].

10.4 Серологическая оценка поствакцинального иммунитета

В Республике Беларусь обязательна вакцинация против КЧС всего свинопоголовья. Напряженнocть иммунитета у вакцинированных свиней определяют в соответствии с "Методическими указаниями по определению в РНГА_специфических антител у свиней, вакцинированных против чумы", утвержденными 4.08.1989 года Главным управлением ветеринарии СССР.

Оценка напряженности поствакцинального иммунитета проводится по титру AT.

В лабораторию для исследования напряженности иммунитета посылают не менее 10-15 проб сыворотки крови от свиней через 20-25 дней после иммунизации их против чумы.

Для исследования используют свежие сыворотки крови, которые хранят при температуре плюс 4°С не более недели или -20°С в течение месяца.

РНГА ставят с использованием антигенного эритроцитарного диагностикума (3%-ная взвесь эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном вирусвакцины чумы свиней).

Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками считают положительными при обнаружении агглютинации эритроцитарного антигена, начиная с разведения 1:4 и выше.

Обнаружение специфических антител в титре 1:4 и выше у 84% исследованных проб сыворотки крови указывает на наличие иммунитета у вакцинированных против КЧ свиней.

Кроме РНГА для определения напряженности иммунитета можно использовать метод ИФА. Суть метода - иммунологический планшет с иммобилизованным рекомбинантным антигеном Е2 вируса КЧС вносят исследуемую сыворотку в различных разведениях и специфические моноклональные антитела к Е2, коньюгированные с пероксидазой хрена. При отсутствии в исследуемой сыворотке вирусспецифических антител, моноклональный коньюгат свободно взаимодействует с иммобилизированным антигеном и после добавления субстрата и хромогена в лунке появляется окраска. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела к ВКЧС, происходит их взаимодействие с иммобилизированным антигеном, его частичная или полная блокировка, в результате чего связывание коньюгата с антигеном снижается.

Также оценку поствакцинального иммунитета можно проводить при помощи РДСК, РН. Вакцинацию можно считать успешной, если титр AT в РН флюоресцирующих микробляшек, спустя 2-5 месяцев после иммунизации, составляет 1:20 и выше.

Так, титр AT 1:32 и выше свидетельствует о напряженном иммунитете. У молодняка до 2-3 месяцев иммунитет ненапряженный и титр AT в РНГА составлял 1:4-1:8. Через 20 дней после вакцинации поросят вирус-вакциной титр ВНА постепенно повышался до максимального уровня к 60-му дню, клеточной реакции не отмечено. В трех группах поросят, привитых штаммами, вызывающими хроническую чуму, ВНА не обнаружено, клеточный иммунный ответ наблюдали у 4 животных из 9. Наивысший клеточный иммунный ответ был у поросят, иммунизированных инактивированным вирусом. Хотя иммунный ответ у поросят в разных подопытных группах был неодинаковым, после контрольного заражения вирулентным вирусом выжили все животные. У поросят, отнятых в 7-дневном возрасте от иммунных свиноматок, пассивная защита может продолжаться свыше 2 месяцев. При этом уровень иммунитета будет зависеть от времени, прошедшего между вакцинацией свиноматки и опоросом. Так, поросята, рожденные от свиноматок, вакцинированных за 10 месяцев до родов, могут быть вакцинированы не ранее возраста 5 недель. Бустер-вакцинация поросят этой группы в возрасте 6 месяцев вызывала подъем титров AT и устойчивость к вирусу продолжительностью до 4 лет. В ряде опытов поросят, рожденных от свиноматок, вакцинированных за 1 месяц до случки, иммунизировали в возрасте 5, 7 и 9 недель. Несмотря на то, что перед вакцинацией животные имели эквивалентные титры пассивно приобретенных AT, в последующем уровень иммунитета зависел от времени вакцинации: чем позже вакцинированы поросята, тем выше титры AT. Наилучшие результаты получены в группе поросят, вакцинированных в возрасте 9 недель.

Установлено, что при титре ВНА в РН флюоресцирующих бляшек 1:4 и выше животные устойчивы к внутримышечному заражению эпизоотическим штаммом в дозе 10⁴ ЛД₅₀, при титре 1:2 - переболевают и независимо от исхода представляют опасность как вирусоносители. Однако у значительного числа вакцинированных животных ВНА к ВКЧС отсутствуют. Среди поросят 30-дневного возраста AT в титре 1:16 были обнаружены лишь у 30 %, у остальных их выявить не удалось. В группах доращивания серопозитивных животных было 16%, в группах откорма через 140-200 дней после вакцинации серопозитивные животные составляли 50%. Вакцинация поросят от невакцинированных свиноматок в возрасте 9-90 дней вызывала у них иммунный ответ, который характеризовался появлением в сыворотке крови ВНА, а также защитой от прямого заражения вирулентным шт. ВКЧС в полевых условиях на 12-18-й день после заражения. Высокий уровень AT в сыворотке был обнаружен у поросят через 30-40 дней после вакцинации. Установлено, что материнские AT не обеспечивают достаточно надежную защиту против вирулентных штаммов ВКЧС. Продолжительность поствакцинального иммунитета у поросят от не привитых против чумы свиноматок продолжительнее, чем у поросят от вакцинированных свиноматок. В связи с этим поросят от вакцинированных свиноматок предпочтительнее вакцинировать в конце 1-го месяца жизни, однако при неблагополучных эпизоотических ситуациях поросят можно вакцинировать после 2-недельного возраста и через месяц ревакцинировать.

Вакцинация поросят, обладающих колостральным пассивным иммунитетом, вызывала появление у них различного иммунного состояния, которое зависело от количества колостральных AT на момент вакцинации. Обнаружено, что иммунизация поросят аттенуированным шт. Тиверваль эффективна тогда, когда нейтрализующая активность сыворотки ниже уровня колостральной нейтрализующей активности. Это так называемый порог эффективности вакцинации, который наступает у поросят в возрасте 30-35 дней. Авторы считают, что вакцинация поросят от иммунных свиноматок в возрасте 30-35 дней надежно защищает их от заражения вирулентным ВКЧС.

Период полураспада материнских AT у поросят от свиноматок, иммунизированных за 9 и 5 месяцев или за 85 дней до опороса, составлял 10 дней; AT у поросят обладали высокой или средней авидностью к АГ вируса и оказывали умеренный эффект на иммунный ответ у поросят после активной иммунизации. У поросят от свиноматок, иммунизированных за 55 дней до опороса, период полураспада молозивных AT составлял 6 дней; AT обладали слабой активностью и в значительной мере подавляли образование AT после активной иммунизации у поросят.

11. Меры борьбы и профилактики

вакцина чума свинья вирус

Мероприятия при классической чуме свиней должны проводится в соответствии с инструкцией по ее профилактике и ликвидации.

Общие меры профилактики: ограждение ферм (комплексов) с целью недопущения на их территорию посторонних лиц, транспорта, бродячих животных; оборудование при въезде на территорию дезбарьеров, а при входе в помещения дезподушек или дезковриков; комплектование ферм здоровыми животными из благополучных по КЧС хозяйств, с обязательным 30-дневным профилактическим карантинированием вновь завезенных животных; соблюдение санитарных и зоотехничеких норм содержания и кормления, обязательное термическое обеззараживание пищевых, кухонных и боенских отходов, предназначенных для скармливания свиньям; обязательное проведение плановых профилактических иммунизации свиней против КЧС.

Важное значение имеет серологический и иммунологический контроль (мониторинг) за благополучием по КЧС племенных ферм и репродукторов.

При возникновении подозрения на КЧС руководитель хозяйства (владелец животного) и ветеринарный специалист, обязаны:

- сообщить о возникшем подозрении главному ветеринарному врачу района (юрода);

- изолировать больных и подозрительных по заболеванию свиней и закрепить для ухода за ними отдельный персонал;

- прекратить производственную связь между свинарниками фермы;

- проводить убой больных животных только на убойном пункте (на убойной площадке);

- прекратить вывоз из хозяйства и ввоз в него свиней; вывоз кормов, оборудования и инвентаря, необеззараженного мяса, других продуктов полученных от убоя свиней;

- не допускать выезда за пределы хозяйства транспорта без дезобработки;

Главный ветеринарный врач района (города), получивший сообщение о заболевании свиней КЧ, обязан:

- выяснить эпизоотическую обстановку, отобрать пробы патологического материала и с нарочным отправить его в Республиканскую ветеринарную лабораторию или, по согласованию с Главным управлением ветеринарии Министерством сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь, в один из диагностических центров России;

- уточнить границы эпизоотического очага болезни, неблагополучного пункта и территории угрожаемой зоны;

- о выявлении очага классической чумы свиней сообщить ветслужбе на транспорте и госгранице и руководителю ветслужбы области (республики).

При установлении диагноза на классическую чуму свиней исполнительный комитет районного (городского) Совета депутатов по представлению главного ветеринарного врача района (города) выносит решение об объявлении хозяйства (фермы), населенного пункта неблагополучным по КЧС, установлении в нем карантина.

При приведении мероприятий по ликвидации КЧС учитывают размеры хозяйств, направленность ведения свиноводства, технологический статус животных пораженных групп.

Решение об убое всего поголовья животных принимается Чрезвычайной противоэпизоотической комиссией по представлению ветеринарной службы.

Клинически здоровых свиней неблагополучных свиноферм и комплексов вакцинируют против КЧС в соответствии с наставлениями по применению вакцин.

Больных и подозрительных по заболеванию КЧС, а также свиней, отстающих в развитии и больных легочными и желудочно-кишечными заболеваниями, подвергают убою.

В промышленных комплексах в период карантина запрещается перевод свиноматок из групп подсосного периода в цех холостого содержания. После отъема поросят этих свиноматок переводят в откорм для последующей сдачи на убой. Иммунизацию свиноматок против КЧС проводят до осеменения. Супоросных свиноматок вакцинировать живыми вакцинами запрещается, но если среди них возникает заболевание их прививают вирусвакцинами, однако из дальнейшего цикла воспроизводства исключают.

Работники, обслуживающие свинофермы у которых свиньи находящиеся в личной собственности заболели КЧС не допускаются к работе до снятия карантина.

Убой больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении классической чумой свиней проводят на санитарных бойнях мясокомбинатов или на специально оборудованных убойных пунктах с соблюдением ветеринарно-санитарных правил, предотвращающих распространение вируса.

При необходимости убой проводят на мясокомбинате, на который накладывают карантин до завершения переработки продуктов убоя неблагополучного поголовья.

Транспортировку свиней на мясокомбинат для убоя или продуктов их убоя для переработки проводят автомобильным транспортом с плотными, не пропускающими жидкость кузовами, с соблюдением ветеринарно-санитарных правил. В пути следования запрещается делать остановки в населенных пунктах, а также проводить прирезку свиней.

Для текущей дезинфекции (не реже двух раз в день) при классической чуме свиней эффективны 4%-ный раствор натрия гидроокиси (эффективен при использовании горячих (+80-90°С) растворов). Температура раствора непосредственно у поверхности объекта должна быть не ниже +40-45°С. Из других дезсредств можно применять 2%-ный раствор формальдегида, раствор хлорной извести с содержанием 2%-ного активного хлора, 1%-ный раствор глутарового альдегида, 5%-ный раствор однохлористого йода, 20%-ная взвесь свежегашеной извести и некоторые другие.

Санитарную оценку и использование мяса и других продуктов, полученных от убоя свиней из эпизоотического очага, осуществляют в порядке, предусмотренном Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов, которыми предусматривается следующее:

Туши и продукты убоя от свиней, больных и подозрительных по заболеванию КЧ, выпускать в сыром виде запрещается. Свиньи привитые против чумы и имевшие перед убоем повышенную температуру у которых после убоя обнаружены патологоанатомические изменения внутренних органов, при санитарной оценке расцениваются как больные классической чумой.

При наличии патологических изменений в мышцах тушу с внутренними органами направляют на утилизацию.

При отсутствии патологических изменений в туше и во внутренних органах решение об использовании их принимают после бактериологического исследования на сальмонеллез. В случае обнаружения в мясе или внутренних органах сальмонелл внутренние органы утилизируют или уничтожают, а туши выпускают после проварки или направляют на изготовление консервов.

При отсутствии сальмонелл тушу, шпик и внутренние органы перерабатывают на вареные, варено-копченые колбасы и консервы или направляют на проварку. Трупы животных, павших от чумы, уничтожают согласно существующим правилам, или они подлежат технической утилизации на мясокостную муку. Hа территории, угрожаемой по КЧС, устанавливают ветеринарный надзор за всеми хозяйствами и дворами, систематически проводят клинический осмотр всех свиней, запрещают их перегруппировки. Проводят профилактическую вакцинацию против КЧС во всех хозяйствах с учетом сроков ранее проведенных вакцинаций.

Карантин с неблагополучного по классической чуме свиней пункта снимают через 30 дней после последнего случая заболевания, падежа или убоя больных животных при условии проведения всех ветеринарно-санитарных мероприятий, предусмотренных соответствующей инструкцией, и заключительной дезинфекции.

Международный ветеринарно-санитарный кодекс и ветеринарно-санитарное законодательство отдельных стран и группы стран типа ЕЭС, регламентируют ветеринарно-санитарный статус страны или зоны (свободна от КЧС или неблагополучна), запреты на ввоз или транзит через их территорию свиней, мяса и продуктов переработки свинины, спермы хряков и продуктов, предназначенных для фармацевтических и промышленных целей и требования к странам-экспортерам при оформлении Международного санитарного сертификата Таким образом страны защищаются от заноса возбудителя.

Меры по контролю за передвижением и торговлей животными и продуктами свиноводства играют решающую роль не только при охране страны, хозяйства, благополучной зоны от заноса возбудителя, они приобретают еще большее значение при ликвидации вспышек КЧС в неблагополучных и угрожаемых зонах.

В выборе стратегии борьбы с КЧС важнейшим критерием должна стать экономическая стоимость альтернативных стратегий: последовательное осуществление радикального метода убоя неблагополучных стад и проведение мер по санации среды (вакцинация исключается); сочетание метода убоя и вакцинопрофилактики в первой фазе искоренения.

При наличии эпизоотического течения болезни широкое применение вакцин вполне оправдывает себя. Когда болезнь сводится к спорадическим случаям вспышек осуществляется переход к искоренению очагов методом убоя и прекращением вакцинации. Общеприняты и обоснованы меры ликвидации спорадических вспышек методом убоя (без вакцинации): они экономически более выгодны, чем систематическая вакцинопрофилактика.

Выводы (анализ данных литературы)

Господствующий в ветеринарии этиологический (причинный) подход при изучении болезни в сочетании с молекулярно-биологической методологией и генноинженерными исследованиями, существенным образом меняют наши представления о ветеринарной патологии и способах решения насущных практических задач по охране здоровья животных.

Механизмы персистентных форм инфекции тесно связаны с экологией вирусов и формированием не только антигенных вариантов, но и вариаций вирулентных свойств вирусов. Многообразие вирулентных вариантов вируса порождает многообразие клинико-эпизоотологических форм КЧС, затрудняет мониторинг и диагностику, осложняет вакцинопрофилактику и меры борьбы. Эпизоотический процесс практически не поддается нашему контролю. Даже такая радикальная мера борьбы, как уничтожение зараженных стад и санация окружающей среды, - становятся недостаточными. Эти меры необходимо дополнить сероиммунологическим и вирусологическим контролем (мониторингом) племенных ферм, репродукторов.

В связи с изложенным выше, особого внимания заслуживают иммунологические аспекты инфекции. Наши знания механизмов этой сложной гомеостатической системы поверхностны, а они играют решающую роль в патогенезе болезни, формировании экологической ниши вирусов и построении рациональной системы искоренения болезни.

Проблема создания современных инактивированных вакцин против чумы свиней не решена. Единичные работы в нашей стране и за рубежом пока не дают ориентиров технологического решения этой проблемы.

Существует два способа борьбы с КЧС: первый основан на тотальном убое свиней в неблагополучных районах, другой предусматривает частичную выбраковку и убой с проведением вакцинации оставшегося поголовья.

Меры борьбы с КЧС часто определяются эпизоотической ситуацией и социально-экономическими факторами. Положительный опыт борьбы с КЧС с помощью вакцинаций накоплен во многих странах.

Учитывая широкие экономические связи, импорт животных и продуктов их убоя из стран Ближнего и Дальнего Зарубежья, неблагополучных по КЧС, отсутствие возможности проводить оздоровление неблагополучных хозяйств по этой болезни методом тотального убоя всего поголовья, наличие резервуара ВКЧС в виде диких свиней, вакцинация еще многие годы в республике будет играть важную роль в профилактике и ликвидации КЧС.

Проблема специфической профилактики классической чумы свиней в Республике Беларусь еще не решена. Таким образом, разработка технологии изготовления вакцины против КЧС в РБ с целью импортозамещения весьма актуальный вопрос.

ГЛАВА 2. Материалы, методика и место работы

Исследования проводились в условиях отдела эпизоотологического и иммунологического мониторинга, вивария РУП "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского"

Целью исследований является разработка технологии изготовления живой вирусвакцины против классической чумы свиней из лапинизированного штамма и освоение ее производства в условиях РУП "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского".

1. Техника проведения опытов и основные методы исследования

Для изготовления экспериментального образца вакцины сухой живой против классической чумы свиней использовали клинически здоровых взрослых кроликов массой 2,0-2,5 кг, средней упитанности, с температурой тела в пределах 38,5-39,5^оС в количестве 15 голов.

Матриксный вирус классической чумы свиней "АСВ" из коллекции микроорганизмов РУП "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского" характеризовался отсутствием контаминации, вследствие чего считался пригодным для наработки вирусного сырья.

С целью максимального накопления вирусных частиц флакон с вируссодержащим материалом размораживали, материал центрифуговали 15 минут при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость смешивали с фосфатно-буферным раствором, рН 7,2-7,4 в соотношении 1:2 и использовали для заражения кроликов. Указанное рабочее разведение вируса вводили внутривенно в объеме 2 мл в краевую вену уха с соблюдением правил асептики. Наблюдение за животными вели при периодическом измерении у них температуры тела: - первоначально через 30-32 часа после заражения, а затем через каждые 6 часов. При повышении температуры тела свыше 40,5^?С дальнейшее измерение проводили с интервалом в 3 часа. Кроликов, реагировавших гипертермией свыше 41^?С, в интервале 46-52 часа после заражения использовали для получения лапинизированного вируса.

Для этого от каждого животного в отдельный стерильный флакон, содержащий 1000 ЕД гепарина, отбирали пункцией сердца кровь, используя иглы Боброва с насадкой из полистиролового шланга. Операцию по тотальному обескровливанию животных проводили с использованием отдельной иглы для каждого кролика и с соблюдением правил асептики.

Кровь от всех кроликов собирали в одну емкость, смешивали, отбирали пробу в объеме 10 см³ для контроля титра вируса. Затем разливали во флаконы по 100 мл, укупоривали и помещали в морозильник при температуре минус 40^?С. Через сутки кровь дважды размораживали - замораживали при температуре минус 70^?С.

Инфекционную активность вируса определяли титрованием на взрослых кроликах. Из отобранной пробы в объеме 10 см³ готовили возрастающие 10-кратные разведения от 10^-1 до 10^-5. Каждое разведение 10^-3, 10^-4 и 10^-5 вводили внутривенно в объеме 1 см³ трем кроликам. Начиная со вторых суток, у животных ежедневно 3 раза в день измеряли температуру тела в течение 4-х суток. У кроликов, реагирующих на введение вируссодержащего материала, температура тела повышалась до 41,5^?С.

На основании полученных данных термометрии по методу Рида и Менча рассчитывали титр вируса. При инфекционном титре не менее 3,0 lg ИД_50/см^З вируссодержащий материал замораживали на хранение при температуре минус 70^?С и по мере необходимости использовали для получения производственного вирусного сырья.

Для получения серии вакцины общим объемом 1,1 л (с учетом возможных отходов на всех этапах операций) брали 0,7 л оттаянного до температуры плюс 4-8^оС вируссодержащего материала и, соблюдая стерильные условия, освобождали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин от оболочек деструктированных эритроцитов и возможных сгустков. Надосадочную жидкость собирали в бутыль и добавляли антибиотики (пенициллин в концентрации 200 ЕД/мл и гентамицин в концентрации 50 мкг/мл, или их аналоги).

На расчетный 1 л вакцины брали следующее количество защитной среды для лиофилизации:

-100 мл 50%-ного раствора сахарозы;

-250 мл 20%-ного ГЛА;

-50 мл 10%-ного желатина.

В наработанное вирусное сырье объемом 0,7 л вносили необходимое количество защитной среды из расчета 40% на 1000 дм³, тщательно перемешивали, при необходимости доводили рН до 7,2-7,4. Затем вакцину расфасовали по 2±0,06 см³ во флаконы вместимостью 8-10 см³, подвергали лиофилизации.

Таким образом, было изготовлено 50 000 доз вакцины (500 флаконов). При этом, было использовано 15 кроликов.

2. Разработка методов контроля качества вакцины в лабораторных условиях

Методы контроля вакцины разрабатывали на основании требований, предъявляемых к ветеринарным препаратам, которые изложены в инструкции "О порядке регистрации ветеринарных препаратов в Республике Беларусь", Европейской Фармакопеи.

Разработаны следующие методы контроля вакцины сухой живой против классической чумы свиней из лапинизированного вируса: внешний вид, наличие посторонних примесей, трещин флаконов, массовая доля влаги, растворимость, стерильность, безвредность, биологическая активность вакцины по титру инфекционности для кроликов, иммуногенная активность (таблица 1).

Таблица 1 - Методы контроля вакцины сухой живой против классической чумы свиней

Наименования показателя	Характеристика и норма показателя
1 Внешний вид и цвет	Сухая гомогенная мелкопористая масса от светло-желтого до коричневого цвета
2 Наличие посторонних примесей	Не допускается
3 Влажность, %	2,5 - 3,0
4 Растворимость, мин	1,5 - 2,0
5 Наличие вакуума во флаконах (ампулах) с вакциной	При облучении флаконов (ампул) с вакциной наблюдается фиолетово-синее свечение и потрескивание
6 Стерильность	На питательных средах с посевами из вакцины не допускается рост бактерий или грибов
7 Титр вируса в вакцине	Не менее 103.0ИД50/см3
8 Безвредность	Введение поросятам внутримышечно вакцины в объеме по 5,0 см3, подкожно белым мышам - по 0,5 см3, подкожно кроликам по 1,0 см3 не должна вызывать видимых изменений в месте инъекции и изменений общего состояния животных в течение последующих 10 суток. Вакцина считается безвредной, если все поросята в течение 14 суток - клинически здоровы
9 Иммуногенная активность	Вакцина считается иммуногенной, если в сыворотках крови иммунизированных поросят процент блокировки антител имеет значение не менее 40.

2.3.1 Внешний вид вакцины, наличие посторонних примесей определяли визуально.

2.3.2 Растворимость вакцины определяли путем добавления во флаконы (ампулы) с вакциной 10,0 мл физиологического раствора хлорида натрия и определения времени растворимости в течении 1-3 минут.

2.3.3 Наличие вакуума во флаконах, с вакциной определяли согласно ГОСТ 28083-89 "Препараты биологические. Методы контроля вакуума в ампулах и флаконах".

2.3.4 Массовую долю влаги определяли по ГОСТ 24061-89 "Препараты биологические. Метод определения влажности".

2.3.5 Для определения безвредности брали 10 флаконов с вакциной, в каждый добавляли по 2 мл физраствора. После растворения содержимое всех флаконов переносили в стерильный стеклянный флакон и тщательно перемешивали. Полученную смесь использовали для испытания.

Безвредность вакцины определяли на пяти мышах массой 18-20 г путем подкожного введения 0,5 см³ вакцины, на двух кроликах массой 2,0-2,5 кг - 1см³, и двух поросятах 3-4-недельного возраста, путем внутримышечного введения в область шеи вакцины в объеме 2 см³.

Вакцина считается безвредной, если все животные в период наблюдения (10-14 дней) останутся клинически здоровыми. На месте введения не должно быть каких-либо изменений (отека, эритем, уплотнений). У части поросят возможно кратковременное на 1-2 сутки после введения вакцины повышение температуры тела на 0,5-1,0^оС.

2.3.6 Активность вакцины определяли титрованием вакцины на взрослых кроликах. Содержимое 5 флаконов растворяли добавлением 2 см³ стерильного физраствора, смешивали в общем флаконе и из этой смеси готовили возрастающие 10-кратные разведения от 10^-1 до 10^-5. Каждое разведение 10^-3, 10^-4 и 10^-5 вводили внутривенно в объеме 1 см³ трем кроликам. Начиная со вторых суток, у животных ежедневно 3 раза измеряли температуру тела в течение 4-х дней. У кроликов, реагирующих на введение вакцины, температура тела должна повышаться до 41,5^?С.

На основании полученных данных термометрии по методу Рида и Менча рассчитывали титр вируса вакцины. Титр вируса в вакцине должен быть не менее 10^3,0 ИД ₅₀/см^З.

2.3.7 Определение контаминации вакцины бактериальной и грибковой микрофлорой. Пять флаконов отдельно растворяли в растворе Хенкса или в среде Игла, или среде 199. Для этого в каждый флакон с вакциной, добавляли 10 мл указанного раствора рН 7,2. Затем производили посев из каждого флакона вакцины в количестве 0,3-0,5 см³ в пробирки с МПА, МПБ, МППБ, Сабуро и во флаконы в количестве 2-5 см³ с МПБ и МППБ. Посевы производили в две пробирки и в один флакон с каждой средой из одного флакона вакцины. Питательные среды с посевами выдерживали в течение 10 суток в термостате при плюс 37-38°С (для агара Сабуро - плюс 20-22°С). В питательных средах с посевами не должно быть роста бактериальной и грибковой микрофлоры.

2.3.8 Иммуногенность вакцины проверяли на четырех серонегативных (2 из них контрольных) подсвинках массой 25-35 кг, возраст не моложе 60 дней, вакцинированных одной прививной дозой в объеме 2 см³. За иммунизированными животными велось наблюдение в течение 21 дня.

Через 21 сутки были отобраны пробы крови от вакцинированных и не вакцинированных поросят с целью получения сыворотки крови для исследования на наличие антител в ИФА. Вакцина считается иммуногенной, если в сыворотках крови иммунизированных поросят процент блокировки (связывания) антител имеет значение не менее 40.

Подопытных животных содержали по 2-3 головы в виварии РУП "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского". Помещения тщательно очищали механически, промывали водой, дезинфицировали 5%-ным раствором едкого натрия. Животные получали комбикорм, овощи и воду.

Статистическую обработку полученного цифрового материала производили с использованием программного пакета Microsoft Office XP (Excel).

Глава 3. Результаты исследований

3.1 Для получения лапинизированного штамма вируса КЧС использовали аттенуированный вирус классической чумы свиней "АСВ". Было проведено 5 пассажей его на взрослых клинически здоровых кроликах массой 2,0-2,5 кг средней упитанности по три животных на каждый пассаж, с температурой тела в пределах 38,5-39,5^оС. Кроликов, реагировавших гипертермией свыше 40,5^?С, использовали для получения вируса для следующего пассажа. Результаты термометрии представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Температурная реакция у кроликов при пассажировании вируса классической чумы свиней "АСВ"

Пассаж	Температура тела (в среднем) ?С, часы
	12	24	30	36	42	48	54	60	66	72
первый пассаж, 3 кролика	39,0	39,0	39,5	39,7	39,7	39,8	40,0	40,2	40,5	40,8
второй пассаж, 3 кролика	39,1	39,3	39,4	39,7	39,8	39,9	40,1	40,4	40,7	-
третий пассаж, 3 кролика	39,3	39,5	39,8	39,9	40,0	40,5	40,5	40,8	-	-
четвертый пассаж, 3 кролика	39,5	39,8	40,0	40,2	40,5	40,9	-	-	-	-
пятый пассаж, 3 кролика	39,8	40,0	40,1	40,5	41,0	-	-	-	-	-

Как видно из материалов таблицы уже при втором пассаже температура тела у кроликов повысилась до 40,7 через 66 часов, а не через 72 как отмечалось у кроликов при первом пассаже. При последующих пассажах закономерно уменьшался период подъема температуры. У кроликов пятого пассажа повышение температуры наблюдалось через 42 часа. Пассажирование вируса через организм кроликов сопровождалось усилением вирулентных свойств вируса АСВ. В дальнейшем нами была установлена стабильность явления усиления вирулентности. Таким образом, нами был получен штамм вируса классической чумы свиней с титром инфекционной активности 3 lgИД_50/см^З, названный "АСВ+".

3.2 При изучении биологических свойств штамма лапинизированного вируса после пятого пассажа на кроликах, получившего название "АСВ+" исследовали его на способность вызывать температурную реакцию, а также способность накапливаться в организме животных при введении вируса в разных дозах. Для этого использовали как биологическую модель клинически здоровых кроликов с температурой тела в пределах 38,5-39,5^оС массой 2,0-2,5 кг средней упитанности по три животных на каждое разведение вируса. Рабочие разведения вируса (нативный, 10^-1; 10^-2; 10^-3; 10^-4) вводили внутривенно в объеме 2 мл в краевую вену уха с соблюдением правил антисептики. Наблюдение за животными вели при периодическом измерении у них температуры тела в течение 72 часов после заражения с интервалом каждые 12 часов. Результаты определения инфекционного титра лапинизированного вируса штамма "АСВ+" по температурной реакции кроликов представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Инфекционный титр лапинизированного вируса штамма "АСВ+" по температурной реакции у кроликов

Титр вируса	Температура ?С, через (часов)
	12	24	36	48	60	72
нативный	38,5	39,3	40,9	41,2	41,7	41,6
10-1	38,7	39,1	40,5	40,9	41,5	41,4
10-2	39,0	39,3	40,1	40,7	41,2	41,2
10-3	38,6	39,2	39,8	40,5	41,1	41,2
10-4	38,7	39,1	39,5	40,1	40,5	40,8

Исходя из этих данных для наработки вакцины выбрана оптимальная доза для заражения кроликов равная 2 мл с титром лапинизированного вируса - 10³ ИД_50/см^З.

Для изучения антигенной активности вируса "АСВ+" трех кроликов иммунизировали лапинизированным вирусом внутривенно в дозе 1см³ с титром 10³ ИД_50/см^З. Животных содержали под наблюдением в течение 20 дней, ежедневно отбирая пробы крови, для определения в сыворотке методом ИФА динамики антител и антигенов - график 1.



Данные, представленные на графике 1, демонстрируют взаимосвязь между уровнями выработки антител и накоплением антигена. Нарастание титра антител происходит поступательно с первых дней с незначительным спадом на второй и десятый день, который объясняется увеличением титра антигена. С 13 дня наблюдается устойчивая тенденция увеличения уровня антител и, соответственно, резкое падение уровня антигена.

Сопоставляя данные таблицы 3 и графика можно сделать заключение, что оптимальное время отбора вируссодержащего материала 60-72 часа после введения вирусной суспензии.

Нами был изготовлен и испытан на соответствие техническим требованиям лабораторный образец вакцины сухой живой против классической чумы свиней из лапинизированного вируса в количестве 50 000 доз.

Экспериментальная часть работы выполнена по классическим методикам, применяемым в клинической, микробиологической, эпизоотологической и иммунологической практике, что позволяет получить объективные результаты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы:

1 На основании анализа отечественных и зарубежных литературных данных по классической чуме свиней видно, что по существу многие страны имеют собственные средства и способы борьбы с этой болезнью обусловленные их экономическими и социально-политическими особенностями. В соответствии с этой реальностью вытекает необходимость разработки в Республике Беларусь технологии производства живой вакцины против КЧС.

2 В соответствии с поставленной целью нами методом многократного пассажирования вируса чумы свиней штамма АСВ был получен штамм с более выраженными для кроликов вирулентными свойствами, названный лапинизированным "АСВ+". Полученный лапинизированный штамм вируса классической чумы свиней "АСВ+" имел титр инфекционной активности 3 lg ИД_50/см^З. Установлено, что при изготовлении вакцины сухой живой против классической чумы свиней оптимальный титр для заражения кроликов вируса равен 10³ ИД_50/см^З.

3 Выявлена тесная взаимосвязь между уровнями выработки антител и накоплением антигена. Нарастание титра антител происходит поступательно с первых дней с незначительным спадом на второй и десятый день, который объясняется увеличением титра антигена. С 13 дня наблюдается устойчивая тенденция увеличения антител и, соответственно, резкое падение уровня антигена. Оптимальное время отбора материала для исследования на антиген - 60-72 часа после введения вирусной суспензии.

4 Разработаны методы контроля вакцины сухой живой против классической чумы свиней из лапинизированного вируса. Подготовлен проект научно-технической документации (ТУ, технологическая инструкция по изготовлению вакцины сухой живой против классической чумы свиней из лапинизированного вируса, проект инструкции по применению).

5 Изготовлен и испытан на соответствие техническим требованиям лабораторный образец вакцины сухой живой лапинизированной "АСВ+" в количестве 50 000 доз (500 флаконов).

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Алехин, Р.М. Современные методы специфической профилактики классической чумы свиней / Р.М. Алехин, А.К. Квасников. - Кишинев: Издательство сельскохозяйственной литературы МСХ МССР, 1961.- 25 с.

2 Ахметзянов, Р.К., Юсупов, Р.Х., Ильясова, Г.Х. Лабораторное и производственное испытание радиоинактивированной культуральной вакцины "ГАМАВАК-ВНИВИ" против классической чумы свиней. / Р.К. Ахметзянов, Р.Х. Юсупов, Г.Х. Ильясова // Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных: мат. Междунар. науч. конф. Молодых ученых; редкол.: Н.Н. Андросик [и др.]. - Мн., 2000.- С.51-54.

3 Бабкин, Н.В. Вирусные болезни домашних и диких свиней. / Н.В. Бабкин // Ветеринарная медицина 85. - Харьков, Т1, 2005. - С. 94-97.

4 Бабкин, Н.В. Использование метода флуоресцирующих антител для определения чувствительности культур клеток к вирусу КЧС. / Н.В. Бабкин // Ветеринарная медицина 85. - Харьков, Т1, 2005. - С. 50-52.