Підвищення збереженості живців смородини чорної та малини червоної після їх перебування при низьких температурах

Упакування. Спосіб упаковки та вибір тари визначається особливостями властивостей біоматеріалів та характером їх змін в процесі зберігання. Упаковка й тара мають забезпечити збереженість якісних показників біологічного матеріалу в умовах зберігання та транспортування.

Швидкість заморожування-відтавання. Вважають, що при повільному заморожуванні матеріалів, які мають клітинну будову, спочатку утворюються одиничні грубі кристали у позаклітинному просторі. В цьому випадку можливе значне дифузійне переміщення речовин внаслідок виникаючої різниці їх концентрацій, що зумовлено виділенням частини води у вигляді льоду в зонах матеріалу, температура котрих нижча за кріоскопічну. Вказане явище порушує звичайне співвідношення компонентів в тканинах і деякі клітини внаслідок цього гинуть. Для того, щоб зберегти живими клітини рослин і певні тканини тварин, необхідне дуже повільне охолодження, під час якого не відбувається різкого перепаду концентрації речовин в клітині.

Під час швидкого охолодження (більше 10 єС за 1хв) часто відмічається поява внутрішньоклітинних кристалів. Після завершення процесу охолодження, за температур вище -120 єС, починається ріст кристалів (перекристалізація, рекристалізація). Збільшення їх розмірів найбільш помітне при відігріванні. В разі утворення кристалів льоду всередині клітини, вона зазвичай гине.

Під час надшвидкого охолодження зі швидкістю кількасот градусів за 1 сек. (таке охолодження можливе лише у живих об'єктів, які мають мікроскопічні розміри), більша частина води перетворюється на аморфний лід, структура котрого мало чим відрізняється від структури води. Завдяки цьому клітини не пошкоджуються і виживають незалежно від своєї природи. Проте після надшвидкого охолодження, клітини зберігають життєздатність лише при дуже швидкому відігріванні (за 3-10 сек.), що дозволить уникнути рекристалізації. На практиці цей метод збереження клітин майже не використовують, бо більш-менш великі об'єкти неможливо охолодити та відігріти зі вказаними швидкостями [15].

1.5 Довгострокове зберігання рослинних об'єктів під впливом низьких температур

Низькі температури споконвіку застосовувались як ефективний спосіб довгострокового зберігання різноманітних об'єктів рослинного та тваринного походження, частіше за все продуктів харчування або сировини. В усіх цих випадках за допомогою простого охолодження або заморожування за помірно низьких температур вдавалось зберігати лише окремі властивості неживих об'єктів. Однак збереження в життєздатному стані клітин і тканин рослинного й тваринного походження виявилося вкрай важким завданням. Тільки деякі бактерії та більшість вірусів вдалося зберігати за допомогою звичайного заморожування. Ядерні клітини під впливом процесу заморожування й відтавання гинули. В той же час необхідність розробки методів їх довгострокового зберігання зростала із розвитком різноманітних галузей біології, медицини, сільського господарства, промисловості [20].

Розглянемо процеси, що відбуваються в клітині при охолодженні. Точка замерзання чистої води 0 °С, але її можна остудити до більш низьких температур (аж до -38 °С), при цьому льоду не утвориться. Така вода називається переохолодженою. Знизити точку замерзання можна додаванням речовин, що розчиняються, наприклад хлориду натрію, або кріопротекторів (гліцерин, диметилсульфоксид (ДМСО), поліетиленгліколь (ПЕГ)).

При охолодженні водяного розчину відбувається поступове утворення чистого льоду. У результаті поступового видалення з розчину води (за рахунок переходу її в лід) всі розчинені речовини концентруються в розчині, що залишився, внаслідок чого помітно знижується його температура замерзання. У міру подальшого охолодження вода з розчину буде продовжувати відділятися доти, поки, нарешті, не буде досягнута температура плавлення, за якої і цей концентрований розчин твердіє.

Інтенсивність шкідливого ефекту кристалів льоду, безумовно залежить від активності процесів кристалізації та властивостей утворених кристалів. Було встановлено, що за помірно низьких температур кристали льоду збільшуються в об'ємі на 10 %. Із подальшим зниженням температур відбувається стискання структур льоду. Вже при -20 єС об'єм льоду дорівнює вихідному об'єму води, а за температури -183 єС його об'єм складає 2,6 % первинного. Кристали льоду можуть мати різну форму й розміри - дендрити, сфероліти, крупно- та дрібнокристалічні структури та ін. Утворення кристалів відмічалося не тільки поза, але й всередині клітин [20].

Як клітинна стінка, так і плазматична мембрана виступають як бар'єри для росту льоду. Оскільки цитоплазма клітини стосовно позаклітинного середовища гіпертонічна, то лід спочатку утвориться поза клітиною. Позаклітинні розчини стають концентрованими, і осмотичний градієнт через мембрану клітини міняє свій напрямок. У результаті клітини починають втрачати воду, поступово зневоднюючись, а розчини усередині клітини стають більш концентрованими, що є однією з головних причин ушкодження клітин у процесі охолодження (осмотичний стрес). Іншою причиною є утворення внутрішньоклітинного льоду. Повністю ріст і перебудова кристалів льоду припиняється в чистій воді тільки при температурі поблизу -140 °С. От чому тривале впевнене зберігання можливо тільки при наднизьких температурах. Таким чином, ушкодження клітин при заморожуванні й наступному відтаванні залежить, з одного боку, від утворення льоду усередині них (механічний стрес), а з іншого боку - від їхнього зневоднювання (осмотичний стрес).

Враховуючи розглянуті фізико-хімічні фактори, реалізовані на етапах низькотемпературної консервації, в залежності від часу їх виникнення можна розподілити наступним чином: перший етап - перехід в стан анабіозу - відведення тепла (зміна активності перебігу всіх енергозалежних процесів); другий етап - заморожування - утворюються поза- та внутрішньоклітинні кристали льоду, гіперконцентровані розчини солей, змінюється рН середовища, зменшується об'єм клітин; третій етап - відігрівання (підведення тепла), відбуваються процеси рекристалізації, плавлення кристалів льоду, утворення в суспензіях клітин ділянок з розчинами солей нефізіологічних концентрацій, порушення балансу поза- та внутрішньоклітинних розчинів солей, створюються умови для гіпотонічного шоку, зневоднення й розриву клітин [20].

Немає необхідності описувати всі можливі негативні зміни, котрі можуть викликати в клітинах кристали в тих випадках, коли вони утворюються. Інтенсивність шкідливого впливу внутрішньоклітинних кристалів залежить від їх форми, розмірів, кількості, швидкості кристалізації та ін.. Однак дослідники неодноразово відмічали, що внутрішньоклітинні кристали можуть викликати як необоротні, летальні, пошкодження в клітинах, так і оборотні, несмертельні.

Вплив низьких температур викликає зміну у вмісті клітинних ліпідів рослинних біологічних об'єктів. Спостерігається помітне збагачення цитоплазми клітин ліпідними глобулами за температури, близької до нуля, як позитивної, так і негативної. Зміни, що спостерігаються в хімічному складі компонентів мембран призводять до підвищення виживаності клітин за низьких температур: в препаратах літнього сезону при -10, -15 єС виживає 50 % клітин, тоді як в зимовий сезон цей же факт спостерігається за температури нижче -196 єС. Вважається, що ліпіди, зокрема фосфоліпіди, виконують важливі функції у відновленні клітинних структур після холодового стресу. Їх локалізація, щільний контакт з мембранами пластид, мітохондрій, вакуолей, ядра свідчить про участь ліпідів у відновленні мембран клітинних органел [21].

В теперішній час є достатній арсенал способів, за допомогою яких можна максимально знизити негативну дію фізико-хімічних факторів на клітини або ж повністю уникнути виникнення деяких з них на етапах низькотемпературної консервації. До таких способів слід віднести варіювання швидкостей охолоджування та заморожування біологічних об'єктів, що дозволяє змінювати в потрібному напрямі швидкість утворення кристалів льоду й характер кристалізації. Однак навіть за дотримання оптимальних швидкостей заморожування не вдається досягти високої збереженості клітин біологічних об'єктів після довгострокового зберігання.

Другим способом, за допомогою якого можна регулювати процеси кристалізації, досягти стану переохолодження, понижуючи температуру початку кристалізації в біологічних системах, є введення в біологічні системи кріопротекторів. До кріопротекторів відносяться речовини, які безпосередньо або опосередковано взаємодіють з біологічними структурами, тим самим захищаючи клітини від згубного впливу деяких фізико-хімічних факторів, що реалізуються на етапах заморожування [20].

Зберігання пилка та насіння за знижених температур. Рентабельним є зберігання пилка та насіння за невеликих знижених температур. У цей час є конкретні рекомендації для зберігання насіння. Так, наприклад, для насіння картоплі оптимальною зниженою температурою зберігання є -14 °С, для насіння сорго -12 °С. Однак таке зберігання навряд чи доцільно. Це пов'язане з тим, що біохімічні процеси при таких температурах не повністю подавлені; крім того зберігання насіння за таких умов вимагає додаткового захисту від високої вологості й додаткових заходів запобігання відмов електричних систем охолодження.

Крім того, багато рослин розмножуються тільки вегетативним шляхом (черешками, відводками, бульбами). До того ж насіння несе в собі лише гаплоїдний набір хромосом, тому на практиці в основному вдаються до вегетативних способів розмноження, бо такі клітини мають диплоїдний набір хромосом і несуть повну інформацію про генотип вихідного сортотипа рослини. На сьогоднішній день для рослин, що розмножуються вегетативно, найкращим способом збереження їхнього генофонду є зберігання верхівкових меристем пагонів.

Здатність до регенерації багатьох рослин із маси неорганізованих тканин (калюсів), що проліферують in vitro, та з культур органів і пазушних бруньок є надзвичайно ефективною [22]. Після того, як встановили, що диференціювання клітин та розвиток рослин, в основному, контролюються рівнями рослинних гормонів, було продемонстровано можливість створення умов in vitro, що викликають клітинний ріст, морфогенез та регенерацію рослин з окремих клітин чи недиференційованих калюсів. Рослинні клітини та культура тканин - основні об'єкти клітинної біології, яка надає можливості регенерації рослин з протопластів, клітин і тканин, які, в свою чергу, можуть бути трансформовані чи відібрані за специфічними генетичними ознаками.

Культура рослинних клітин дозволяє відносно швидко отримувати численні популяції за регульованих та контрольованих умов середовища на обмеженому просторі й ідентифікувати лінії рослин з підвищеною біологічною продуктивністю. Рослинні клітини можна культивувати як на рідких, так і на твердих середовищах. Прийоми, які при цьому застосовують, аналогічні культивуванню мікроорганізмів.

Найзручнішою моделлю, яка відрізняється високою чутливістю до змін умов існування та дії найрізноманітніших факторів хімічної та фізичної природи є клітинна культура. Лінії клітин, що перевивають, характеризуються морфологічною однотипністю клітинних елементів, значною подібністю метаболізму та цитофізіологічних показників. Таким чином, вивчення впливу низьких температур безпосередньо на клітину, котре проводять на культурі клітин, дозволяє виявити зміни клітинних та субклітинних структур, встановити, яким чином ядерний апарат реагує на умови кріоконсервування, як змінюється темп проліферації, з'являються аномалії мітозу та ін. [21].

Процес починають із взяття в асептичних умовах шматків тканини від молодої здорової рослини, як правило, використовують листя чи стебло. Тканину поміщають у підібране поживне середовище за відповідних фізико-хімічних факторів середовища. Після отримання калюсу можливо продовжити його вирощування на твердому середовищі чи отримати суспензію клітин. Суспендовані рослинні клітини у порівнянні з клітинами калюсу більш гомогенні, швидше ростуть та мають більш високі адаптивні можливості.

Протягом багатьох років для збереження вихідних культур використовувалося постійне вирощування рослин при оптимальних умовах. Загальними недоліками цього методу розмноження є: низькі швидкості зростання рослинних клітин, висока частота інфекції, генетична нестабільність. Крім того, в суспензії клітин спостерігається їх агрегування, диференціювання, в результаті чого знижується активність [22]. До того ж для підтримки культури тканин звичайно потрібні регулярні пересадження на свіже живильне середовище через кожні 2-4 тижні, що виявляється досить трудомістким і дорогим процесом.

У цей час існують два основні підходи до зберігання культур клітин та тканин рослин: уповільнений ріст колекції й кріозбереження.

Уповільнений ріст колекції. Для вповільнення росту більшості культур необхідні фактори, що обмежують ріст. Найчастіше використовується зниження температури культивування. Помістивши колекції в умови низьких температур (1-10 °С у залежності від холодостійкості виду рослин), період без пересаджень можна подовжити до 6-24 місяців.

Ріст рослин можна затримати додаванням до живильних середовищ сумішей, здатних сповільнювати ріст. Вони можуть чинити осмотичну дію (манніт) або бути речовинами гормональної природи (абсцизова кислота).

Ще один спосіб - зміна складу атмосферного повітря, з яким контактує культура, найчастіше зниження в ньому вмісту кисню (гіпоксія), наприклад, вирощування в атмосфері, що складається із суміші азоту (90 %) і кисню (10 %). Крім того, затримку росту можна викликати, знижуючи атмосферний тиск до 0,014 мм ртутного стовпа або комбінуючи знижений тиск і гіпоксію.

Звичайний час зберігання культур з обмеженим ростом становить близько року. Зниження швидкості росту нижче певної межі призводить до загибелі культури. Таким чином, якщо повністю відмовитися від пересаджування культури, необхідно використовувати такий спосіб зберігання, при якому відбувається повна зупинка метаболізму.

Традиційні способи зберігання живців рослин.

Давно відомо, що зберігати живці в домашніх умовах краще за все у холодильнику чи в льосі у ящику із вологим піском. Відомий ще один спосіб - живці втикають у звичайні бульби картоплі, обгортають в папір та кладуть в поліетиленовий пакет з дірками [11]. Так зберігають живці за субнульових температур. Він придатний для домашнього господарства, але строк зберігання живців в життєздатному стані за таких умов не перевищує 1 року.

Тому вдаються до більш низьких температур.

Доцільно зберігати живці за температур -30 0С протягом декількох років з подальшою їх перезакладкою.

Основна ознака анабіозу - це різної інтенсивності зворотне інгібування обмінних та біохімічних процесів [15]. Холодовий анабіоз індукується в клітинах гіпотермією та заморожуванням до помірно низьких температур. Однак у цьому випадку в клітинах відбуваються комплексоутворюючі взаємодії, хімічні реакції з малими енергіями активації, оскільки зберігається рідка фаза. Переважають процеси дисиміляції, що веде до загибелі клітин на протязі обмеженого інтервалу часу від декількох тижнів до кількох місяців.

Описані вище головні фізико-хімічні фактори низькотемпературної консервації, слід приділити увагу одному, можливо, найголовнішому з них, який призводить до виникнення всіх наступних факторів, - відводі енергії у вигляді тепла. У певних клітин тваринного та рослинного походження й ряду мікроорганізмів зниження температури нижче оптимальної в ряді випадків викликало летальні ефекти. Цей стан було названо холодовим шоком [20].

У міру продовження відводу тепла й зниження температури оточуючого середовища реалізуються всі вищезазначені фактори. Оскільки теплова енергія в клітинах перетворюється на механічну енергію, енергію фізико-хімічних, біохімічних та інших реакцій, то в ході охолодження характер і активність протікання всіх енергозалежних процесів змінюватимуться. Зокрема, вже на етапі гіпотермії уповільнюється швидкість руху всіляких молекул й органел в клітинах, змінюється в'язкість і деякі фізико-хімічні властивості розчинів білків, білок-ліпідних, білок-полісахаридних, нуклеопротеїдних та інших комплексів, які є основними компонентами ядра, цитоплазми й мембран клітин, знижується швидкість проходження біохімічних реакцій, відбувається розбалансування ензиматичних реакцій, змінюється регуляція внутрішньоклітинних обмінних процесів. Таким чином, під впливом охолодження в клітинах відбуваються порушення зазвичай впорядкованих, взаємопов'язаних та взаємообумовлених життєво важливих процесів. В цьому відношенні, хоча прийнято, що клітини, котрі знаходяться у стані анабіозу, краще переносять подальше заморожування, слід приділити увагу значенню швидкості відводу тепла вже на етапі переводу їх в цей стан [20].

Тільки у стані глибокого анабіозу, коли повністю зупиняються обмінні та біохімічні реакції, відсутня рідка фаза, створюються умови для довготривалого зберігання біологічної системи з повним наступним поверненням її до вихідного стану в умовах нормотермії. Перехід клітин до стану штучного глибокого холодового анабіозу, перебування їх в цьому стані та наступне переведення їх до стану нормотермії представляють собою технологічний процес кріоконсервування.

1.6 Кріоконсервування як альтернативний спосіб зберігання генофонду рослин

До останнього часу, здавалось, тільки у рослинництві не було необхідності у застосуванні методів кріоконсервування. Однак в ході розробки й удосконалення способів культивування рослинних клітин, вдосконалення методів гібридизації та ін. виникла необхідність у довготривалому збереженні рослинних клітин і статевих продуктів рослинного походження.

Єдиним можливим у теперішній час прийомом, який забезпечує довготривале зберігання стабільності геному, вважається консервація в умовах глибокого заморожування.

Кріоконсервування - це спосіб збереження властивостей біологічних об'єктів, одним з важливіших, але не єдиним етапом якого є використання низьких температур. Дослідники, котрі намагались застосовувати низькі температури з метою консервування, одразу ж зіштовхнулись із необхідністю захисту біологічних об'єктів від дії низьких температур, необхідно було не лише виявити всі фактори, що впливають на біологічні об'єкти, а й усебічно вивчити механізми їх дії [20].

Процес кріоконсервування, для реалізації всіх етапів якого необхідні певна апаратура, розроблені методики, середовища, захисні речовини, постійна наявність холодоагенту [15].

1.6.1 Технологія довготривалого зберігання пилка і насіння за азотних температур

Найбільш проста техніка кріозбереження пилка. Для цього підсушений пилок поміщають у пластмасові ампули, запечатують та переносять у рідкий азот. Кріобанк пилка унеможливлює схрещування сортів рослин, що різняться за часом цвітіння або ж мають пилок з коротким періодом фертильності.

Вода зберігає рухливість у досить широкому інтервалі температур. Її інтегральна інтенсивність міняється слабко при зниженні температури й практично однакова для сухих і гідратованих зародків. Незамерзлою залишається вода, що безпосередньо пов'язана з гідрофільними центрами молекул й може бути прирівняна до міцно зв'язаних форм води [18]. Різке зниження кількості слабко зв'язаної води обумовлено інтенсивними процесами кристалоутворення льоду. Лід, що утворився при заморожуванні, викликаючи ушкодження клітин, призводить до загибелі зародка як найбільш гідратованої тканини насіння. У той же час необхідно відзначити, що загибель зародка при вологості 25 % відбувається тільки при стресових режимах заморожування, тобто коли температура знижується з дуже великою швидкістю. При цьому вода кристалізується в найбільш гідратованих компартментах і практично відсутня її міграція в інші зони. При повільних режимах заморожування, коли можлива дегідратація тканин або створюються умови для виходу води із тканини, заморожування до -196 °С не викликає загибель зародка й насіння витримують будь-які режими заморожування. Однак у цьому випадку можливі інші ефекти, оскільки відомо, що при набряканні насіння при вологості близько 30 % майже подвоюється інтенсивність дихання, активізуються процеси гідролізу й ряд метаболічних реакцій.

Отже, успіхи кріоконсервування насіння значною мірою залежать від ступеня його вологості, верхньою границею якої є 10-15 %, а нижньою - 4-7 %. Таке насіння може бути збережено в рідкому азоті шляхом прямого занурення після попереднього висушування у вакуумі. Це пов'язане з тим, що в досить сухому насінні вода є зв'язаною, не здатною замерзати. Як тільки при намочуванні й набряканні насіння з'являється вільна вода, в ньому утворюється лід при заморожуванні, що призводить до механічних ушкоджень клітин та до їхньої загибелі. При висушуванні насіння нижче 4 % спостерігаються ушкодження, пов'язані з аутоокисненням ліпідів у меристематичних зонах зародка.

У цей час при глибинному заморожуванні насіння використовують методику японських дослідників Сакан і Ноширо (1975), які рекомендують висушувати насіння до 8-15 %, упаковуючи їх у пакети з фольги або ампули із щільними кришками, які потім занурюють в рідкий азот, і після зберігання поступово розморожують їх на повітрі.

Однак насіння інших рослин (такі тропічні культури, як кава, какао, гевея) не можуть проростати, якщо їхня вологість знижується нижче 31-12 % (залежно від виду). Які-небудь рекомендації з їх кріоконсервування відсутні, однак у цьому випадку може виявитися корисним попередній досвід кріоконсервування. Так, Г.А. Самігину (1960) вдалося зберегти схожість жита й пшениці на рівні 71 % після заморожування в рідкому азоті й навіть рідкому водні (-253 °С) набряклого насіння, що містять 70-80 % води. Успіх був досягнутий завдяки поступовому щотижневому східчастому заморожуванню насіння шляхом зниження температури в холодильних шафах до -60 °С з наступним їхнім зануренням у рідкий азот. Відтавання проводилося в цих же шафах з періодичним підвищенням температури через кожні два дні. Передбачається, що при невеликих швидкостях охолодження відбувається перерозподіл води усередині насіння і лід утвориться в ендоспермі, викликаючи зневоднення зародка й запобігаючи тим самим його механічним ушкодженням.

Вивчено вплив одноразового та повторного заморожування-відтаювання на морфологію насіннєвої оболонки, ультраструктуру зародку та схожість насіння [21]. Насіння заморожували у рідкому азоті, витримували 4 хв. та потім відтаювали на повітрі при 24 єС на протязі 1 год. Повторне заморожування-відтавання здійснили за тих самих умов. Встановлено, що одноразове заморожування-відтавання підвищує схожість насіння на 40-70 %, повторне - знижує на 30 % до рівня, перевищуючого контрольний (рис. 1.2).

Рисунок 1.2 - Вплив одноразового та повторного заморожування (-196 єС) на схожість насіння Setaria lutescence [21].

Виявлено експресію специфічних генів холодової адаптації (ГХА), регульовану на транскрипційному рівні, та встановлена закономірність успадковування холодостійкості. Ці дані наглядно демонструють селективну властивість наднизьких температур, яка забезпечує переведення рослинних біологічних об'єктів на більш високий рівень функціонування (гомеостазу). Інші автори помітили стимулюючий вплив низьких температур (-196 єС) на культури салату, кропу, цибулі, томатів, який проявляється на етапі проростання. У ряду видів (Daanthus jische) заморожування насіння сприяло пришвидшенню переводу рослин у генеративний стан.

Наднизькі температури (близько -196 єС) за певних режимів обробки дозволяють спрямовано змінювати морфофізіологічні властивості та отримувати мутанти з корисними біотехнічними та фізіологічними властивостями. Отримані дані пов'язують з активною діяльністю клітинного геному, спрямованої на «вмикання» механізмів програмованого життя охолодженої та кріоконсервованої клітини.

Підвищення схожості насіння зумовлено явищем раннього «сплеску» в структурних компонентах клітини. Воно проявляється в ранньому та потужному (високоамплітудному) підвищенні функціональної активності біооб'єктів, зниженні її в період функціонування до рівня, що перевищує вихідний та контрольний [21].

Безумовно, зберігання насіння рослин шляхом глибинного заморожування найбільш простий і дешевий спосіб збереження генетичних ресурсів.

1.6.2 Кріоконсервування верхівкових меристем клітин рослин

Головна перевага зберігання при дуже низьких температурах складається в значному вповільненні й навіть зупинці метаболізму й біологічного руйнування. Завдяки цьому широко використовуваному способу зберігаються мутантні, гібридні, трансформовані, здатні до морфогенезу клітини: меристеми й кінчики пагонів, зиготичні й соматичні клітини. Крім того, добре налагоджене кріозбереження менш трудомістке, ніж підтримання й зберігання живої колекції.

Слід зазначити, що даний спосіб може виявитися єдино придатним для довгострокового зберігання рослин, тому що має більшу перевагу в порівнянні з іншими об'єктами, що культивуються в даних умовах. Це пояснюється насамперед тим, що меристеми після кріозбереження відразу розвиваються в цілу рослину, тобто в цьому випадку немає необхідності проводити додаткові процедури, пов'язані з регенерацією рослин. Меристемальні клітини рослин завжди однорідні за диплоїдністю, і регенеровані з них рослини відповідають вихідному генотипу, цим забезпечується більша генетична стабільність. Крім того, меристемальні клітини рослин дуже дрібні, майже невакуолізовані, а у зв'язку із цим вони набагато легше переносять глибоке заморожування й відтавання.

Успіх низькотемпературного кріоконсервування залежить від цілого ряду факторів: генетичних і морфологічних особливостей клітин, складу середовища консервування, виду й концентрації кріопротектора, режиму охолодження й умов відтавання, здатності до загартовування й рівня проникності кріопротектора.

При заморожуванні відбувається утворення льоду усередині й зовні клітин. При повільному охолодженні відбувається утворення позаклітинного льоду, що призведе до зневоднювання й ушкоджень клітин до того, як буде досягнута температура замерзання цитоплазми. Швидке охолодження викликає більш раннє заморожування клітин зсередини й менше зневоднювання; ушкодження клітин викликається при цьому кристалами льоду, що утворяться усередині клітин.

Безпосереднє механічне травмування клітин позаклітинними кристалами льоду вченими не спостерігалося. Клітини можуть пошкоджуватися внаслідок деформації їх під час захвату зростаючими кристалами, а також затискання в каналах, котрі виникають між кристалами. Кристалізація води у позаклітинному просторі неодмінно призводить до утворення на певних етапах кріоконсервування гіперконцентрованих розчинів солей та зміни рН середовища. При цьому відбувається зневоднення клітин. Клітини втрачають не тільки вільну воду, але й воду, зв'язану з білковими макромолекулами. Все це призводить, з одного боку, до зменшення загального об'єму клітин, а з іншого - до порушення структури й функції біомакромолекул. Якщо зменшення об'єму клітин нижче критичної величини не є, на думку певних дослідників, згубним для клітин, то ушкодження макромолекул внаслідок їх денатурації, неодмінно, відіграє важливу роль у комплексі негативних реакцій, які призводять до загибелі клітин після кріоконсервування [20].

Кріобіолог Пітер Мейзур та його учні описали процеси, які відбуваються під час програмного заморожування, з точки зору математики та біології. Це теоретичне обґрунтування того, що вже застосовували практики, отримало назву «двофакторної теорії Мейзура». Згідно цієї теорії, основні пошкоджуючи фактори під час швидкого заморожування - це утворення внутрішньоклітинних кристалів льоду та експозиція клітин у гіперосмотичних розчинах (тобто в розчинах з високою концентрацією солей, котрі виникають, коли вода у рідкій фазі навколо клітин починає перетворюватись на лід. Звідси випливають важливі для практиків висновки: ступінь пошкодження клітин залежить від проникності мембрани клітин та швидкості охолоджування. Із врахуванням цього були розроблені оптимальні програми заморожування, котрі відрізнялись як для різних типів заморожуваних об'єктів, так і для різних видів та сортів рослин. Таким чином, оптимальні умови заморожування зазвичай підбирають експериментально, при цьому, звичайно, враховуючи основні положення теорії Мейзура [23].

Коли програмне заморожування, засноване на двофакторній теорії Мейзура спробували застосувати для більш великих об'єктів, результати заморожування були у більшості випадків негативними. Органи складаються із різних типів клітин, до того ж між ними є складні міжклітинні контакти. Кожен тип клітин має свої власні кріобіологічні характеристики, і програма охолодження, розрахована для одних клітин, може виявитися зовсім непридатною для інших. Найчастіше пошкоджуються міжклітинні контакти.

Альтернативний підхід до заморожування біологічних об'єктів отримав назву «вітрифікація». Теоретичні основи вітрифікації із застосуванням досить складного математичного апарату розробляв ще в 1930-х рр. Безіл Льюе з учнями та колегами. Відповідно до теоретичних передбачень Льюе, при дуже високих концентраціях кріопротекторів у середовищі і дуже швидкому зниженні температури, об'єкт переходить у склоподібний стан, минаючи фазу кристалізації. Певний час цей підхід залишався на другому плані, через успіхи програмного заморожування. Окрім того, здавалося, що виконати рекомендації Льюе технічно важче, ніж ті, що пропонує теорія Мейзура.

Тим не менш коли кріобіологи зіткнулися із проблемами, які виникають під час консервування органів, вони згадали про вітрифікацію. В наш час цей метод вважається перспективним не тільки для заморожування дрібних біологічних об'єктів, таких як ембріони, сперматозоїди та клітинні суспензії, але й для заморожування зрізів органів і тканин, а також цілих органів [23].

У практиці кріозбереження використовують метод двоступеневого охолодження, що полягає в попереднім заморожуванні клітин швидким охолодженням до температури нижче нуля й короткочасному витримуванні їх при цій температурі перед швидким охолодженням до температури зберігання. Переривання швидкого охолодження й витримування протягом певного часу при температурі, вище критичної, викликає стиск клітин, у результаті чого клітини стають здатними пережити охолодження й відтавання. Високі концентрації позаклітинних розчинів, що створюються під час періоду попереднього охолодження, очевидно, забезпечують стискання, достатнє для захисту клітин від ушкодження. Оптимальна температура й тривалість періоду попереднього заморожування залежать від типу клітин і пов'язані з кінетикою руху води через клітинну мембрану. На цьому етапі в середовище додають кріопротектори - речовини, які зменшують ушкодження клітин від осмотичного й механічного стресу при заморожуванні й відтаванні, змінюють проникність клітин і температуру замерзання. Кріопротектори - це речовини, що володіють здатністю попередити розвиток кріопошкоджень біологічних об'єктів та забезпечити їх збереженість в життєздатному стані після заморожування [20]. Це можливо в разі зниження кількості льоду, що утворився, і, отже, концентрації інших розчинених речовин. Кріопротекторами є або проникаючі в клітини речовини - диметилсульфоксид (ДМСО) і гліцерин, або не проникаючі високомолекулярні - полівініл, піролідон, декстран, поліетиленгліколь. Найчастіше використовують ДМСО або самостійно, або з додаванням сахарози, гліцерину. В теперішній час кріозахисна речовина, її концентрація у середовищі, а також склад кріоконсерванту підбираються індивідуально для кожної клітинної фракції, при цьому передбачується створення пропису консерванту, що забезпечує кращий з досягнутих результатів низькотемпературного зберігання. В цьому плані кріобіологи набули певного досвіду. Однак механізм захисного впливу кріопротекторів вивчений ще недостатньо, тому немає універсальних рекомендацій з їх використання для різних видів клітин. Звідси випливає, що під час розробки методу низькотемпературної консервації для нового виду клітин, в першу чергу, необхідно вибрати найбільш оптимальний кріопротектор й встановити його ефективну концентрацію. Ідеальний кріопротектор не повинен бути токсичним ані для клітин, ані для організму [20].

Таким чином, низькотемпературне консервування біологічних об'єктів являє собою технологічних процес, який складається із доволі конкретних етапів. Для здійснення цього процесу необхідна спеціальна кріоапаратура: заморожувачі, розморожувачі, сховища, переносні ємності, контейнери для заморожування біологічних об'єктів, кріопротектор, суспензійні середовища необхідного складу.

Кріоконсервація культур рослин у багатьох випадках починається з етапу спеціальної підготовки, хоча існують культури, які досить просто брати для заморожування на початку або в середині експонентної фази росту, коли вони збагачені меристемоїдними клітинами в результаті інтенсивних розподілів. Один зі способів попереднього культивування - додавання в середовище манніта або сорбіту в концентрації 2-6 % на період від декількох діб до 2-3 пасажів. Такий спосіб зменшував розмір клітин і, що важливіше, їхню вакуолезованість.

При другому способі попереднього культивування використовують амінокислоти й серед них у першу чергу пролін, чиє значення для зв'язування води в клітині широко відомо. Його концентрацію поступово піднімали для ряду клітин до 1 М (11,5 %) на строк до 4 діб (великий період предкультивування приводив до дегенеративних змін у клітинах). Крім проліну використовують низькі концентрації аланіну, серину й аспарагіну протягом 4-6 діб; найкращі результати були отримані з аспарагіном. У результаті в клітинах зменшується кількість зерен крохмалю і їхні розміри, збільшується (приблизно в 2 рази) вміст цукрів. Підвищується й виживання клітин після відтавання.

Третій спосіб попереднього культивування застосовували спочатку тільки для апексів пагонів - щільних організованих структур без міжклітинників, розміром близько 500 нм. Проникнення у внутрішні клітини апексів навіть легко проникаючого ДМСО і їхнє утворення утруднені. ДМСО додавали в концентрації від 2,5 до 10 % (частіше 5 % на строк до 48 годин).

Четвертий спосіб здійснюється в умовах штучного загартовування до холоду, він застосовний тільки для зимуючих рослин помірного клімату. Суть загартовування зводиться до імітації природного осіннього процесу підготовки рослин до періоду зимового спокою. При роботі із клітинними суспензійним або каллусними культурами звичайно їх (так само як і рослини) або відразу поміщають в умови з температурою від 2 до 5 °С на строк від 1 до 6 тижнів, або спочатку протягом декількох діб витримують при температурі 8-10 °С. Більш ефективне загартовування в присутності сахарози (до 12-15 %).

Після підготовки, перед додаванням кріопротекторів, клітинні суспензії концентрують. Оскільки центрифугування ушкоджує багато рослинних клітин, то застосовують відстоювання в циліндрі або прямо в колбі, які встановлюють у посудину з льодом. Тривалість осадження 15-30 хв. залежно від розміру клітин і їхніх агрегатів. Невеликі агрегати із дрібними найбільш життєздатними й стійкими клітинами осідають останніми. Після осадження надосадову рідину відсмоктують.

Заморожені культури необхідно зберігати при низькій температурі, принаймні, при -100 °С. На практиці для цього зручніше за все використовувати рідкий азот (-196 °С) або його пари (-150 °С).

Піддаючи кріоконсервуванню меристеми, можна не тільки зберегти даний генотип, але й одержати згодом шляхом мікроклонального розмноження необхідну кількість рослин.

1.6.3 Зберігання живців рослин за наднизьких температур

Під впливом безпосередньої дії факторів низькотемпературної консервації у клітин виникають первинні пошкодження: зміна форми, об'єму, порушення цілісності мембран, конформації макромолекул та ін.. Ці пошкодження можуть стати причиною вторинних пошкоджень, які розвиваються в клітинах в різний час після кріоконсервації. Якщо метод низькотемпературного консервування достатньо ефективний, інтенсивність негативного впливу вказаних факторів на клітини зведено до мінімуму, або ж виникнення окремих із них можна цілком уникнути. Однак результати досліджень свідчать про те, що універсального способу кріоконсервування ядерних клітин не існує. Це зумовлено неоднаковою стійкістю різних видів клітин до впливу факторів низькотемпературної консервації. Причини різної чутливості клітин до впливу даних факторів поки вивчені недостатньо [20].

Технологія зберігання живців рослин за наднизьких температур здійснюється в кілька стадій. Перший етап: відбирають зразки та обов'язково проводять оцінку їх збереженості, життєздатності та приживлюваності, виміряють вологість. Нежиттєздатні зразки відкидають. Другий етап: проводять підготовку біооб'єкта до заморожування для попередження внутрішньоклітинного кристалоутворення - сушіння. Для живців ступінь вологості у більшості випадків не повинна бути меншою за 30 %. Для збереження в них вологи, доцільно вкривати кінці воском чи парафіном. Зниження вологості призводить до ефекту плазмолізу, а перевищення - до внутрішньоклітинного кристалоутворення. Третій етап: після досягнення заданого рівня вологості, зразки охолоджують та направляють на зберігання. В парах рідкого азоту (-196 0С) можливе збереження життєздатних зразків на протязі необмеженого інтервалу часу. Четвертий етап: за необхідністю отримання потомства зразки відігрівають, відновлюють нормальну вологість та пророщують у воді а потім переносять в ґрунт. Можна додатково застосовувати стимулятори росту.

Для зберігання кріоархіву потрібно лише невелике приміщення, а єдиний компонент, необхідний для підтримання життя в кріобанку, - рідкий азот. Саме про нього слід серйозно подбати. В сховищі мають бути передбачені системи автоматичного поповнення азотом, індикатори, котрі передають сигнал на випадок падіння рівня рідини, та багато іншого. Корисно розподіляти матеріал у двох чи більше сховищах, на випадок, якщо в одному з них виникне аварійна ситуація. Звісно, переведення лінії в кріобанк та її відновлення потребують роботи кваліфікованих біотехнологів, купівлі дорогих програмних заморожувачів та ін.. Тим не менш Карлісл Лендел, один з головних творців кріобанку Джексонівської лабораторії (США), вважає, що затрати по переведенню тієї чи іншої лінії в кріобанк у будь-якому випадку є набагато меншими, ніж підтримання цієї лінії в розсадниках у живому вигляді [23]. Найбільші труднощі тут пов'язані із процесом заморожування, тому що клітини рослин мають свою специфіку та їх виживаність навіть у кращих випадках не перевищує 69-70 %.

1.7 Відновлення повноцінних рослин після їх довгострокового зберігання за низьких та наднизьких температур

Важливим етапом процесу кріоконсервування є відігрівання. Однак характер й механізми впливу фізико-хімічних факторів на клітини на цьому етапі вивчені недостатньо. Це зумовлено цілим рядом причин: відсутністю необхідної апаратури (програмних розморожувачів), ефективних способів підводу тепла. Окрім того, дослідники-кріобіологи досить довго не приділяли належної уваги цьому етапу кріоконсервування [20].

При занадто повільному відтаванні клітин у них відбувається повторне утворення льоду, що чинить пошкоджувальну дію. Тому переважніше використовувати швидке відтавання. Для цього ампули струшують у воді з температурою 40 °С, іноді 60 °С. Але як тільки в ампулі починає зникати останній кришталик льоду, її переносять у посудину з льодом.

Відмивання від кріопротектора застосовується тільки у випадку використання речовин, токсичних для даних клітин. Вміст ампули розбавляють в 3-4 прийоми з 15-ти хвилинними інтервалами більшим обсягом холодного живильного середовища або 3-15 %-ним сахарози. Підвищена концентрація сахарози корисна для вповільнення деплазмоліза, якщо кріопротектор його викликав. Потім клітини відстоюють, а надосадову рідину замінюють живильним середовищем, обсяг якої приблизно дорівнює вихідному обсягу суспензії. Поновлення росту культур вимагає 2-3 тижнів.

Таким чином, як на етапі заморожування, так і відігрівання клітини піддаються негативному впливу фізико-хімічних факторів.

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

2.1 Методи перевірки збереженості

Величина збереженості є критерієм, за яким визначається температура внутрішньоклітинного кристалоутворення (критична температура), критична вологість після висушування при підготовці до зберігання.

Показник збереженості оцінювали за допомогою проведення гістологічних зрізів бруньок і живців яка визначалась за морфо-анатомічними зрізами з використанням бінокуляру (розтин бруньок та деревини з визначенням їх пошкоджень за кольором).

Пошкодження бруньок і деревини визначали за шкалою запропонованою [24]. Бали 5 і 4 (чорна або чорно-коричнева кора або деревина) - це цілком вимерзлі тканини. Бал 3 характеризує світло-коричневу або сіро-коричневу деревину і жовто-, червоно- або ж світло-коричневу (але не темну) кору. Бал 2 - це слабке і середнє потемніння деревини, кора світло-жовто-оранжевих тонів. Бал 1 для деревини - це невелике сіре відхилення від природного світло-зеленого кольору.

Оцінка пошкодження вегетативних бруньок в балах: 5 - бруньки чорні; 4 - бруньки темно-коричневі; 3 - підбрунька коричнева, всі зачатки листя жовто-коричневі з переважно світлих жовто-коричневих тонів; 2 - жива центральна частина майже світло-зелена, але окремі листочки наполовину або частково мають мертві уражені ділянки у верхній частині, які коричневого кольору; 1 - жива брунька, живі світло-зелені зачатки листочків, але жовто-коричнева частина під брунькою (подушка), зовнішні частини листочків при цьому бувають забарвлені в темно-коричневий колір; 0,5 - все живе, але під брунькою її підстава має помітний і чіткий жовтий колір на загальному світло-зеленому фоні; 0 - все живе.

Значення збереженості, виражене у відсотках, оцінювали за допомогою перекладу напівкількісних показників пошкодження бруньок і деревини, оцінених в балах, в кількісні при застосуванні наступної формули:

S=100-20·n (2.3);

де: S - збереженість зразка (%);

n - номер показника відповідний ступеню пошкодження зразка (бал).

Визначення критичної температурної зони можна здійснити двома способами. Перший виражається через співвідношення збереженості біооб'єкту після охолоджування до заданої температури (формула 2.4), і другий - через відношення збереженостей після заморожування Sz і до So (формула 2.5):

Lо=(1- Sо/Sс)100% , (2.4);

де Lо - відносний показник зниження збереженості охолоджених зразків від -5 до - 70 оС;

S0 - схожість охолоджених зразків до заданої температури з подальшим відігріванням до 25 оС;

Sс - схожість зразків в контролі при 25 оС;

Lz=(1- Sz/Sо)100%, (2.5)

де Lz - відносний показник зниження збереженості охолоджених зразків від -5 до -70 оС з подальшим заморожуванням в рідкому азоті;

Sz - збереженість заморожених зразків з подальшим відігріванням до 25 оС.

Отримане значення Lо вказує на критичні температурні діапазони для рослин, в яких відбувається неповна дегідратація клітин, і як наслідок, ріст внутрішньоклітинних кристалів льоду. Таким чином, даний методичний прийом дає можливість визначати критичні температурні зони рослинних клітин за рівнем їх збереженості.

2.2 Методи визначення життєздатності живців рослин

Для дослідження впливу вологості, кількості ступенів охолодження, кінцевої температури і часу витримки на життєздатність різних сортів ягідних культур встановлено вплив сили і спрямованості параметрів, що визначають життєздатність деконсервованих живців.

Для визначення життєздатності, перевіряють здатність до укорінення. Утворення коренів у живця відбувається вздовж стебла та на зрізі в основі. Корені, що утворилися на стеблі, поступово зникають, та коренева система нової рослини формується в основному з базальних коренів, які знаходяться в основі живця. Прискореному відростанню базальних коренів сприяє обробка зрізу живця регулятором росту, а також добра забезпеченість повітрям [10].

Найпростіший спосіб укорінення - у банці з водою. За певних умов ним можна користуватися навіть для рослин, які вважають погано укорінюваними. Але поряд зі всією простотою цього методу є купа дрібниць від яких залежить успіх.

Наприклад, не всі рослини виносять зміну води. Для уникнення можливої невдачі краще не змінювати воду, а лише доливати її при випаровуванні. Мабуть, в ній накопичуються певні необхідні рослині продукти обміну (навіть якщо вода була добре відстояна, не містила жодних шкідливих домішок).

Важливий і рівень води у склянці. Якщо води надто багато, поблизу дна кисню недостатньо, а це може викликати загнивання нижньої частини живців: адже коріння виникає тільки на межі води й повітря. Досліди англійців показали, що коріння виникає набагато швидше та по всій довжині живців, що знаходяться у склянці, в тому випадку, коли здійснювали аерацію води [11]. Не менш важлива й кількість живців у банці. Жимолость, наприклад, не бажає укорінюватися, якщо на 200 мл води приходиться більше трьох живців, а от поодинці в баночці меншого об'єму ті ж живці чудово дають корені.

Великий вплив на укорінення живців чинить світло. Живець, що не має листя, краще утворює корені в темряві. Для укорінення живця, у якого залишилася хоча б частина листа, необхідне світло. Але навіть при світлі в непрозорому посуді корені утворюються набагато краще, ніж у світлій банці. Вважається, що живець, заготовлений з гілки в період, коли листя вже нема, вже містить певну кількість гетероауксину, який, мабуть, розкладається під дією світла. Якщо листя є, то саме воно виробляє стимулятор коренеутворення гетероауксин. Можна було б залишати на живцях все листя, але, знаходячись у воді, а тим більш під час укорінення в субстраті, коли надходження води обмежено, зайве листя висушує живці і вони можуть загинути.

2.3 Методи визначення приживлюваності живців

Здерев'янілі живці, навіть якщо у них немає листя, втрачають воду через випаровування з усієї поверхні пагону. Найпростішим поясненням відсутності новоутворених коренів у таких рослин є їх пересихання. Для зниження втрат води живці необхідно висаджувати глибше, щоб над землею була їх невелика частина. Але за дуже глибокої посадки може порушитись розпускання бруньок. На практиці живці частіше за все висаджують на таку глибину, щоб третя брунька знаходилась в землі, але у самої її поверхні - ріст у цьому випадку не уповільнюється. Тому для більшості культур достатньо залишати над землею відрізок живця довжиною 2 - 3 см.

Найбільш сприятливий повітряний режим утворюється у верхньому 5-см шарі ґрунту. Однак заглиблений в ґрунті на 5 см живець з виступаючою над поверхнею 3-см частиною все ж надто короткий, щоб вижити за несприятливих умов: він може швидко висохнути, невелика довжина не дозволить йому досить міцно закріпитися в ґрунті, нарешті, запасу поживних речовин в такому живці явно недостатньо для того, щоб він зміг успішно проіснувати в період спокою [10].

Температура є одним з вирішальних факторів коренеутворення у живців. Існують рослини, які полюбляють теплу чи холодну температуру. Живці однієї і тієї ж рослини укорінюються з різною швидкістю в залежності від температури. Межі оптимальних температур, за яких відбувається коренеутворення у живців більшості рослин, знаходяться приблизно між 18 і 30 °С. В разі підвищення температури вище 30° у парнику слід влаштовувати провітрювання.

Позитивний вплив на укорінювання живців чинить температура субстрату в перші 15-20 днів після садіння, якщо вона вища за температуру повітря на 4-5 °С. Така диференційована температура позитивно відбивається на укорінюванні як зелених, так і дерев'янистих живців. За таких умов у живців коренеутворення розпочинається раніше за розпускання бруньок або одночасно. Коли ж температура субстрату нижча за температуру повітря, то пагони утворюються раніше, ніж корені, тому відбувається втрата багатьох живців, а ті, що укоріняться дають великий процент нежиттєздатних рослин.

Ще один цікавий метод живцювання, розповсюджений останнім часом серед садоводів-любителів. Беруть крупну бульбу картоплі й ретельно видаляють з неї всі глазки. Живці втикають прямісінько в бульбу, закопують її в землю та накривають скляною банкою для створення парникового ефекту. За регулярного поливу живці швидко дають корені, а посаджені в саду молоді рослини добре розвиваються. Так вдається укорінити навіть ті рослини, що погано утворюють корені. Метод цілком обґрунтований, оскільки замість води живці отримують відразу велику кількість готових поживних речовин, зокрема вуглеводів, а також крохмалю.

Гетероауксин, індолілмасляна кислота чи інший стимулятор росту сприяють 100 % приживлюваності дерев'янистих живців винограду, чорної смородини та малини червоної і викликає активну появу коренів на живцях.

Застосовано спосіб визначення критичних зон внутрішньоклітинного кристалоутворення живців рослин, заснований на зміні рівня виживаності клітин залежно від кінцевої температури їх охолоджування в діапазоні від 0 до -70 С з подальшим відігріванням [25]. У даному методичному прийомі величина збереженості є критерієм, за яким визначається температура внутрішньоклітинного кристалоутворення.

Вивчення впливу ефектів низькотемпературної сублімації внутрішньоклітинної води і плазмолізу проводили на основі дослідження параметрів збереженості і життєздатності живців. Контроль життєздатності та збереженості живців проводили після кожного етапу висушування та заморожування. Для цього живці ставили на гідратацію в ексикатор з дистильованою водою і витримували на протязі 12 днів при температурі 5 °С, а потім пророщувати в умовах in vitro (в склянках з водою за температури 20-25 °С) та in vivo (укорінення в ґрунті). Набухання і розвиток бруньок характеризувало життєздатність досліджуваного зразка. Відсоток життєздатності зразка оцінювали як відношення кількості розкритих бруньок живця в умовах in vitro, до загальної їх кількості у зразку. Приживлюваність зразків оцінювали як відношення кількості укорінених живців в умовах in vivo, до загальної їх кількості у зразку.

2.4 Порядок проведення експерименту

Живці нарізали з однорічних пагонів та розподіляли на окремі зразки по 10±2 шт., довжиною від 5 до 12 см та діаметром 0,4-0,8 см. Живці мали від 2 до 5 вегетативних бруньок. При різанні дерев'янистих пагонів на живці верхню частину пагону обрізали, оскільки вона недостатньо визріває і часто має слабо розвинені бруньки. Нижній зріз робили навскіс під самою брунькою, до того ж ніж прикладали із сторони протилежної нижній бруньці; верхній зріз - на деякій відстані від бруньки, щоб неминуче висихання верхівки живця не торкнулося бруньки, що проростає. Після нарізки частину живців зберігали в холодильнику при -5 °С, а іншу частину - в сушильній камері при 4 °С. Перед висушуванням зразків, перевіряли їх життєздатність та початкову вологість. Для дослідження відбирали зразки з життєздатністю не менше 100 %.