Анализ комплексов лактоферрина молока человека

Для изучения олигомерных форм ЛФ необходимы были прямые методы анализа олигомерных форм белков в растворе. Известно, что использование дифракционных методов для анализа макромолекул и их комплексов позволяет получить информацию о их структуре и дисперсном составе непосредственно в растворе [,].

Для исследования олигомерного состояния ЛФ на первом этапе было использовано два подхода - метод малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (МУРР) и светорассеяния (СР). Это определялось тем, что потенциально ЛФ мог находиться в различных олигомерных формах от мономера до высокополимерных состояний. В то же время, с помощью МУРР можно видеть только частицы относительно небольшого размера, характеризуемые параметром h = 0.013 ч 0.103 Е^-1, что сопоставимо в размером олигомеров ЛФ, содержащих от 1 до 4 мономерных единиц, этот метод «не видит» более крупных частиц. Наличие в растворе более крупных частиц с h = 0,00137 ч 0.00206 Е^-1 можно анализировать с помощью метода СР.

Обычно в экспериментах по исследованию ЛФ используются препараты белка, которые после очистки хранятся в нейтральных растворах с концентрацией порядка 2 - 10 мг/мл при 4^oС или растворы белка замораживаются. Сначала нами были получены рентгенограммы МУРР для стандартного раствора лиофилизованного ЛФ (50 мМ Трис - НСl буфер, рН 7,5), хранившегося в течение месяца при 4^оС (рис. 7).

Рис. 7. Рентгенограммы МУРР в координатах I(h) от h для одного из препаратов агрегированного ЛФ (68 мкМ) в 50 мМ Tрис-НCl буфере, рН 7.5, до и после инкубации с 1 M NaCl в течение 1 - 42 ч. Этим четырем кривым соответствуют значения R_g, равные: 43.7, 38.6, 32.9 и 27.4 Е, соответственно. Из данных МУРР следует что ЛФ переходит в мономерную форму при 1 М концентрации NaCl

Данные для ЛФ были построены в координатах Гинье и на их основании рассчитано значение Rg. Согласно данным МУРР оно равно 43.7 Е, что значительно выше ожидаемого и свидетельствует в пользу того, что ЛФ находится в растворе не в моно, а в полидисперсном состоянии. Как известно, при добавлении 1 М NаСl олигомерные формы ЛФ должны диссоциировать до мономеров [16-17]. На рис. 7 приведены данные по изменению рентгенограмм МУРР во времени для раствора ЛФ после добавления NaCl до конечной концентрации 1 М. Из этих данных были оценены величины Rg для ЛФ через разные промежутки времени после добавления NаСl: 38.6 Е (через 1 ч); 32.9 Е (20 ч) и 27.4 Е, (42 ч). Как видно из рис. 7, кривая, соответствующие 42 ч инкубации совпадают с таковыми для ожидаемого мономера ЛФ с величиной Rg = 26.7 Е. Следовательно, диссоциация олигомерных форм ЛФ под действием соли происходит медленно, и только после 42 ч инкубации раствор содержит преимущественно мономерные формы белка.

Эти же растворы были проанализированы с помощью СР (подробнее смотри ниже). По данным СР растворы лиофилизованных препаратов ЛФ содержали олигомеры более высокой олигомеризации, чем тетрамеры, которые можно видеть с помощью МУРР.

Из данных полученных выше, было очевидным, что при длительном хранении растворов ЛФ происходит образование различных олигомерных форм белка. Для исследования эффектов различных лигандов на процессы олигомеризации необходимо было оценить временные интервалы, за которые происходит образование олигомеров в отсутствие и в присутствии различных лигандов ЛФ, а также КСl.

Как известно, ЛФ является исключительно конформационно активным белком [24]. Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что в процессе лиофилизации молекулы белка могут переходить в какую-то конформацию, которая не способствует его олигомеризации с образованием форм с исключительно большой мол. массой. По-видимому, в процессе хранения растворов происходит медленное изменение конформации ЛФ и накопление таких мономеров, которые легко образуют его высокоолигомерные формы.

При помощи измерения светорассеяния на угол 90⁰ была исследована кинетика олигомеризации ЛФ после добавления буфера, соли и лигандов (см. рис. 8).

Рис. 8. Относительное изменение светорассеяния на угол 90^о при инкубации ЛФ в 50 мМ трис-НСl буфере от отсутствии (а) и в присутствии 0.1 М KCl (б). Реакционные смеси инкубировали в отсутствие других лигандов (кривые 1), в присутствии 50 мМ АТР (кривые 2) или 5 мМ олигосахарида (кривые 3)

Как видно из рис. 8а, в отсутствие КСl, происходит сильное увеличение СР раствора ЛФ в течение первых примерно 10 ч инкубации, а затем ее заметное уменьшение. При добавлении в инкубационную смесь АТР или олигосахарида процесс олигомеризации ЛФ замедляется; максимальные изменения СР наблюдаются после примерно 4-5 ч инкубации, а затем идет медленное возрастание СР.

Добавление 0,1 М КСl скорость начального процесса олигомеризации уменьшается, но после длительной инкубации достигается кажущегося плато значений СР, близкое к таковому для смеси без соли. Добавление АТР или олигосахарида в инкубационную смесь, содержащую 0,1 М КСl, приводит в большей степени к замедлению олигомеризации ЛФ в присутствии олигосахарида, чем АТР. Интересно, что как в отсутствие, так и в присутствии КСl после 100 ч инкубации раствора ЛФ с АТР значение СР выше, чем для растворов без АТ. Наклон кинетических кривых изменения интенсивности СР в присутствии АТР и олигосахарида свидетельствует в пользу того, инкубация смесей более 100 ч (~ 4 дней) может приводить к образованию большего количества олигомерных форм ЛФ в присутствии лигандов, чем в их отсутствии. Учитывая это, в описанных ниже экспериментах анализ содержания олигомерных форм ЛФ проводили после инкубации всех реакционных смесей более 10 дней.

3.1 Анализ олигомерных форм ЛФ методом гель-хроматографии

Как отмечалось выше, ЛФ взаимодействует со многими широко распространенными сорбентами, используемыми для гель-хроматографии. Сотрудниками ЛФР ИХБФМ в результате анализа ряда сорбентов было показано, что наиболее оптимальным для анализа ЛФ c помощью метода гель-хроматографии является Sepharose 4B. Этот сорбент слабо взаимодействует с ЛФ и относительное время выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии соответствует их относительным молекулярным массам. Учитывая это, в данной работе был проведен анализ относительного содержания олигомерных форм ЛФ, инкубированного в различных условиях, с помощью гель-хроматографии. Для оценки относительной массы олигомерных форм ЛФ сначала была проведена гель-хроматография контрольных белков с известной мол. массой и калибровочная кривая.

Рис. 9. Калибровочная кривая для оценки мол. масс белков, полученная с использованием белков с известными мол. массами: ЧСА (67), IgG (150 кДа), IgA (400 кДа), IgM (800 кДа)

Следует отметить, что точное определение мол. масс небольших пиков белка около 800 кДа и более сильно затруднено, так как при таком малом времени выхода, значительными становятся такие факторы как ширина пика, а так же объем и время нанесения пробы на сорбент. Кроме того, Sepharose 4B обладает плохой эффективностью разделения белков с мол. массами ? 800 кДа. Учитывая это, далее следует считать, что фракции ЛФ, кажущиеся мол. массы которых оценены приблизительно как 780, 800 кДа и более (но не меньше) могут иметь и значительно большую мол. массу, или быть смесью нескольких субфракций белка, мол. масса которых превышает 780 кДа. В то же время пик декамера, соответствующий 754 кДа (см. ниже), скорее всего, можно считать определенным с более высокой точностью ввиду его малой ширины и хорошей высоты пика белка, а так же существенного удаления от характерного места выхода небольших по размеру пиков более 780 кДа.

На рис. 10 приведен профиль оптической плотности, соответствующей гель-хроматографии лактоферрина, инкубированного в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, а так же после инкубации ЛФ в этом же буфере, содержащем, 0,1 и 0,15 КСl. Видно, что ЛФ, инкубированному в буфере без соли, соответствует большой пик с кажущейся мол. массой 275 кДа с двумя плечами в области 295 и 251 кДа. Кроме того, видны пики в области ?145 кДа и относительно маленький по величине пик в области примерно 780 кДа.

Добавление к раствору ЛФ 0,1 М КСl ведет к очень сильному уменьшению пика с мол. массой 275 кДа и резкому увеличению пиков с мол. массами 145 и 68 кДа. Одновременно происходит уменьшение высокомолекулярного пика в области 780 кДа. Увеличение концентрации КСl до 0,15 М приводит к еще более сильному перераспределению относительного количества ЛФ в указанных пиках. После инкубации ЛФ с 1 М КСl обнаружен только один пик белка, элюируемый в области 68 кДа.

Рис. 10. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А₂₈₀) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5 в отсутствие других лигандов (синяя кривая), в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая)

При интерпретации полученных данных (рис. 10) следует принять во внимание следующие данные. Добавление КСl в инкубационную смесь, а также буфер, с помощью которого уравновешена колонка, должно приводить не только к диссоциации олигомерных форм ЛФ, но и уменьшению их взаимодействий с сорбентом. Кроме того, кажущиеся мол. массы белков при гель-хроматографии не всегда полностью соответствуют их истинным мол. массам, поскольку время выхода белков при гель-хроматографии зависит не только от мол. массы, но и от геометрической формы белковых глобул и их олигомеров. С учетом мол. массы мономера (76-80 кДа), молекулярные массы олигомерных форм белка должны быть равными: быть 152 - 160 кДа (димер), 228-240 кДа (тример), 304-320 кДа (тетрамер). Если учесть, что мономер с мол. массой 76 -80 кДа демонстрирует кажущуюся мол. массу примерно 68-70 кДа, то приблизительные мол. массы олигомеров могут быть близкими: 136 -140 кДа (димер), 204 - 210 кДа (тример), 272 - 280 кДа (тетрамер). Реально наблюдаемые значения мол. масс димера (145 кДа) и тетрамера (295-275 кДа) несколько ниже, чем вычисленные из значения истинной мол. массы мономера ЛФ, но в то же время немного больше, чем оцененные из значения кажущейся мол. массы мономера, найденной при гель-хроматографии. Особенно интересно, что пик при 275 кДа имеет два плеча при 295 и 251 кДа. По месту положения два из трех плохо разделенных пика могут соответствовать только тетрамерной форме ЛФ, в то время как третий пик с кажущейся мол. массой порядка 220 кДа может быть белковым тримером. Разделение тетрамерной формы белка на два пика может быть связано как с различной эффективностью взаимодействия различных тетрамерных форм ЛФ с сорбентом, так и возможностью различного типа укладки мономеров ЛФ при образовании тетрамера.

Как видно из рис. 11, согласно данным гель-хроматографии после инкубации ЛФ с олигосахаридом, белок в основном присутствует в растворе в виде мономера, димер проявляется в виде слабо выраженного плеча (150 кДа), небольшое количество ЛФ выходит в зоне тетрамера. Интересно, что добавление 0,15 М соли к раствору, содержащему олигосахарид, ведет к количественной димеризации белка, но уменьшению количества тетрамера.

В отсутствие соли, АТР лучше чем олигосахарид стимулирует образование димерной и тетрамерной форм ЛФ (рис. 12). Кроме того, становится заметным образование олигомера с мол. массой более 780 кДа. В то же время, в нейтральном буфере в присутствии АТР образование тетрамера происходит в существенно меньшей степени.

Рис. 11. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с олигосахаридом в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,15 M КСl

Рис. 12. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АТР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая)

Рис. 13. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АМР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая)

Особенно необычным оказалось поведение ЛФ в присутствии 50 мМ АМР. До добавления соли распределение различных форм ЛФ было сопоставимо с таковым для АТР, за исключением наличия декамерной (754 кДа) формы. Добавление 0,1 М KCl привело к резкому увеличению димерной формы ЛФ, практически полному исчезновению декамера, и исчезновению крупного олигомера с кажущейся мол. массой более 800 кДа (рис. 13). При этом, на профиле хроматографии появилась новая олигомерная форма ЛФ с мол. массой 359 кДа, соответствующая пентамеру. Повышение концентрации КСl до 0,15 М привело к разрушению пентамера и тетрамера и небольшому перераспределению ЛФ между димером и мономером.

С использованием данных гель-хроматографии были оценены массовые доли каждого из олигомеров, образующихся после инкубации ЛФ в различных условиях (табл. 5).

Таблица 5. Относительное содержание различных олигомерных форм ЛФ, образующихся при его инкубации в различных условиях, оцененное из данных гель-хроматографии

На основании данных Таблицы 5 можно выделить несколько закономерностей:

1) Инкубация ЛФ в буфере, не содержащем КСl и других соединений основной формой белка является тетрамер.

2) Добавление в раствор ЛФ 0,1 - 0.15 М КСl ведет к разрушению тетрамеров с образованием преимущественно димеров белка.

3) В отсутствие соли ATP, АМР и олигосахарид стимулируют образование в основном мономерной формы белка, и в меньшей степени его димера. Добавление соли в присутствии этих лигандов стимулирует образование димерной формы ЛФ и уменьшение тетрамерной формы белка.

4) В отсутствие соли только АМР стимулирует заметное образование декамера, а в присутствии 0,1 М КСl происходит образование необычной формы ЛФ, его пентамера.

Следует отметить, что пик белка, соответствующий олигомеру(ам) крупнее декамера (с мол. массой ? 780 -800 кДа) присутствовал в ряде реакционных смесей. Однако в случае анализа олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии он был маленьким во всех случаях кроме АTР и 0,1 М KCl. Учитывая это, во всех случаях содержание этого пика было принято близким к 0. Скорее всего, этот олигомер является неустойчивым и разрушается во время хроматографии.

Следует отметить, что все олигомеры ЛФ являются не очень стабильными и легко разрушаются при добавлении соли. Кроме того, нельзя было исключить, что часть олигомерных форм ЛФ может разрушаться при гель-хроматографии, а взаимодействие молекул ЛФ с сорбентом может стимулировать диссоциацию комплексов белка. Поскольку некоторые пики, соответствующие высокоолигомерным формам, относительно маленькие, а их уменьшение может быть связано с перераспределением белковой плотности между пиками представляется в процессе хроматографии, корректная оценка содержания с помощью гель-хроматографии высокоолигомерных форм белка в растворе представляется не возможной. Одним из методов оценки относительных размеров белков непосредственно в растворе является метод СР. Как указывалось выше, олигомеры ЛФ, содержащие от 1 до 4 мономерных единиц белка, должны относительно слабо рассеивать свет. В то же время, именно олигомерные формы, содержащие больше 4 субъединиц белка, должны вносить максимальный вклад в СР.

3.2 Анализ олигомеров ЛФ методом светорассеяния

В экспериментах по СР были использованы те же самые растворы ЛФ, что и для гель-хроматографии. Для каждого раствора были измерены индикатрисы СР (рис. 14). Экстраполируя индикатрисы СР к нулевому углу и пользуясь тем, что I(0)~N*M², можно оценить среднеквадратичную молекулярную массу в каждой из смесей (рис. 15).

Рис. 14. Анализ светорассеяния олигомерными формами ЛФ, полученными в разных условиях. ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 0,1 М КСl (кривая 1) и один из лигандов: 2 - 5 мМ олигосахарид, 3 - 50 мМ АТР, 4 - 50 мМ АМР

При получении данной оценки считалось, что ЛФ, инкубированный с олигосахаридом в 0,15 M KCl, имеет среднеквадратичную массу 145 кДа (согласно данным гель-хроматографии) и не содержит олигомерных форм большего тетрамера.

Рис. 15. Значения корней среднеквадратичных масс для всех исследованных растворов ЛФ. Серии из трех столбиков диаграммы соответствуют: 1 - олигосахарид, 2 - ЛФ в отсутствии лигандов, 3 - АТР, 4 - АМР. В каждой из серий столбики соответствуют: 1 - ЛФ в отсутствие соли, 2 - в присутствии 0,1 M КСl, 3 - в присутствии 0,15 M КСl

Оцененная таким образом среднеквадратичная масса олигомерных форм ЛФ оказалась во всех случаях больше массы, оцененной с помощью гель-хроматографии, а в некоторых случаях она была больше массы тетрамера. Это означает, что долю крупных олигомерных форм, не учтенных при гель-хроматографии (или диссоциировавших в ходе хроматографии), можно оценить с помощью СР.

Очевидно, что при ассоциации могут образовываться различные олигомерные формы ЛФ, содержащие более 4-х мономерных единиц, которые будут рассеивать свет. По данным гель-хроматографии АМР стимулирует достоверное образование декамера, который в присутствии соли диссоциирует до пентамера. По приблизительным оценкам олигомеры с кажущейся мол. массой больше 800 кДа, которые наблюдаются в ряде случаев, могут быть примерно 16-мерами. К сожалению, оценка относительного содержания ассоциатов с разной степенью олигомеризации на основании полученных данных не представляется возможной. В то же время, можно оценить примерное содержание какого-либо одного высокоолигомерного ассоциата, если предположить, что данный ассоциат - единственный крупный олигомер (декамер и больше). На основании численных данных, приведенных на рис. 15, был проведен теоретический анализ возможного содержания 10-мерного и 16-мерного ассоциатов ЛФ в анализируемых растворах белка. Полученные данные приведены в табл. 5.

Интересно, что согласно проведенному анализу данных СР декамер может присутствовать во всех смесях ЛФ, кроме белка инкубированного в буфере, содержащем 1 М КСl. В данной модели анализ теоретического содержания крупных олигомеров проводился путем сравнения с наименее олигомеризованной смесью - ЛФ с олигосахаридом в 0,15 М КСl, т.е. считалось что в данном растворе олигомерный состав соответствует гель-хроматографии). При этом содержание декамера эффективнее всего стимулируется и регистрируется хроматографически только при добавлении АМР, затем (игнорируя содержание более крупных форм даже и зарегистрированных гель-хроматографией) АТР и хуже всего олигосахарида. Добавление 0,1 М КСl приводит к уменьшению содержания в растворе высокоассоциированных форм ЛФ, кроме ЛФ инкубированного с АTP, в котором олигомеризация повышается (согласно гель-хроматографии за счет крупного олигомера, при разрушении тетрамера).

В случае предположения о содержании в растворе только 16-мера ЛФ численные значения уменьшаются примерно в 2-3 раза, но общие закономерности те же самые (Таблица 5).

Таким образом, данные СР свидетельствуют в пользу того, что в растворе, в отсутствие других лигандов, а также в присутствии АТР и АМР может происходить образование высокоолигомерных форм ЛФ, которые, по-видимому, не стабильны и разрушаются в процессе гель-хроматографии на Sepharose.

ЛФ - конформационно активный белок, который может по-разному изменять свою структуру в присутствии лигандов разного типа. Поэтому различная эффективность образования олигомеров различной степени олигомеризации и стабильности, обнаруженные с помощью данных СР и гель-хроматографии (табл. 5) может свидетельствовать в пользу того, что под действием разных лигандов и в их отсутствии образуются олигомеры с разным типом организации. В пользу того, что олигосахарид, АТР и АМР стимулируют образование олигомеров ЛФ разного типа свидетельствуют данные о различной стабильности белковых ассоциатов, образующихся в присутствии этих лигандов. Так согласно данным СР, олигомерные формы ЛФ, образованные в присутствии АТР, разрушаются до мономеров в присутствии 50 мМ MgCl2 в течение 25 мин. в то время как АМР-зависимые комплексы в этих условиях достаточно стабильны (данные не приводятся).

С помощью индикатрис светорассеяния можно так же оценить средний радиус инерции для набора частиц, содержащихся в каждом из растворов. рис. 14 приведены данные по СР растворами ЛФ, инкубированными в различных условиях. С помощью уравнения Гинье средний радиус инерции (Rg) для ЛФ, инкубированного с ATP в присутствии 0,1 M KCl составил 41 ± 3 нм, а для ЛФ инкубированного с AMP в 0,1 M KCl - 40 ± 3 нм. Эти величины существенно больше величины Rg = 26.7 Е, найденного с помощью МУРР для мономера ЛФ. Поскольку основной вклад в СР вносят крупные по размеру частицы, то эти значения Rg можно считать нижней оценкой размеров крупных олигомеров.

3.3 Анализ олигомеров ЛФ методом абляции

Одним из современных методов исследования мол. масс белков является МАЛДИ. Однако, этот метод исследования является достаточно жестким и при переходе нанесенных на носитель белков в газовую фазу происходит частичное разрушение белковых молекул. В связи с этим метод МАЛДИ не пригоден для исследования белковых олигомерных комплексов, в которых субъединицы обычно связаны слабыми нековалентными электростатическими, гидрофобными, Ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями. Метод абляции различных соединений с твердых подложек существенно мягче, чем МАЛДИ, по условиям переведения соединений в газовую фазу. В настоящее время сотрудниками ИЦиГ и ИКХиГ СО РАН показано, что пероксидаза хрена может быть аблирована из лиофилизованного состояния и при этом она сохраняет свою каталитическую активность.

В данной работе впервые были сделаны попытки проанализировать на примере комплексов ЛФ возможность анализа олигомерного состояния белков с помощью метода абляции. Сначала были проведены эксперименты по абляции некоторых стандартных белков из лиофилизованного состояния. В качестве подложки для лиофилизации использовали силуфольные пластины. Растворы белков наносили на поверхность пластин, содержащих слой силикагеля и на обратную - чистую сторону алюминиевой пластины. Образцы, нанесенные на пластины, замораживали над жидким азотом и затем подвергали абляции. Было показано, что абляция белков с поверхности, содержащей силикагель, приводит к появлению в спектре в основном частиц с мол. массой, соответствующей использованным белкам. В то же время использованные белки в этом случае подвергались частичной деструкции. В то же время при абляции белков с алюминиевой поверхности заметной деструкции белков не наблюдалось. Аналогичные данные были получены при абляции комплексов ЛФ с силуфольной и алюминиевой поверхности. На рис. 16 приведен спектр белковых частиц, соответствующий комплексу ЛФ после его инкубации в нейтральном буфере в отсутствии соли.

Основной формой ЛФ в случае силуфола (рис. 16а) является тетрамер; димер и мономер не разделились. Наличие частиц в спектре частиц с размером менее 5 нм позволяет предположить, что произошло разрушение не только олигомеров крупнее тетрамера, но так же и разрушение мономера.

Рис. 16. Абляция ЛФ инкубированного в буфере. а) ЛФ аблироавнный с силуфола, б) ЛФ аблированный с алюминиевой подложки

При абляции ЛФ с алюминиевой подложки (рис. 16б) и при меньшей интенсивности излучения, мономер и димер не были обнаружены, но удалось зарегистрировать крупные олигомеры с размером порядка 103 нм, что согласуется данными светорассеяния. При условии что еще более крупные олигомеры не «развалились», это может означать, что растворы ЛФ могут содержать ассоциаты типа 16-меров (или больше). Таким образом очевидно, что абляция с алюминиевой подложки более перспективна для исследования нековалентных олигомерных комплексов белков. В то же время нельзя исключить, что лиофилизация на алюминиевой подложке может вести к стабилизации высокоолигомерных комплексов ЛФ, что ведет к исчезновению комплексов меньшего размера, обнаруженных при абляции ЛФ с силуфола и методом гель-хроматографии. В то же время, обнаружение частиц с размером меньше 5 нм при абляции с силуфола может свидетельствовать в пользу разрушения высокоолигомерных комплексов ЛФ при их взаимодествии с силуфолом

3.4 Обсуждение результатов

В данной работе было проведено исследование олигомерных форм ЛФ с помощью четырех различных методов. Согласно литературным данным, ЛФ существует в виде двух основных олигомерных форм - мономера и тетрамера. С помощью метода гель-хроматографии в данной работе впервые показано, что в нейтральном буфере в отсутствии соли основной формой белка, устойчивой в условиях хроматографии на Sepharose, действительно является тетрамер, который эффективно диссоциирует до димеров и мономеров после добавления КСl (рис. 10). Нами также впервые показано, что что по данным гель-хроматографии природные лиганды ЛФ (олигосахарид, АТР и АМР) в отсутствие соли понижают степень олигомеризации ЛФ, стимулируя образование преимущественно димерной (АТР и АМР) или мономерной (олигосахарид) формы белка (рис. 11-13), одновременно (по данным СР) повышая сренеквадратичную массу (рис. 14) за счет образования крупных ассоциатов - декамера и предположительно 16 мера.

Интересно, что добавление КСl по-разному влияет на лиганд-зависимую олигомеризацию ЛФ. Олигосахарид в присутствии соли стимулирует образование димера (рис. 11), ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, и единственный повышает долю крупного олигомера (рис. 12), а в присутствии АМР происходит формирование димера и пентамера (рис. 13). Однако, это все касается форм ЛФ, в той или иной степени устойчивых в условиях гель-хроматографии. Следует полагать, что высокоолигомерные формы ЛФ, которые обнаружены в растворах белка с помощью СР, скорее всего, не устойчивы в условиях гель-хроматографии и разрушаются либо при контакте с сорбентом в самом начале хроматографического процесса, либо в процессе гель-хроматографии. В пользу такого разрушения может указывать наличие «длинного размазанного хвоста» у пика с мол. массой 754 кДа (рис. 13), соответствующего ЛФ, инкубированному с АМР в отсутствие соли. Данные по гель-хроматографии в целом плохо согласуются с данными СР, всегда показывая меньшую олигомеризацию.

Методом СР были обнаружены крупные олигомеры и оценены их радиусы инерции (рис. 14). Согласно этим данным в растворе ЛФ присутствует в гораздо более высокоолигомерном состоянии, чем следует из данных по гель-хроматографии. Согласно данным СP (рис. 15) все лиганды: олигосахарид < АТР < АМР, в отсутствие KCl стимулируют образование олигомерных форм ЛФ. При этом добавление KCl ведет к примерно одинаковому уменьшению степени олигомеризации ЛФ в буфере содержащем и не содержащем олигосахарид. В то же время, АТР-зависимая степень олигомеризации в присутствии 0,1 М КСl даже несколько больше, чем в отсутствии соли и слабо понижается при повышении концентрации соли до 0,15 М (рис. 16). Максимальный уровень олигомеризации, наблюдаемый в присутствии АМР, постепенно понижается после добавления 0,1 М КСl, а затем 0,15 М соли. Однако, он остается высоким и сопоставимым с таковым для ЛФ в отсутствие соли и других лигандов, даже при добавлении 0,15 М КСl (рис. 15). Это свидетельствует о том, что олигомерные формы ЛФ, существующие в растворе, не стабильны и разрушаются при контакте с Sepharose 4В в процессе гель-хроматографии.

Данные по оценке олигомерных форм с помощью абляции лиофилизованных препаратов ЛФ с алюминиевой подложки также могут свидетельствовать в пользу наличия в растворе высокоолигомерных форм ЛФ по размеру соответствующих как минимум 16-меру. В целом, данные СР и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие крупных олигомеров.

Основные результаты

1. Методом гель-хроматографии впервые проведен анализ олигомерных форм лактоферрина (ЛФ), которые образуются под действием его природных лигандов. Показано, что в нейтральном буфере при низкой ионной силе основной формой лактоферрина, устойчивой в условиях хроматографии, является тетрамер, диссоциирующий до димеров и мономеров после добавления 0,1 М КСl. АТР и АМР в отсутствие соли стимулируют образование преимущественно димерной, а олигосахарид - мономерной формы белка. Олигосахарид в присутствии соли КСl стимулирует образование димера, ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, а в присутствии АМР происходит формирование димера и необычной формы лактоферрина - пентамера.

2. Методом светорассеяния исследована эффективность образования олигомеров в присутствии и отсутствии различных лигандов и показано, что лактоферрин в присутствии АТР и АМР образует высокоолигомерные формы. Согласно средним радиусам инерции этих олигомеров они могут содержать в своем составе до 10 и более мономеров ЛФ.

3. Впервые исследованы олигомерные формы лактоферрина методом лазерной абляции. Данные светорассеяния и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие в растворах лактоферрина крупных по размеру олигомеров лактоферрина. Сравнение данных гель-хроматографии, светорассеяния и лазерной абляции свидетельствует в пользу того, что высокоолигомерные формы лактоферрина могут разрушаются при их контакте с сорбентом в процессе хроматографии.