Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дипломная работа

Разработка методики количественного определения ампицилина в таблетках по реакции с дипероксикарбоновой кислотой

Содержание

Введение

Глава 1.

1.1 Химиотерапевтические средства. Антибиотики

1.1.1 Пенициллины, химическая структура и методы получения

1.1.2 Промышленный синтез ампициллина

1.1.3 Общая физико-химическая характеристика пенициллинов и их применение в медицине

Ампициллин

Ампициллина натриевая соль

1.2 Биологические методы анализа антибиотиков

1.3 Фармакопейный анализ пенициллинов (общие методы)

1.3.1 Методы количественного определения ампициллина

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Методы измерения и реактивы

2.2 Полученные результаты и их обсуждение

Выводы

Литература

Введение

Несмотря на появление новых групп противомикробных лекарственных средств, антибиотические препараты продолжают занимать важное место в терапии инфекционных заболеваний и сегодня. В частности, среди производимых в Украине лекарственных форм пенициллинов, широкое распространение приобрел стойкий к гидролизу полусинтетический препарат - ампициллин. Благодаря дополнительной активности по отношению к граммнегативной флоры, на которую не действует препарат природного происхождения бензилпенициллин, он считается антибиотиком широкого спектра действия, пригодным для применения per os при заболеваниях вызванных смешанной инфекцией.

Данная работа посвящена разработке принципиально новой методики количественного определения ампициллина тригидрата и ампициллина натриевой соли в готовых лекарственных формах, основанная на реакциях окисления и пергидролиза их посредством нового реагента дипероксидикарбоновых кислот.

Глава 1

1.1 Химиотерапевтические средства. Антибиотики

Начало применения в медицинской практике пенициллина (1940-1941 гг.) открыло новую эру в лечении инфекционных болезней. Стало возможным эффективно и относительно быстро лечить пневмонию, эмпиему плевры, абсцесс легкого, кишечные инфекции, пиелонефрит, перитонит, раневые и другие инфекции. Вслед за пенициллином быстро стали появляться другие антибиотики. Оказалось, что продуцентами антибиотиков являются не только плесневые грибы ряда Penicillium, но также лучистые и другие грибы. В 1943 г. из лучистого гриба Ctreptomyces globisporus был выделен стрептомицин (и впервые введен термин антибиотик; (С. Ваксман). Из Ctreptomyces Aurepfaciens был выделен первый тетрациклиновый антибиотик - ауреомицин (хлортетрациклин). Из гриба Cephalosporinum acremonium был выделен первый цефалоспориновый антибиотик (цефалоспорин С) и т.д.

В дальнейшем стали получать не только природные, но и полусинтетические антибиотики, меняя структуру природных антибиотиков, а отдельные антибиотики получать путем полного химического синтеза.

Широкие исследования по созданию новых антибиотиков имели целью:

а) получения средств, еще более активных, чем пенициллин, с более широким спектром противомикробного действия и соответственно эффективных при более широком круге заболеваний;

б) получение средств, устойчивых к действию желудочного сока и эффективных (в отличие от бензилпенициллина) не только при парентеральном, но и при пероральном применении;

в) получение антибиотиков, действующих на микроорганизмы, устойчивые к действию пенициллина (а также других антибиотиков).

Как оказалось, при повторном применении пенициллина относительно быстро появляются резистентные штаммы микроорганизмов, устойчивых к действию антибиотика. Выяснилось, что развитие резистентности связано в основном с выработкой микроорганизмами специфических ферментов, разрушающих молекулы антибиотиков и лишающих их антимикробной активности. Возникла необходимость в преодолении развития устойчивости микроорганизмов и эта задача была в определенной мере решена созданием антибиотиков с модифицированными молекулами и комбинированных препаратов, сочетающих антибиотики с соединениями, инактивирующими эти ферменты.

В результате проведенных работ медицинская практика располагает в настоящее время десятками высокоэффективных антибиотиков [1,2].

Первоначально антибиотики делили на группы исходя из источников их выделения (пенициллины, стрептомицины, цефалоспорины и др.) или их химического строения (тетрациклины, аминогликозиды, макролиды, полиеновые). Современная классификация предусматривает их деление на следующие группы 1-5]:

а) -лактамы

б) Аминогликозиды

в) Тетрациклины

г) Макролиды и азалиды

д) Линкомицины

е) Препараты группы левомицина

ж) Полимиксины

з) Антибиотика разных групп

В отдельные группы выделились: а) противотуберкулезные антибиотики; б) противогрибковые антибиотики; в) противоопухолевые антибиотики.

Непрерывно продолжается поиск и изучение новых антибиотиков [6].

а) -Лактамы

К -лактамам относится большая группа антибиотиков, молекулы которых содержат -лактамное кольцо (пенициллины, цефалоспорины, цефамицины, карбапенемы, монобактамы и др.).

Общая структура лактамного кольца

Все они обладают высокой антимикробной активностью, однако ко многим из них относительно быстро развивается устойчивость микроорганизмов, обусловленная выработкой ими специфических ферментов -лактамаз (пенициллиназ), гидролизующих -лактамное кольцо антибиотиков, что лишает их антимикробной активности и приводит к развитию резистентных штаммов микроорганизмов.

Некоторые -лактамные антибиотики, полученные полусинтетическим путем (оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин, метициллин и другие пенициллины, новые поколения цефалоспоринов и др.) устойчивы в отношении -лактамаз и действуют на штаммы резистентных микроорганизмов.

В последнее время созданы специфические ингибиторы -лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам), комбинированное применение которых с антибиотиками, повышает устойчивость и активность последних.

Эти соединения подобно -лактамным антибиотикам содержат лактамное кольцо (см. формулы бензилпенициллина и других пенициллинов, цефалоспоринов и др.). Они захватываются -лактамазами, следствием чего является необратимое ингибирование этих ферментов и при сочетании их с антибиотиками последние имеют возможность полностью проявлять свое антимикробное действие; их активность и спектр действия даже несколько увеличивается.

Сами ингибиторы -лактамаз обладают весьма слабой антимикробной активностью.

На основе использования ингибиторов -лактамаз в последнее время создан ряд высокоэффективных комбинированных антибиотических препаратов (уназин, аутментин, тазоцим и др.) [6].

1.1.1 Пенициллины, химическая структура и методы получения

Структурной основой лекарственных препаратов природных и полусинтетических пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, которая включает конденсированные тиазолидиновый (А) и лактамный (В) циклы:

Лактамный цикл впервые обнаружен в природных пенициллинах и отличается большой лабильностью к воздействию различных факторов.

Специфичность биологической активности пенициллинов прежде всего обусловлена наличием в молекуле тиазолидинового и в-лактамного циклов. Расщепление одного из них приводит к полной потере активности. Важная роль в сохранении антибактериальной активности принадлежит также пространственной конфигурации молекул пенициллинов. Характер группировок, присоединенных к гетероциклической системе в положениях 2 и 3, не оказывает заметного влияния на биологическую активность. Различную химическую структуру может иметь радикал, замещающий атом водорода в аминогруппе, которая присоединена к лактамному циклу в положении 6. Это позволило получить ряд высокоактивных полусинтетических аналогов более устойчивых, чем природный пенициллин.

Получение большинства природных антибиотиков основано на биосинтезе, осуществляемом в клетке микроорганизма. Микробная клетка выполняет роль сложнейшей химической лаборатории, в которой происходят очень тонкие процессы, не доступные пока для органического синтеза. Причем для их проведения не требуется новых высоких температур, повышенного давления, катализаторов.

Получение антибиотиков с помощью микробиологического синтеза включает такие основные этапы, как изыскание высокопроизводительных штаммов продуцентов, подбор питательных сред, процесс ферментации, выделение и очистку антибиотика.

Для производства антибиотиков очень важно изыскание высокопроизводительных штаммов микроорганизмов - антагонистов, которые образуют вещества, бактериостатически действующие на болезнетворные микробы. Отобранные наиболее активные образцы подвергают селекции. Чаще всего используют искусственную мутацию, действуя на природный продуцент различными физическими факторами (ультрафиолетовым, рентгеновским излучение, быстрыми нейтронами) или химическими веществами. В результате воздействия этими мутагенами можно получить штамм, который продуцирует в десятки и даже в сотни баз больше антибиотика, чем исходный (природный).

Биосинтез выполняют в специальных аппаратах - ферментерах вместимостью в несколько десятков тысяч литров. Ферментацию проводят глубинным способом, который заключается в том, что рост плесени и образование антибиотика происходит по всей толще ферментационной массы. Каждый из микроорганизмов требует специальных условий ферментации: температуры, подачи воздуха (аэрации), определенной продолжительности процесса. Для обеспечения жизнедеятельности микроорганизма и максимального накопления антибиотика необходимы специальные питательные среды. Регулируя качественный и количественный состав ингредиентов питательных сред, можно существенно влиять на выход антибиотика. Питательные среды вначале подают в посевные аппараты (через установки непрерывной стерилизации). Здесь происходит выращивание культур. Затем смесь культуры и питательной среды перемещают в ферментер, где происходит процесс биосинтеза. В ферментер добавляют также пеногасители во избежании образования пены при аэрации.

Антибиотики выделяют из культуральной жидкости осаждением, с помощью адсорбционной или ионообменной хроматографии, экстракцией различными органическими растворителями или при различных значениях рН среды. Очистку антибиотика-сырца осуществляют хроматографическим методом или противоточной экстракцией с последующей перекристаллизацией. Выделенный кристаллический антибиотик подвергают тщательному химическому и биологическому контролю. Весь процесс производства антибиотиков осуществляют в строго соблюдаемых асептических условиях.

Отобранные для микробиологического синтеза в результате селекции промышленные штаммы плесени позволяют получать более 3 мг/мл бензилпенициллина за 90 - 120 ч ферментации, что в сотни раз больше, чем удавалось получать пенициллина из природных штаммов. В состав питательной среды обычно входит 1 - 4 % кукурузного экстракта, 3 - 5 % лактозы, 1 - 2 % глюкозы, 0,2 - 0,5 % животного или растительного жира, небольшие количества минеральных солей. Обязательным компонентом является предшественник, химическая структура которого сходна с соответствующим данному антибиотику радикалу в положении 6. В частности, при производстве бензилпенициллина предшественником служит фенилуксусная кислота или ее производные; для биосинтеза феноксиметилпенициллина - феноксиуксусная кислота и т. д.

Исследование биосинтеза пенициллина с помощью меченых соединений позволило установить, что формирование молекулы осуществляется за счет содержащихся в питательной среде аминокислот (цистеина, валина) и соответствующих предшественников.

Схема биосинтеза молекулы бензилпенициллина заключается в следующем:

Процесс биосинтеза пенициллинов происходит в асептических условиях при непрерывной аэрации воздухом, температуре около 24С, рН 6,0-6,5 и должен сопровождаться постоянным перемешиванием. Наличие жира в питательной среде оказывает пеногасящее действие и одновременно стимулирует процесс биосинтеза пенициллинов.

Выделение пенициллина из культуральной жидкости осуществляют фильтрованием или центрифугированием. Вначале мицелий и нерастворимые миниральные соли отделяют от культуральной жидкости. Очистку культуральной жидкости и выделение из нее пенициллина последовательно проводят способом замены растворителя (табл. 1).

Таблица 1

Схема очистки способом замены растворителя

Растворитель	рН	Форма пенициллина
Культуральная жидкость (растворитель - вода) Амилацетат или бутилацетат Буферный раствор (гидрокарбаната натрия) Хлороформ и раствор соляной кислоты Буферный раствор (гидрокарбоната натрия)	6,0 - 6,5 6,0 - 6,5 7,0 2,0 7,0	Пенициллин-кислота и балластные вещества Экстракт пенициллина-кислоты и балластные вещества Водный раствор натриевой соли пенициллина с примесью балластных веществ Экстракт пенициллина-кислоты Водный раствор натриевой соли пенициллина, свободный от балластных веществ

Отделяют пенициллины друг от друга различными способами: адсорбционной хроматографией (на активированном угле или оксиде алюминия); распределительной хроматографией (на силикагеле) или противоточным распределением. Воду из растворов удаляют при температуре от -20 до -30 С и глубоком вакууме (лиофильная сушка) или пользуясь распылительной сушилкой, что позволяет предотвратить разложение. Кристаллические соли высокой степени чистоты получают перекристаллизацией из органических растворителей.

Бензилпенициллин и созданные на его основе многочисленные лекарственные формы отличаются наиболее высокой химиотерапевтической эффективностью и наименьшей токсичностью. Однако в-лактамный цикл бензилпенициллина легко разрушается под действием фермента пенициллиназы (в-лактамазы), продуцируемой многими микроорганизмами. Эти обстоятельства послужили предпосылкой создания полусинтетических пенициллинов. Решение такой сложной проблемы стало возможным после выделения в 1957 г. 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК), являющейся ядром пенициллина. Получают 60АПК из бензилпенициллина (или других пенициллинов), воздействуя ферментом пенициллинацилазой, продуцируемым бактериями. Реже используют химические методы расщепления пенициллинов до 60АПК. Процесс происходит по схеме:

Извлекают 6-АПК из водного гидролиза экстракцией или с помощью ионообменной хроматографии.

На основе 6-АПК синтезировано большое количество полусинтетических пенициллинов, представляющих собой ацильные производные. В качестве ацилирующих агентов используют хлорангидриды карбоновых кислот:



Некоторые из синтезированных полусинтетических пенициллинов, сохраняя высокую эффективность и низкую токсичность бензилпенициллина, приобрели новые качества, например повышение устойчивости и расширение спектра действия.

В результате разработаны и внедрены в производство такие полусинтетические пенициллины, как метициллин, оксациллин, ампициллин, карбенициллин, диклоксссациллин, карфециллин и др.

Общая формула природных и полусинтетических пенициллинов:

В настоящее время из многочисленных известных природных пенициллинов медицинское применение имеет натриевая, калиевая, новокаиновая соли бензилпенициллина и феноксиметилпенициллин. Полусинтетические пенициллины характеризуются наличием в молекуле ароматического или гетероциклического радикала. Из них наиболее широко применяют метициллин, ампициллин и оксациллин (табл. 2) [1,2].



Таблица 2

Химическая структура пенициллинов

Радикал R	Пенициллин	Радикал R	Пенициллин
Природные:	Полусинтетические:
	Бензилпенициллин Феноксиметилпенициллин		Метициллин Ампициллин Оксациллн

1.1.2 Промышленный синтез ампициллина

Промышленый синтез различных пенициллинов проводят путем взаимодействия получаемой из культур плесневого грибка Penicillium chrysogenum 6-аминопенициллановой кислоты с различными карбоксилактивированными кислотними компонентами [7].

Аминогруппа блокируется путем превращения в гидрохлоридную, поэтому при образовании хлорангидрида кислоты взаимодействием с PCl₅ амид не образуется.

Через суспензию 15,1 г (100 ммоль) (-)-D-б-аминофенилуксусной кислоты в 250 мл безводного хлороформа в течение 30 мин пропускают при 5-10°С и перемешивании сильный ток (~5 пузырьков сек) безводного хлороводорода (предварительного просушенного через конц. Н₂SO₄). Затем добавляют порциями при перемешивании 30,2 г (145 ммоль) сильно измельченного пентахлорида фосфора и перемешивают 5 ч при 0-10°С (охлаждение льдом).

Выпавший хлорангидрид кислоты отсасывают на стеклянном фильтре без доступа влаги, тщательно промывают 150 мл безводного СН₂Cl₂ (90%) продукта в виде бесцветных кристаллов.

1. Взаимодействие аминопенициллановой кислоты с триметилхлорсиланом, в результате чого в один прием блокируется карбоксильная группа (за сет образования триметилсилилового эфира (чувствителен к влаге), а аминогруппа активируется, превращаясь в триметилиламиногруппу.

2. Образование амида кислоты из хлорангидрида угольной кислоты и силилированного амина с отщеплением триметилсилильной группы.

К перемешиваемой, охлажденной до 0°С суспензия 5,41 г (25,0 ммоль) 6-аминопенициллановой кислоты в 100 мл безводного дихлорметана добавляют последовательно 5,06 г (50,0 ммоль, ~ 7 мл) безводного триэтиламина. 3,03 г (20,5 ммоль, ~ 3,1 мл) безводного N,N-диметиланалина и затем по каплям 5,43 г (50,0 ммоль, ~ 6,3 мл) триметилхлорсилана. После этого смесь в течение 2 ч кипятят с обратным холодильником. К охлажденной, обычно мутной реакционной смеси добавляют без доступа влаги при 5°С небольшими порциями 6,18 г (30,0 ммоль) гидрохлорида (-)-D-б-аминофенилацетилхлорида и перемешивают в течение 30 мин, поддерживая температуру от 5 до 10°С. При этой и последующих операциях она не должна превышать 10°С, в противном случае в-лактамное кольцо размыкается.

Далее к реакционной смеси добавляют 15 мл ледяной воды. Образуется прозрачный раствор, разделяющийся на две фазы. Водную фазу отделяют, органическую фазу экстрагируют ледяной водой (215 мл) и объединенные водные фазы (45 мл) промывают 20 мл дихлорметана, охлажденного ледяной водой. Полученный водный раствор с температурой 0°С очищают, смешивая его с 10 г силикагеля, и фильтруют. К фильтрату (в химическом стакане на 250 мл) в течение 20 мин прикапывают при охлаждении льдом, перемешивании и контроле калиброванным стеклянным электродом при температуре 5°С, охлажденный льдом 2 М NaOH до рН 4,4-4,6. В ходе этой операции при рН 2,5 наблюдается выпадение студенистых кристаллов; при последующем добавлении NaOH раствор мутнеет и часто выпадает тригидрат ампициллина, хотя значения рН 4,4-4,6 еще не достигнуты. В этом случае увеличивают скорость перемешивания, промывают электрод небольшим количеством воды и осторожно добавляют 2 М NaOH до получения требуемого рН.

Образовавшуюся суспензию кристаллов выдерживают 14 ч при 0-5°С в холодильнике и отсасывают на стеклянном фильтре. Остаток на фильтре промывают последовательно ледяной водой и ацетоном. После высушивания в сушильном шкафу в течение 12 ч при 40°С получают 6,50 г (40%) тригидрата ампициллина в виде бесцветного мелкокристаллического порошка.

ИК(KBr): 1775, 1690, 1625 (C=O), 1605, 1495 см^-1.

¹H ЯМР(D₂O + немного DCl): 7,49 (с; 5 Н, аром. Н), 5,51 (с; 2 Н, N - CH - CH ), 5,23 (c; 1 Н, Ph - CH), 4,88 (HDO), 4,45 (c; 4,45 (c; 1 H, N - CH - COO), 1,43 ( c; 3 H, CH₃), 1,40(c; 3 H, CH₃). [8].

1.1.3 Общая физико-химическая характеристика пенициллинов и их применение в медицине

По физическим свойствам препараты природных пенициллинов и их синтетические аналоги представляют собой белые кристаллические порошки без запаха, горького или кисловато-горького (феноксиметилпенициллин) вкуса. Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина слегка гигроскопичны, феноксиметилпенициллин негигроскопичен.

Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина, метициллина и оксациллина очень легко или легко растворимы в воде. Новокаиновая соль бензилпенициллина, феноксиметилпенициллина и ампициллин мало или очень мало растворимы в воде. Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина растворимы в этиловом и метиловом спиртах, а натриевые соли метициллина и оксациллина трудно растворимы в спирте, практически нерастворимы в эфире. Ампициллин практически нерастворим в органических растворителях.

Важная физическая константа препаратов пенициллинов - удельное вращение водных или спиртовых растворов. Все они вращают плоскость поляризованного луча вправо.

1.1.3.1 Ампициллин

6-D(-)-б-Аминофенилацетамидо-пенициллановая кислота:

СИНОНИМЫ ампициллина и его натриевой соли: Амплитал, Декапен, Зетсил, Кампициллин, Месциллин, Пенодил, Пентарцин, Пентрексил, Росцилин, Стандациллин, Эпикоциллин, Abetathen,Acidocyclin, Acilin, Acrocilin, Agnopen, Albercilin, Amcil, Amecilin, Ampen, Bactipen, Binotal, Campicillin, Cimexillin, Diaciclin, Dicillin, Grampenil, Lificillin, Maxxibiotic, Maxipred, Opicilin, Pentrex, Pentrexyl, Policilin, Sintelin, Synpenin, Totacillin, Ultrabion, Vampen, Vidopen, Zymopen и др.

Мелкокристаллический порошок белого цвета, горький на вкус; устойчив в кислой среде. Мало растворим в воде, практически не растворим в спирте.

Препарат не разрушается в кислой среде желудка, хорошо всасывается при приеме внутрь.

Активен в отношении грамположительных микроорганизмов, на которые действует бензилпенициллин. Кроме того, он действует на ряд грамотрицательных микроорганизмов сальмонеллы, шигеллы, протей, кишечная палочка, клебсиелла пневмонии (палочка Фридлендера), палочка Пфейффера (палочка инфлюэнцы) и поэтому рассматривается как антибиотик широкого спектра действия и применяется при заболеваниях, вызванных смешанной инфекцией.

На пенициллиназообразующие стафилококки, устойчивые к бензилпенициллину, ампициллин не действует, так как разрушается пенициллиназой.

Применяют ампициллин для лечения больных пневмониями, бронхопневмониями, с абсцессами легких, ангиной, перитонитом, холециститом, сепсисом, кишечными инфекциями, при послеоперационных инфекциях мягких тканей и при других инфекциях, вызванных чувствительными к нему микроорганизмами. Препарат обладает высокой эффективностью при инфекциях мочевых путей, вызванных кишечной палочкой, протеем, энтерококками или смешанной инфекцией, так как он выделяется в неизмененном виде с мочой в высоких концентрациях, В больших количествах ампициллин поступает также в желчь. Препарат эффективен при лечении гонореи.

Назначают внутрь (независимо от приема пищи). Разовая доза для взрослых 0,5 г, суточная 2-3 г. Детям назначают из расчета 100 мг/кг в сутки. Суточную дозу делят на 4-6 приемов.

Продолжительность лечения зависит от тяжести болезни и эффективности терапии (от 5-10 дней до 2-3 недель и более).

При лечении ампициллином могут наблюдаться аллергические реакции в виде кожной сыпи, крапивницы, отека Квинке и др., в редких случаях - анафилактический шок (главным образом при введении натриевой соли ампициллина).

В случае возникновения аллергических реакций необходимо прекратить введение препарата и провести десенсибилизирующую терапию. При появлении признаков анафилактического шока должны быть приняты срочные меры для выведения больного из этого состояния.

При длительном лечении ампициллином у ослабленных больных возможно развитие суперинфекции, вызванной устойчивыми к препарату микроорганизмами (дрожжеподобные грибы, грамотрицательные микроорганизмы). Этим больным целесообразно одновременно назначить витамины группы В и витамин С, при необходимости - нистатин или леворин.

Препарат противопоказан при повышенной чувствительности к пенициллину. При печеночной недостаточности применяют под контролем функции печени; при бронхиальной астме, сенной лихорадке и других аллергических заболеваниях в необходимых случаях одновременно назначают десенсибилизирующие средства.

Ампициллин усиливает действие пероральных антикоагулянтов.

ФОРМА ВЫПУСКА: таблетки и капсулы по 0,25 г.

ХРАНЕНИЕ: список Б.

1.1.3.2 Ампициллина натриевая соль

Натриевая соль 6D-(-)-б-аминофенил-ацетамидо-пенициллановой кислоты:



СИНОНИМЫ: см. Ампициллин.

Порошок или пористая масса белого (или с кремовым оттенком) цвета, горькая на вкус. Легко растворима в воде, растворима в спирте. Гигроскопична.

Химиотерапевтическая активность и показания к применению такие же, как для ампициллина.

Применяется для внутримышечного и внутривенного (струйно или капельно) введения.

При обоих путях введения разовая доза препарата для взрослых 0,25-0,5 г, суточная 1-3 г. При тяжелых инфекциях суточная доза может быть увеличена до 10 г и более. Новорожденным препарат назначают в суточной дозе 100 мг/кг, детям остальных возрастных групп - 50 мг/кг. При тяжелом течении инфекционного заболевания указанные дозы могут быть удвоены. Суточную дозу вводят в 4-6 приемов.

Раствор для внутримышечного введения готовят ex tempore, добавляя к содержимому флакона (0,25 или 0,5 г) 2 мл стерильной воды для инъекций. Длительность лечения составляет 7-14 дней и более.

Для внутривенного струйного введения разовую дозу препарата (не более 2 г) растворяют в 5-10 мл стерильной воды для инъекций или изотонического раствора натрия хлорида и вводят медленно в течение 3-5 мин (1-2 г в течение 10-15 мин). При разовой дозе, превышающей 2 г, препарат вводят внутривенно капельно. Для этого разовую дозу препарата (2-4 г) растворяют в небольшом объеме стерильной воды для инъекций (7,5-15,0 мл соответственно), затем полученный раствор антибиотика добавляют к 125-250 мл изотонического раствора натрия хлорида или 5-10% раствора глюкозы и вводят со скоростью 60-80 капель в минуту. При капельном введении в качестве растворителя применяют 5-10% раствор глюкозы (30-50 мл в зависимости от возраста). Растворы используют сразу после приготовления; недопустимо добавление к ним других лекарственных препаратов. Суточную дозу распределяют на 3-4 введения. Продолжительность лечения 5-7 дней с последующим переходом (при необходимости) на внутримышечное введение.

Возможные осложнения и противопоказания такие же, как для ампициллина.

ФОРМА ВЫПУСКА: порошок в герметически укупоренных флаконах по 0,25 и 0,5 г.

ХРАНЕНИЕ: список Б.

1.2 Биологические методы анализа антибиотиков

Количественное определение большинства антибиотиков осуществляют биологическим методом, основанным на сравнительной оценке угнетения роста тест-микроорганизмов (определенный штамм золотистого стафилококка). Активность устанавливают диффузионным или турбидиметрическим методами. ГФ Х рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, заключающийся в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм. Рабочие стандарты, отвечающие международным стандартам, приготавливают в Государственном контрольном институте медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Их выпускают в запаянных ампулах нейтрального стекла и хранят при температуре не выше 0 С.

Поскольку состав агаровой среды и условия выполнения биологического испытания одинаковы, величина зоны диффузии (в которой развитие тест-микроорганизма подавляется антибиотиком) зависит только от химической природы антибиотика и его концентрации. Процесс инкубации осуществляют в течение 16 - 18 ч при 36 - 38 С.

При определении биологической активности методом диффузии в агар необходимо, чтобы зона задержки роста была достаточного диаметра и имела четкие границы. После завершения инкубации измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроорганизма стандартным и испытуемым растворами. Для повышения точности измерений находят среднее значение площадей зон диффузии из трех опытов. При изучении зон задержки роста и четкости краев перспективно применение микрофотометра марки ИФО-451. Это позволяет получать более объективные количественные оценки результатов микробиологического анализа.

Расчет биологической активности производят по стандартной кривой, предварительно построенной на основании результатов определения пяти концентраций стандартного препарата. Умножением полученной концентрации (в ЕД/мл) на степень разведения вычисляют активность (содержание ЕД) антибиотика в 1 мг препарата.

Единица действия (ЕД) - представляет собой меру, которой выражается биологическая активность антибиотиков. За ЕД принимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды. Количественное выражение 1 ЕД отличается у различных антибиотиков. Например, у натриевой соли бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химически чистого вещества (1670 ЕД в 1 мг), а у стрептомицина основания, тетрациклина и его производных 1 ЕД соответствует 1 мкг химически чистого вещества.

Микробиологический метод определения пенициллинов дает воспроизводимость результатов 5 - 10 %.

Среднее значение активности, найденное биологическим методом, несколько ниже, чем теоретическая активность. В соответствующих фармакопейных статьях приведены значения теоретической активности и нижний допустимый предел активности испытуемого антибиотика (в ЕД/мг).

Как правило, нормативно-технической документацией (ГФ, ФС, ВФС) предусматривается содержание в одном флаконе не менее 90 % и не более 110 % от количества антибиотика (в мг), указанного на этикетке.

В последние годы разработаны ускоренные биологические методы определения антибиотиков в биологических жидкостях.

Для установления концентрации антибиотиков аминогликозидов в крови больных применяют модифицированный метод диффузии в агар. Ускорение определения (вместе 16 - 18 ч до 2 - 6 ч) достигается за счет создания максимально благоприятных условий для роста тест-микроорганизмов (уменьшения слоя питательной среды, оптимизации температуры инкубации и т.д.). Метод прост, но неспецифичен, если в сыворотке крови присутствует несколько антибиотиков.

К ускоренным микробиологическим методам относят методы, основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест-микроорганизмов. Концентрацию определяют сравнением изменений рН в средах испытуемых и стандартных образцов через 1,5 ч после начала инкубации. На этом принципе основан так называемый уреазный метод, заключающийся в наблюдении за изменением рН жидкой питательной среды, содержащей 2 % моче.

1.3 Фармакопейный анализ пенициллинов (общие методы)

Для испытания подлинности препаратов пенициллинов и их полусинтетических аналогов (за исключением метициллина натриевой соли) используют цветную реакцию, основанную на разрыве в-лактамного цикла и образовании медной соли гидроксамовой кислоты (осадок зеленого цвета):

С солями железа (ЙЙЙ) гидроксамовая кислота образует внутрикомплекс-ные соли красного цвета.

В препаратах пенициллинов можно обнаружить органически связанную серу после превращения ее сульфид-ион сплавлением с едкими щелочами.

В солях бензилпенициллина, метициллина и оксициллина открывают ион натрия, а в калиевой соли бензилпенициллина )после минирализации - ион калия. Новокаиновая соль бензилпенициллина должна давать положительную реакцию на первичную ароматическую аминогруппу.

Подлинность фармакопейных препаратов пенициллинов подтверждают также с помощью УФ- и ИК-спектрофотометрии. ГФ Х и ВФС рекомендуют устанавливать значения оптических плотностей растворов солей бензилпенициллина при длинах волн 280 и 263 нм; метициллина - при 280 и 264 нм; феноксиметилпенициллина - при 268 и 274 нм. Для растворов ампициллина устанавливают значения оптических плотностей в максимумах (256, 261, 267 нм) и минимумах (255, 260, 266 нм) поглощения. ИК-спектры ампициллина, натриевых солей метициллина и оксациллина идентифицируют по совпадению с максимумами светопоглощения соответствующих стандартных образцов.

Пенициллины под влиянием разбавленных минеральных кислот разлагаются с образованием пинициламина и пенальдиновой кислоты, которая декарбоксилирует до пенилового альдегида:

Гидролизат дает характерные реакции на аминокислоты и альдегиды.

Так, препараты природного пенициллина отличают друг от друга по различной окраске продуктов реакции с хромотроповой кислотой в присутствии концентрированной серной кислоты. Ампициллин при взаимодействии с реактивом Фелинга приобретает фиолетовое окрашивание.

В соответствии с требованиями ГФ Х препараты пенициллинов и их полусинтетических аналогов подвергают испытаниям на токсичность, пирогенность, стерильность (ГФ Х, с. 952, 953, 956), а натриевую и калиевую соли бензилпенициллина - также на термостабильность (ГФ Х, с. 981).

Количественное определение по ГФ Х состоит из двух этапов: определения сумы пенициллинов и установления содержания соответствующего препарата.

При анализе препаратов природных пенициллинов (натриевой, калиевой, новокаиновой солей бензилпенициллина и феноксиметил-пенициллина) сумму пенициллинов определяют иодометрическим методом (ГФ Х, с. 980). Сущность способа заключается в том, что продукт инактивации пенициллина (1 н. раствором гидроксида натрия при комнатной температуре) - натриевую соль пенициллоиновой кислоты - окисляют йодом. Процесс окисления необходимо проводить при рН 4,5 (ацетатный буфер).

Схема инактивации и окисления на примере бензилпенициллина:

Сумму полусинтетических пенициллинов в натриевых солях метициллина и оксациллина определяют способом, в основе которого лежит количественно происходящий при нагревании на водяной бане процесс инактивации препаратов 0,1 н. раствором гидроксида натрия до образования производных пенициллоиновой кислоты:

Избыток гидроксида натрия оттитровывают 0,1 н. раствором соляной кислоты (индикатор фенолфталеин).

Второй этап количественного определения - установление содержания соответствующего препарата - выполняют при анализе натриевой, калиевой и новокаиновой солей бензилпенициллина гравиметрическим методом. Бензилпенициллин извлекают амилацетатом и количественно осаждают в виде N-этилпиперидиновой соли:



Спектрофотометрический метод включен в ВФС на некоторые полусинтетические препараты пенициллина, в частности на ампициллин. Расчет концентрации производят после параллельного определения в тех же условиях оптической плотности стандартного образца.

Осадок N-этилпиперидиновой соли бензилпенициллина промывают, высушивают до постоянной массы и взвешивают. Затем делают пересчет на соответствующую соль (ГФ Х, с. 979).

Алкалиметрический метод определения суммы пенициллинов имеет удовлетворительную воспроизводимость, но дает завышенные результаты, так как одновременно титруются все примеси, взаимодействующие со щелочью.

Наиболее точные, сопоставимые с микробиологическим методом результаты дает спектрофотометрическое определение бензилпенициллина, основанное на его гидролизе в кислых буферных растворах до бензилпеницилленовой кислоты. Она имеет максимум светопоглащения при 322,5 нм. Присутствие ионов меди (II) повышает чувствительность реакции и воспроизводимость результатов определения.

Этот способ определения рекомендован для количественной оценки полусинтетических пенициллинов: метициллина, ампициллина, оксациллина, карбенициллина, диклоксациллина идр. Полупродукты синтеза и продукты инактивации не мешают определению.

Общая схема гидролиза пенициллинов в кислой среде с образованием пеницилленовых кислот может быть представлена следующим образом:

Устойчивость в водных растворах у препаратов различна. Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина и метициллина разрушаются в водных растворах при нагревании (при комнатной температуре этот процесс происходит медленно). Эти препараты быстро инактивируются под действием кислот и щелочей. Феноксиметилпенициллин, ампициллин и оксациллина натриевая соль устойчивы в слабокислой среде. Препараты природных пенициллинов разрушаются при действии фермента пенициллиназы, синтетические аналоги отличаются устойчивостью к нему.

Суммируя вышесказанное можна выделить основные реакции, используемые для определения подлинности:

1. Реакция с реактивом Феллинга.

Суспендируют 10 мг вещества в 1 мл воды и прибавляют 2 мл смеси, приготовленной из 2 мл реактива Феллинга и 6 мл воды. Тотчас появляется фуксиново-фиолетовая окраска.

Реактив Феллинга представляет собой смесь щелочного раствора сегнетовой соли и раствор меди (II).

2. Реакция с нингидрином.

Нингидрин окисляет первичную аминогруппу в реакции б-аминофенилуксусной кислоты до бензальдегида и аммиака. Сам нингидрин при этом восстанавливается. В последующей стадии восстановленная форма нингидгина подвергается реакции конденсации с аммиаком с образованием продукта фиолетовой окраски.

Выполнение реакции. Около 50 мг субстанции растворяют в 2 мл воды, добавляют 1 мл 0,2 % раствора нингидрина и выдерживают. Возникает фиолетовая окраска.

1. Реакция с гидрохлоридом гидроксиламина (образование гидроксаматов). Благодаря наличию в молекуле пенициллинов карбамоильной группы -С(О)-N= пеницициллины образуют при взаимодействии со щелочным раствором гидроксиламина гидроксамовую кислоту. Последняя з солями феррума (III) в кислой среде дает комплекс краснофиолетовой окрашивания.



Выполнение реакции. Около 0,1 г растворяют в 2 мл 2 М раствора NaOH , добавляют 0,3 г гидроксиламина гидрохлорида и оставляют на 5 мин. Затем добавляют 2 мл 0,1 М раствора HCl и каплю 1 % раствора FeCl₃; возникает красно-фиолетовая окраска.

4. ИК-спектроскопия. ИК-спектры принято применять для идентификации ампициллина (ВФС 42-676-77, МФ II). Для безводной формы инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом ампициллина СО, или спектру сравнения ампициллина.

5. УФ-спектры используются для идентификации ампициллина (ВФС 42-676-77, МФ II).

6. Реакция с формальдегидом в сульфатной кислоте. К 2 мг препарата в пробирке прибавляют 1 каплю воды, затем 2 мл серной кислоты ( ~ 1760 г/л) и перемешивают, раствор бесцветный. Погружают пробирку на 1 мин в водяную баню; раствор остается бесцветным. Помещают 2 мг препарата во вторую пробирку, прибавляют 1 каплю воды и 2 мл раствора формальдегида в серной кислоте и перемешивают; раствор бесцветный или слегка розовый. Погружают эту пробирку на 1 мин в водяную баню; появляется оранжево-желтое окрашивание (МФ II).

7. Удельное оптическое вращение. При исследовании на чистоту используют раствор препарата с концентрацией 2,5 мг/мл и пересчитывают результат на безводное вещество; [б]_D^20°C=от +280 до + 305 °.

Воду определяют методом Карла Фишера. Для безводной формы используют около 0,8 г вещества; содержание воды не более 15 мг/г.

Для тригидрата используют около 0,1 г вещества; содержание воды не менее 120 и не более 150 мг/г.

рН раствора препарата с концентрацией 2,5 мг/мл 3,5 - 5,0.

1.3.1 Методы количественного определения феноксиметилпенициллина

УФ-спектрофотометрический метод

Спектрофотометрический метод с меркурий-имидазольным реактивом. Образование коплекса с переносом заряда между ампициллином и имидазол-меркуриевым реагентом использовано для спектрофотометрического определения ампициллина путем измерения светопоглощения раствора продукта взаимодействия (МФ ІІ).

лекарственный антибиотик пенициллин ампициллин



Глава 2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Методы измерения и реактивы

Для исследований использовали субстанции тригидрата ампициллина (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-Амино-2-фенилацетамидо]-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота, тригидрат) призводства “Tini Pharma Limited”, Индия (сер. 0160903), ампициллина натриевую соль (натрия (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-амино-2-фенилацетил]амино-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1- азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоксилат) фармакопейної чистоты и их лекарственные формы: “АМПІЦИЛЛИН-КМП”, 1,0 г активного вещества, серии 941001, производства ОАО “КИЕВМЕДПРЕПАРАТ”, Киев, Украина, таблетки по 0,25 г “Ампициллина тригидрат”, серии 641097, призводства “МОНФАРМ” (Монастирище-Украина).

Как реагент использовали дипероксиадипиновую кислоту (НО₃С-(СН₂)₄-СО₃Н, ДПАК), которую получали как в работе [11]. Содержание основного вещества в продукте по данным метода йодометрического титрования составлял 96-98%.

Изготовление стандартных растворов пенициллинов осуществляли по точным навескам субстанций, которые отвечали требованиям Европейской Фармакопеи 4-го издания, стр. 656 (монография Ampicillin trihydrate). Раствор ампициллина тригирата получали после растворения субстанции в минимальном количестве диметилформамида ч.д.а. с последующим разбавлением дистиллированной водой. Рабочие растворы пенициллинов готовили из исходных соответствующим разбавлением. Все растворы приготовляли непосредственно перед проведением испытаний и хранили не более 6 - 8 часов в холодильнике.

Электронные спектры регистрировали на спектрофотометре “SPECORD M-40”, UV Vis (“Цейс”, Иена, Германия), кинетику изучали на спектрофотометре СФ-26 (ЛОМО, СССР). Кинетику реакций изучали: по расходованию пероксикислоты методом йодометрического титрования [12] и спектрофотометрически по светопоглощению образующегося желтого продукта реакции окисления при 302 нм. Для измерения светопоглощения использовали кювету с толщиной поглощающего слоя l=1 см; для смешивания растворов использовали реактор Бударина, время фиксировали секундомером, начиная от момента смешивания растворов. Растворы перед смешиванием термостатировали в термостате UTU-2 ( Zeamit, Horizont Krakow-Poland).

Для поддержки необходимой кислотности среды применяли фосфатне буферне растворы, приготовленные по Грину [13] и 0,1 М раствор гидроксида натрия, который не содержит карбонатов [12]. Контроль рН растворов осуществляли с помощью стеклянного водородного электрода ЭСЛ-43-07 на лабораторном иономере И-130.

Стандартный 0,02 н. раствор тиосульфата натрия готовили согласно [12], объем титранта измеряли с помощью микробюретки на 10 мл с точностью ± 0,01 мл.

Изучали влияние рН среды, последовательность смешивания реагентов и их необходимый избыток на длительность взаимодействия на каждой стадии преобразования исследуемых пенициллинов в соответствующие продукты окисления.

2.2 Полученные результаты и их обсуждение

Было установлено, что порядок смешивания растворов существенно влияет на кинетику и выход продукта реакции. Наибольшая скорость накопления продукта наблюдалась лишь после предварительного смешивания исследуемого пенициллина с дипероксидикарбоновой кислотой, а в последствии с раствором щелочи. Максимальная активность дипероксикислоты в реакции наблюдалась при достижении ее концентрации (1 - 2) ·10^-2 М, то есть при более, чем 50-кратном молярном избытке по отношению к пенициллину. В отсутствие дипероксидикарбоновой кислоты в растворе щелочи в течение первых 30 мин образование продукта реакции не наблюдалось.

Такой необходимый избыток пероксикислоты может быть объяснен участием ее в процессе дальнейшего гидролитического расщепления, образованного на первой стадии реакции S-оксида ампициллина, которое происходит под действием пероксида водорода - продукта гидролиза дипероксикислоты в щелочной среде (нуклеофильный катализ гидролиза в-лактамного кольца) (см. схему).

На рис. 1 приведены спектры светопоглощения продуктов взаимодействия пенициллинов, которые регистрировали в течение прохождения реакции. Возникновение характерной полосы с максимумом около 305 - 308 нм свидетельствует об образовании одинаковых по природе продуктов реакции похожего строения. По характеру кривые зависимости светопоглощения растворов во времени имеют вид кривых с насыщением, которое достигается за 10 - 15 мин при 20° С (рис. 2).

Результаты изучения кинетики реакции методами йодометрического титрования дипероксидикарбоновой кислоты, а также природы продуктов методами УФ- и ИК-спектроскопии, свидетельствуют об образовании на первой стадии реакции (дипероксикислота + пенициллин) S-оксида ампициллина, который под действием пероксида водорода (образованого в результате щелочного гидролиза пероксикислоты) в присутствии щелочи подвергается реакции пергидролиза с образованием нового продукта - с разомкнутым лактамным циклом, вероятно, следующего строения:

А

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Электронные спектры продуктов реакций окисления оксациллина Na (0-5), ампициллина Na (0-5') та ампициллина тригидрата (0-5") дипероксиадипиновой кислотой.

С_окс=8 мкг/мл, С_{амп. Na} =8 мкг/мл, С_{амп. т/г}=12 мкг/мл, С_дпак=1,6•10^-3 М, C_NaOH =1,2•10^-2 М С, 10^-3 М,ДПАК

Рис. 2 Изменение концентрации ДПАК в ходе реакции с ампициллином при рН: 1, 2, 3 - 4,0-8,6; 4, 5 - 9,2-10,5. С амп. Na =1•10^-3М, С _ДПАК(f=1/2, М=178 г/моль)=3,05•10^-3 М.

Однако, как показали данные хроматографического анализа (ВЭЖХ), рядом с основным продуктом реакции имеет место образованине еще нескольких соединений неустановленной природы (от 7 до 10 %), идентификация которых не входила в план данного исследования.

На основании полученных результатов нами были разработаны экспрессные методики количественного определения ампициллина тригидрата и ампициллина натриевой соли в лекарственных формах кинетическим методом.

Предложенные методики основаны на взаимодействии ампициллина с избытком дипероксидикарбоновой кислоты в сильнощелочной среде с определением продукта реакции кинетическим методом тангенсов в спектрофотометрическом варианте.

Рис. 3. Кинетическая кривая образования продукта в системе Ампициллин -ДПAК?NaOH. Ампициллина т/г (24 мкг/мл). С_ДПАК=1,6•10^-3М;С_NaOH=1,2•10^-2M. tg б, мин^-1

Рис. 4. Калибровочные кривые для кинетического определения ампициллина Na (1) и ампициллина т/г (2). С_ДПАК=1,6•10^-3 М; С_NaOH=1,2•10^-2 M.

Стандартный раствор натриевой соли ампициллина 360 мкг/мл. Растворяют 0,0360 г ампициллина натриевой соли в бидистиллате в мерной колбе на 100 мл. Объем раствора доводят до метки бидистиллатом при 20°С и перемешивают. Раствор пригоден к применению 24 ч.

Стандартный раствор ампициллина тригидрата 300 мкг/мл. Растворяют 0,0300 г ампициллина тригидрата в 10 мл диметилформамиде квалификации ч. д. а. при нагревании до 40-50°С и перемешивании в мерной колбе на 100 мл. Объем раствора доводят до метки бидистиллатом при 20 и перемешивают. Раствор пригоден к применению 24 ч.

Таблица

Результаты кинетического определения ампициллина в лекарственных формах по реакции с дипероксиадипиновой кислотой (Р=0,95, n=5)

Взято ампициллина, г	Найдено	Метрологические характеристики
	г	%
Ампициллина тригидрата таблетки по 0,25 г “Монфарм” Монастирище, Украина
0,2465	0,2502 0,2521 0,2420 0,2481 0,2595	100,08 100,84 96,80 99,24 99,80	= 0,2484 (99,3%) S=±0,0038 =±0,0048 е = ±1,92%
Ампициллин - КМП ампициллина натриевой соли в пересчете на ампициллин 1,0 г ОАО “Киевмедпрепарат”, Украина
0,9808*	0,9502 0,9901 0,9735 0,9709 0,9976	95,0 99,0 97,4 97,1 99,8	= 0,9765 (97,7%) S=±0,018 =±0,023 е = ±2,35%

Примечание * содержание ампициллина натриевой соли в пересчете на ампициллин, указанное в сертификате

Образующийся S-оксид ампициллина в условиях определения с достаточно высокой скоростью гидролизуется дипероксидикарбоновой кислотой (фактически ее анионами и пероксидом водорода - продуктом гидролиза дипероксикислоты) и не гидролизуется ионами гидроксила (проявляют достаточно высокую стабильность в щелочной среде). Кроме того, наблюдается линейная зависимость между скоростью реакции образования спектрально активного конечного продукта окислительно-гидролитического процесса трансформации ампициллина (л_макс=305-308 нм) и его исходной концентрацией. Это и позволило использовать данную реакцию с диперокидикарбоновой кислотой для аналитических целей, в частности для кинетического определения.

Скорость реакции оценивали по наростанию светопоглощения растворов при 305 нм. Тангенс наклона начального участка (первых 10 мин) кинетической кривой в координатах А - ф (мин) равен скорости реакции. Концентрацию ампициллина находили по предварительно построенному калибровочному графику.

Результаты выполнения анализа таблеток и гранулята для изготовления

суспензии ампициллина приведены в таблице. Они убедительно свидетельствуют о принципиальной возможности выполнения количественного определения ампициллина в данных лекарственных формах с невысокой ошибкой (менее 2,3 %). Нижняя граница определяемых содержаний ампициллина 2?10^-5 М.

Построение калибровочного графика. В мерные колбы на 50 мл с помощью микробюретки отмеривают 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00, 6.00, 7.00 мл стандартного раствора ампициллина, в каждую колбу добавляют по 5 мл 1,5·10^-2 М раствора дипероксиадипиновой кислоты, тщательно перемешивают, после чего приливают по 6 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия, доводят объем до метки бидистиллатом и снова перемешивают. В момент прибавления раствора щелочи включают секундомер и начинают отсчет времени. Полученные растворы фотометрируют в кварцевой кювете толщиной 1 см при 305 нм против раствора холостой пробы (без исследуемого ампициллина) в течение 10 мин через каждую минуту при 20°С и строят кинетические зависимости светопоглощения А от времени ф. Обработку результатов осуществляют методом тангенсов (диференциальный вариант). Строят калибровальный график зависимости скорости реакции от концентрации (с, мкг/мл).

Методика количественного определения ампициллина тригидрата в таблетках по 0,25 г. Около 0,04 г (точная навеска) препарата переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 10 мл диметилформамида ч. д. а., доводят объем раствора бидистиллатом до метки и перемешивают. 5,00 мл полученного раствора переносят в мерную колбу на 50 мл и обрабатывают аналогично, как при построении калибровочного графика. Полученный раствор фотометрируют в кварцевой кювете с толщиной 1 см при 305 нм против раствора холостой проби (без ампициллина) в течение 10 мин через каждую минуту при 20°С и строят кинетическую кривую зависимости светопоглощения раствора А от времени. Обработку результатов осуществляют методом тангенсов (дифференциальный вариант). По калибровочной зависимости скорости реакции от концентрации находят клнцентрацию ампициллина (с, мкг/мл).

Содержание С₁₆Н₁₉N₃O₄S в г в одной таблетке (Х_амп ) рассчитывают по формуле:

Х_амп = , где

с - концентрация ампициллина, найденная по калибровочному графику в мкг/мл;

0,9790 - содержание С₁₆Н₁₉N₃O₄S в стандартном образце ампициллина тригидрата, массовая доля;