Токсикометрия нефтезагрязнений с использованием микроорганизмов

37

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

КУРСОВАЯ РАБОТА

ТОКСИКОМЕТРИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРООРГАНИЗМОВ

Иркутск 2009

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Нормативно-правовые основы экологического мониторинга окружающей среды в России

1.2 Физико-химические методы определения нефтепродуктов и других токсинов в окружающей среде

1.3 Биотестирование

1.4 Использование микроорганизмов в токсикометрии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Нефть является одним из наиболее распространённых источников топлива в мире (Петрикевич и др., 2003), но в то же время является наиболее опасным из загрязнителей окружающей среды. Большие объемы нефти попадают в экосистему в результате аварий при транспортировке, незаконных врезок в нефтепроводы, нарушений при добыче и т. д. Не являясь ксенобиотиком, нефть при извлечении из недр на поверхность земли, способна, тем не менее, проявлять сильные загрязняющие свойства. Попадая в почву, нефть оказывает токсическое воздействие на растения и животных, подавляет активность почвенной микробиоты и нарушает баланс почвенных ферментов. В этой связи остро стоит проблема диагностики токсического влияния нефтяных углеводородов на многоуровневую экосистему почв (Киреева и др., 2007).

Природоохранная деятельность в стране и в мире должна быть направлена на уменьшение воздействий на природу вредных производств. Для этого необходимо создавать новые технологии, способные улавливать, перерабатывать, утилизировать загрязнители или токсины, смягчая или предотвращая их воздействие на окружающую среду (file…). Площади земель и водоемов, загрязненных нефтью с каждым годом увеличиваются, поэтому продолжает оставаться актуальной проблема разработки новых и совершенствования существующих технологий ликвидации последствий техногенных контаминаций нефтью и нефтепродуктами и восстановления биопотенциала нарушенных экосистем (Исмаилов, 1988).

Немаловажной проблемой является определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды. На практике широко применяются физико-химические методы (ИК-, УФ-фотометрия, ЯМР, ИК-спектрометрия, газовая хроматография и т.д.). Биологические методы определения токсинов в среде привлекают внимание исследователей благодаря их высокой чувствительности, информативности и экономичности. Использование в качестве аналитических индикаторов микроорганизмов нередко является единственно надежным методом определения малых количеств веществ, так как основано на прямом воздействии химических веществ на живую клетку.

Цель курсовой работы: познакомиться с литературой, касающейся вопросов использования микроорганизмов в биотестировании.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Нормативно-правовые основы экологического мониторинга окружающей среды в России

Национальный мониторинг России в настоящие время включает три вида мониторинга: санитарно-гигиенический, экологический, климатический (Саксонов и др.,2007).

Экологический мониторинг рассматривается как совокупность систем комплексного наблюдения за антропогенными и природными источниками воздействия, состоянием окружающей среды, динамикой происходящих в ней изменений, прогнозом развития ситуаций и управления ими. В качестве основных элементов мониторинг включает наблюдения за факторами воздействия и состоянием окружающей среды, прогноз ее будущего состояния и оценка фактического и прогнозируемого состояния природной среды. Ключевой задачей экологического мониторинга является обеспечение систематических наблюдений за экологическими эффектами взаимодействия природы, населения и хозяйства на определенной территории.

Мониторинг окружающей среды (экологического мониторинга), согласно Закону РФ «Об охране окружающей среды» (1992), состоит из государственной службы наблюдения за состоянием окружающей природной среды, государственного, производственного, общественного контроля.

В России действует Единая государственная система экологического мониторинга (ЕСЭМ) (Постановление…, 1993). ЕГСЭМ функционирует и развивается с целью информационного обеспечения управления в области охраны окружающей среды, рационального использования природных ресурсов, обеспечения экологически безопасного устойчивого развития страны и ее регионов, ведения государственного фонда данных о состоянии окружающей среды и экосистем, природных ресурсах, источниках антропогенного воздействия. Общее руководство ЕГСМ возложено на Государственный комитет РФ по охране окружающей среды (СЗ РФ, 1997).

Основными задачами ЕГСЭМ являются (Положение…, 1995):

- проведение наблюдений за изменением состояния окружающей среды и экосистемами, источниками антропогенных воздействий с определенным пространственным и временным разрешением;

- проведение оценок состояния окружающей среды, экосистем территории страны, источников антропогенного воздействия;

- прогноз состояния окружающей среды, экологической обстановки на территории России и ее и экономических сценариях развития страны и ее регионов. В соответствии с основными задачами в ЕГСЭМ осуществляется мониторинг состояния природных сред, экосистем, природных ресурсов и источников антропогенного воздействия, а также информационное обеспечение решения экологических проблем. Эти работы выполняются в рамках ЕГСЭМ на единых научно-методических и метрологических подходах.

В ЕГСЭМ образуются специализированные ведомственные подсистемы, связанные с мониторингом источников антропогенного воздействия предприятий различных отраслей промышленности и сельского хозяйства страны.

В ЕГСЭМ функционируют подсистемы обеспечения, к которым относятся: топографо-геодезическое и картографическое обеспечение, включая создание цифровых, электронных карт и геоинформационных систем; электронные системы передачи данных. В ЕГСЭМ могут быть образованы и другие подсистемы, решающие тематические целевые задачи.

ЕГСЭМ функционирует и развивается во взаимодействии с Российской системой по чрезвычайным ситуациям (РСЧС) и обеспечивает РСЧС всей необходимой информацией в согласованной форме и в согласованные сроки. В случае возникновения чрезвычайных ситуаций федерального и регионального масштабов ЕГСЭМ функционирует как подсистема РСЧС.

ЕГСЭМ функционирует на четырех основных уровнях: федеральном, региональном (бассейновом), субъектов Российской Федерации (территориальный уровень), локальном.

Целесообразность создания регионального уровня ЕГСЭМ определяется: необходимостью оценки состояния природных объектов, анализа природных процессов и экологически неблагоприятных явлений, когда их границы не совпадают с границами субъектов Российской Федерации; сложившейся структурой территориальных (региональных) органов ряда ведомств; целесообразностью создания мощных территориальных функциональных центров, способных обслуживать ряд субъектов Российской Федерации.

Данные для обеспечения информационных систем федерального (регионального) уровня передаются в соответствующие федеральные (региональные) центры указанных подсистем. Обобщение информации, получаемой территориальными центрами базовых и специальных подсистем, осуществляется по данной территории в региональных информационно- аналитических центрах (РИАЦ) территориальных органов Минприроды России по согласованию с территориальными (региональными) подразделениями федеральных органов исполнительной власти, обеспечивающих функционирование ЕГСЭМ.

Территориальные системы экологического мониторинга организуются в субъектах РФ и являются основными системообразующими элементами ЕГСЭМ (территориальными подсистемами ЕГ-СЭМ). Как и ЕГСЭМ, территориальные подсистемы формируются на основе базовых и специализированных подсистем при участии систем обеспечения соответствующего уровня.

Данные, получаемые всеми звеньями территориального уровня ЕГСЭМ, собираются в специализированных центрах базовых и специализированных подсистем данной территории, функционирующих на единой организационной, методической и информационной основе.

Сбор, хранение и анализ информации, поступающей от информационных звеньев базовых и специализированных подсистем мониторинга территориального уровня, а также федеральных центров специализированных подсистем, не имеющих территориального уровня, осуществляется в информационно-управляющих федеральных центрах соответствующих подсистем ЕГСЭМ, связанных между собой на единой организационной, методической и информационной основе.

Федеральный информационно-аналитический центр (ФИАЦ) Минприроды России осуществляет сводный анализ информации, передаваемой из информационно-управляющих центров соответствующих подсистем ЕГСЭМ федерального и территориального уровней в порядке, согласованном с федеральными органами исполнительной власти, обеспечивающих функционирование ЕГ-СЭМ, и органами исполнительной власти субъектов Российской Федерации. Обмен данными между информационными центрами подсистем ЕГСЭМ осуществляется на принципе бесплатного доступа к данным мониторинга, полученным за счет бюджетных средств. В Иркутской области с 1995 г. ведутся работы по программе разработки системы экологического мониторинга Иркутской области.

Организация и проведение работ по экологическому мониторингу в пределах Иркутской области осуществляется и координируется территориальной системой экологического мониторинга Иркутской области (ИРСЭМ) на принципах, правилах, нормах и положениях ЕГСЭМ (Постановление…, 1996).

Основными задачами ИРСЭМ являются (Постановление…,1996):

- своевременное и достоверное выявление зон возможного экологического неблагополучия и доведение этой информации до заинтересованных потребителей для выработки долгосрочных и экстренных мер по обеспечению экологической безопасности Иркутской области;

- организация и обеспечение информационных потоков в базу данных ИРСЭМ;

- обеспечение информационной поддержки приоритетных для Иркутской области конкретных задач управления экологической обстановкой, определяемых территориальными и федеральными программами, международными обязательствами Российской Федерации;

- обеспечение граждан и организаций информацией об экологической обстановке;

- развитие ИРСЭМ, включая совершенствование всех видов обеспечения ее функционирования;

- обеспечение эффективного информационного сопряжения ИРСЭМ с другими государственными информационными системами;

- реализация научно-технической политики ЕГСЭМ в области обеспечения информационной поддержки управления экологической обстановкой.

В рамках ИРСЭМ на основе базовых функциональных и специализированных систем государственных и ведомственных служб мониторинга осуществляется:

- мониторинг источников воздействия или мониторинг эмиссий субстанций;

- мониторинг воздействия на природную среду, связанный с контролем влияния источника (импактный мониторинг);

- мониторинг состояния природной среды, не связанный с определенным источником воздействия (мониторинг антропогенного фона).

Для оценки антропогенного воздействия объектов хозяйственной деятельности организуются отраслевые и производственные системы мониторинга источников воздействия на окружающую природную среду и зон их непосредственного влияния (импактный мониторинг), осуществляющие свое функционирование в рамках соответствующих базовых и специализированных подсистем ЕГСЭМ. Организация этих систем мониторинга осуществляется предприятиями и организациями, осуществляющими хозяйственную деятельность на территории субъектов Российской Федерации. Решение о необходимости наличия у предприятия указанных систем мониторинга принимается органами, выдающими лицензии на природопользование и проведение мониторинга состояния окружающей среды.

Для оценки состояния окружающей природной среды непосредственно в районах расположения (размещения) объектов, представляющих потенциальную опасность для населения, растительного и животного мира и состояния экосистем, формируются локальные сети наблюдения. Требования по их методическому и информационному сопряжению с ЕГСЭМ определяются совместным решением органов исполнительной власти субъектов РФ, специально уполномоченных федеральных органов исполнительной власти в области охраны окружающей природной среды, органов РСЧС, санитарно-эпидемиологического надзора. Ведение локального экологического мониторинга осуществляется природопользователем по разработанным им регламентам, согласованным со специальными уполномоченными государственными органами.

Системы мониторинга источника воздействий создаются за счет средств субъекта хозяйственной деятельности, который обеспечивает их регламентное функционирование. Системы мониторинга России тесно взаимосвязаны с международным мониторингом, который осуществляется в рамках Глобальной системы мониторинга окружающей среды (ГСМОС) и охватывает национальные и региональные (межнациональные) системы мониторинга (Саксонов и др.,2007).

1.2 Физико-химические методы определения нефтепродуктов и других токсинов в окружающей среде

Загрязнения окружающей среды нефтью и нефтепродуктами (НП) одни из основных и наиболее часто встречающихся. Их источниками могут быть разливы топлива при транспортировке, хранении и т.п., остатки несгоревшего топлива в выхлопных газах двигателей внутреннего сгорания (природные источники нефтяных загрязнений при выходе на поверхность нефтеносных пород играют минимальную роль в общем загрязнении окружающей среды нефтяными углеводородами). Нефтепродукты являются нормируемым видом загрязнений. В РФ установлены предельно допустимые концентрации (ПДК) нефтепродуктов в воде (0.1 мг/л для керосина, 0.1-0.3 мг/л для нефти), водоемов рыбохозяйственного назначения 0.05 мг/л . (Основные свойства…, 1985; Санитарные…).

Основные методы определения НП в объектах окружающей среды основаны на следующих принципах: 1) селективное выделение суммы НП (или веществ, принимаемых за НП) из воды, почвы или поглотительных растворов, фильтров, сорбентов и определение массы экстрагируемых продуктов (гравиметрический метод); 2) определение какой-либо характеристической группы компонентов или структурной характеристики молекул, входящих в состав нефти или нефтепродуктов, на основании чего судят об общей концентрации нефтепродуктов (ИК- или УФ- фотометрия, люминесцентная, содержание определенных металлов и др.); 3) по возможности полное определение всех возможных компонентов НП с помощью ЯМР или ИК-спектрометрии, газовой хроматографии (ГX), сочетания ГХ и масс-спектрометрии (ГX-МС). Для дистанционного детектирования нефтяных разливов используют ИК- спектры в нехарактеристической области в окнах прозрачности атмосферы (Бродский и др., 1998).

Для характеристики различных методов определения нефти и нефтепродуктов в воде, почве и других объектах необходимо, прежде всего, определить понятие «нефтепродукты». Нефть, нефтяные фракции и нефтепродукты состоят главным образам из углеводородов: н- и изоалканов, циклоалканов с 1-7 и более кольцами, среди которых можно выделить так называемые реликтовые углеводороды - изопренаны, стераны, тритерпаны; ароматических и гидроароматических углеводородов, а также гетероатомных соединений - алифатических, алициклических и ароматических. Экстракты наряду с собственно НП обязательно содержат сопутствующие углеводороды, кислоты и др. Согласно определению, принятому Комиссией по унификации методов анализа природных и сточных вод стран - членов СЭВ (1968 г.), а также Международным симпозиумом в Гааге (1968 г.) за «нефтепродукты» при анализе вод следует принимать сумму неполярных и малополярных соединений, растворимых в гексане (Лурье, 1985). Поэтому НП из проб воды рекомендуется экстрагировать неполярным растворителем, а экстрагируемые полярные примеси удалять хроматографией на силикагеле, флориселе или оксиде алюминия. Существующие нормы предельно допустимой концентрации НП в воде (0.3-0.05 мг/л) были введены в результате исследования растворов различных НП и сырой нефти в воде и по существу не могут применяться, скажем, к сумме углеводородов или других органических веществ (Бродский и др., 1998).

Методы, применяемые в массовом анализе. В практике экологического аналитического контроля для определения НП в воде наиболее широко применяются гравиметрический, ИК- спектрометрический и флуориметрический методы (Лурье, 1985; Руководство…,1977; Дмитриев и др., 1989). В гравиметрическом методе органические соединения экстрагируют из воды неполярным растворителем (четыреххлористый углерод, пентан, гексан, петролейный эфир, фреон-1,1,2-трихлор-1,2,2-трифторэтан); экстракт пропускают через колонку с сорбентом (активный оксид алюминия или силикагель), который сорбирует полярные вещества. Затем после выпаривания растворителя остаток взвешивают для определения суммы «нефтепродуктов». Обычно для анализа берут 0.1-3 л воды, подкисляют НСl до рН < 5, экстрагируют двумя порциями по 20 мл растворителя и объединяют экстракты. При концентрации НП в воде <0.3 мг/л пробы 3 л недостаточно для надежного определения гравиметрическим методом. В этом случае рекомендуется извлекать сумму неполярных органических соединений из больших объемов воды (10-20 л) с помощью непрерывной жидкостно-жидкостной экстракции или сорбентов типа активного угля и др.), сорбированные вещества затем десорбируют четыреххлористым углеродом в аппарате Сокслета (Лурье, 1985).

Метод ИК-фотометрии основан на том, что растворенные или эмульгированные в воде НП экстрагируют четыреххлористым углеродом, экстракт очищают от полярных соединений на колонке с оксидом алюминия и фотометрируют в специфической области 2700-3100 см^-1 (Лурье, 1985; Орадовский, 1977; Дмитриев и др., 1989). Градуируют анализатор с помощью специальной градуировочной смеси, включающей гексадекан (37.5%), изооктан (37.5%) и бензол (25%), набор групп -СН, -СН₂, -СН₃, который считается близким к такому набору в реальных НП. Этот стандартный образец пригоден только для градуировки ИК-спектрафотометров и не годится для контроля правильности, так как не отражает реального состава НП и его изменения в процессе выветривания, а эффективность экстракции его компонентов недостаточно хорошо моделирует эффективность экстракции реальных компонентов нефти (в частности, нафтенов и алкилбензолов). Он совершенно непригоден при других методах определения НП, например ГХ. Чувствительность метода ИК-фотометрии для пробы воды 2 л равна 0.05 мг/л (Орадовский, 1977).

Люминесцентный метод основан на измерении флуоресценции полициклических ароматических углеводородов, входящих в состав нефти, возбуждаемой УФ-излучением ртутной или ксеноновой лампы. Методы, основанные на поглощении УФ и люминесцентного излучения, характеризуют только ароматические, в основном полициклические структуры, при этом коэффициенты поглощения разных ароматических структур могут очень сильно различаться, так что результаты зависят не только от количества, но и от состава ароматических соединений. Градуируют по хризену или какой-либо определенной нефти (например, легкой аравийской нефти). Насыщенные структуры, составляющие большую часть НП, при этом игнорируются. Благодаря высокой чувствительности эти методы, особенно, люминесцентный, хорошо подходят для скринингового анализа, но могут приводить к ошибочным результатам при количественном определении НП.

Флуориметрический метод определения НП в воде (Gladilovich et al., 1997) с экстракцией пробы н-гексаном и последующим измерением флуоресценции (возбуждение - 250-290 нм, излучение - 300-350 нм) обеспечивает предел обнаружения около 0.005 мг/л. Для 250 проб воды, проанализированных флуориметрическим и ИК- фотометрическим методами, в 90% случаев разность результатов, полученных обоими методами, была меньше погрешности определения.

ИК- фотометрический метод сильно завышал результаты для проб, содержащих жиры, продукты переработки древесины и большое количество природных органических веществ. Флуориметрический же метод занижал результаты тех проб, в которых основными компонентами были легкие углеводороды (бензин, керосин).

Флуориметрический метод был использован для оценки нефтяного загрязнения данных осадков в Аравийском заливе после разрушения Ираком нефтяных терминалов в Кувейте (Massoud et al.,, 1996). 20 г пробы экстрагировали в аппарате Сокслета смесью дихлорметана и гексана экстракт концентрировали до 1 мл и определяли нефтяные углеводороды на спектрофлуориметре Shimadzu Fl (FOU-3). Для возбуждения использовали линию 310 нм, излучение регистрировали при 360 нм. Результаты выражали в хризеновых эквивалентах. Отмечено, что содержание в осадках органического углерода не может быть использовано в качестве индикатора нефтяного загрязнения в Аравийском заливе.

Большинство методов, которые можно использовать в полевых условиях, основано на измерении паров органических веществ. Они, как правило, хороши для качественного детектирования летучих органических веществ, но дают существенные погрешности из-за малой правильности. Основной источник погрешности - то, что измеряют углеводороды в паровой фазе, а не непосредственно в почве. Поэтому результаты сильно зависят от температуры, летучести определяемых веществ, природы загрязнений (бензин, дизельное топливо, соляровое масло и др.) (Бродский и др., 1998).

Для определения общего содержания углеводородов в воде и почве предложены и другие методы, которые можно использовать в полевых условиях. В комплект для полевых измерений фирмы «Hach» входят два набора реагентов и аппаратуры для иммуноферментного детектирования, а также полуколичественного определения общего содержания углеводородов в воде и почве с помощью карманного колориметра. Использован вариант так называемого энзимо-связанного иммуноадсорбционного анализа (ELlSA). Интенсивность окраски, вызванной образованием ферментных конъюгатов, обратно пропорциональна содержанию углеводородов в пробе. В качестве антигена выступает один или несколько типов нефтяных углеводородов- загрязнителей. Метод основан на конкурентном связывании антигена и конъюгата энзима с иммобилизованным антителом. Предел обнаружения для воды и почвы составляет 10 Ч 10^-6 и 100 Ч 10^-6, соответственно. Наборы антител рассчитаны на детектирование ароматических углеводородов, таких как бензол, толуол, м-ксилол, этил бензол, стирол и гексахлорбензол. Основное применение - для определения течи подземных хранилищ топлива (Бродский и др., 1998).

Пары нефтяных углеводородов часто составляют основную часть летучих органических соединений в воздухе (Исидоров, 1992; Бродский и др., 1997). Их определение основано либо на непосредственном анализе проб воздуха, либо на улавливании и концентрировании определяемых веществ с последующим их анализом, обычно с помощью ГХ или ГХ-МС. Непосредственно определить сумму органических соединений, представляющих собой в городской атмосфере главным образом испарившиеся или несгоревшие остатки моторных топлив, можно прокачиванием воздуха через фотоионизационный (Бродский и др., 1997) или пламенно-ионизационный (Руководство . . . , 1991) хроматографический детектор (без разделения на колонке). Предел обнаружения такой системы с фотоионизационным детектором составляет 0.1 млн^-1 , интервал линейности 0.1-2000 млн^-1, время отклика - около 3 с.

Как правило, все рутинные методы, используемые для определения НП в окружающей среде, позволяют измерять один количественный параметр, который и является мерой содержания НП в пробе. Вопрос о природе определяемых веществ, сигнал которых использован для оценки этого параметра, остается вне конкретного определения, он решается в рамках разработки методики. Поэтому часто бывает трудно оценить правильность результатов; обычно это требует анализа большой совокупности измерений или сравнения с результатами других методов (Смирнов,1985)

Применение ГХ и ГХ-МС для определения НП в объектах окружающей среды. Метод ГХ (и тем более ГХ-МС) помимо количественной оценки содержания или концентрации НП позволяет одновременно характеризовать качественные параметры - принадлежность определяемого вещества к нефтепродуктам и даже его качественный состав (Хмельницкий и др., 1990; Шляхов, 1984; Хромченко и др., 1981; Бродский и др., 1994; Руденко и др., 1981; Немировская и др., 1997; Бродский, 1985).

Еще в 1968 г. было показано, что ГХ с короткой насадочной колонкой и ПИД является хорошим методом скрининга углеводородных загрязнений в морской воде и в почве (Ramsdale S.J et al.,1968). Этот метод относительно быстр, так как не требует никакой пробоподготовки; для анализа достаточно нескольких миллиграммов вещества; пробы загрязнений (вода, песок и т.п.) вводят в небольших открытых ампулах. С помощью этого метода можно давать общую классификацию нефтяных загрязнений: сырая нефть, топливо, остатки от промывки танков, остатки на дне танков.

Обычно с помощью ГХ или ГХ-МС определяют следующие характеристики нефтепродуктов (или вообще экстрагируемых органических веществ): распределение н-алканов, наличие и содержание определенных изоалканов, в частности пристана и фитана; наличие и распределение стеранов и тритерпанов, неразрешенную сложную смесь углеводородов (UCM - unresolyed соmр1ех mixture), ароматические углеводороды(Oil in the Sea…,1985).

Другие методы определения НП в окружающей среде. ВЭЖХ применяли для группового фракционирования нефтяных фракций и аналогичных проб. Основным ограничением этого метода была трудность количественного анализа выделенных фракций. ВЭЖХ с трехмерным флуоресцентным детектированием было предложено использовать для анализа тяжелой фракции выветрившихся нефтей (Butt et al., 1986).

Показана возможность оценки уровня нефтяного загрязнения по результатам определения металлов в донных осадках (Massoud et al., 1996) или по высокотемпературной кислородной окисляемости (Зуев и др., 1995).

1.3 Биотестирование

Под биотестированием (bioassay) обычно понимают процедуру установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов. Благодаря простоте, оперативности и доступности биотестирование получило широкое признание во всем мире и его все чаще используют наряду с методами аналитической химии.

Биотестирование как метод оценки токсичности водной среды используется:

§ при проведении токсикологической оценки промышленных, сточных бытовых, сельскохозяйственных, дренажных, загрязненных природных и прочих вод с целью выявления потенциальных источников загрязнения,

§ в контроле аварийных сбросов высокотоксичных сточных вод,

§ при проведении оценки степени токсичности сточных вод на разных стадиях формирования при проектировании локальных очистных сооружений,

§ в контроле токсичности сточных вод, подаваемых на очистные сооружения биологического типа с целью предупреждения проникновения опасных веществ для биоценозов активного ила,

§ при определении уровня безопасного разбавления сточных вод для гидробионтов с целью учета результатов биотестирования при корректировке и установлении предельно допустимых сбросов (ПДС) веществ, поступающих в водоемы со сточными водами,

§ при проведении экологической экспертизы новых материалов, технологий очистки, проектов очистных сооружений и пр.

Тест-объект (test organism) - организм, используемый при оценке токсичности химических веществ, природных и сточных вод, почв, донных отложений, кормов и т.д.

Тест-объекты, по определению Л.П. Брагинского - «датчики» сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) водной среды («да» или «нет»), независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определяемых веществ, какой обычно представляют собой сточные воды. Тест-объекты с известной степенью приближения дают количественную оценку уровня токсичности загрязнения водной среды - сточных, сбросных, циркуляционных и природных вод. Для биотестирования используются различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. Наиболее популярные объекты - ювенальные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Семидневный тест на суточной молоди цериодафнии Ceriodaphnia affinis позволяет за более короткий срок (7 суток), чем на Daphnia magna (21 сутки) дать заключение о хронической токсичности воды.

Важное условие правильного проведения биотестирования - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность к токсическим веществам.

Новое поколение биотестов, разработанных в лаборатории экологической токсикологии и водной экологии (LETAE),(Университет Гент, Бельгия под руководством проф. G. Persoone (http://www.microbiotests.be/) Токскиты предназначены для проведения исследований острой токсичности природных сред и содержат все обходимые материалы для выполнения биотестирования или экотоксикологических исследований (тест-организмы в анабиотическом состоянии, эфиппиумы дафний (resting eggs), покоящиеся яйца коловраток, яйца артемии, культуры водорослей). Toxkit® реализуются вместе со всеми необходимыми приспособлениями, посудой и средами культивирования.

Жизненная функция или критерий токсичности (toxicity criterion), используются в биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды.

Тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных объектов:

· для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых - выживаемость (смертность) тест-организмов.

· для ракообразных, рыб, моллюсков - плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток.

· для культур одноклеточных водорослей и инфузорий - гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры.

· для растений - энергия прорастания семян, длина первичного корня и др.

Длительность биотестирования зависит от задачи, поставленной исследователем.

Острые биотесты (acute tests), выполняемые на различных тест-объектах по показателям выживаемости, длятся от нескольких минут до 24-96 часов.

Краткосрочные (short-term chronic tests) хронические тесты длятся в течение 7 суток и заканчиваются, как правило, после получения первого поколения тест-объектов.

Хронические тесты (chronic tests) на общую плодовитость ракообразных, охватывающие 3 поколения, длятся до рождения молоди в F3. Токсический эффект (toxic effect) - изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма под воздействием токсина. Зависит от особенностей яда, специфики метаболизма организма, факторов внешней среды (содержание кислорода, рН, температуры и др.).

Токсичность (toxicity) - свойство химических веществ проявлять повреждающее или летальное действие на живые организмы. Вещество, оказывающее токсическое действие, называется токсином, а процесс воздействия токсина на организм - токсикацией (на экосистему - токсификацией). По Н.С. Строганову, количественно токсичность вещества для отдельного организма определяется как величина, обратная медианной летальной концентрации: Т = 1/LC₅₀. Токсичность водной среды (toxicity of water environment) - токсичность воды и донных отложений для гидробионтов, возникающая вследствие появления в ней токсических веществ природного или антропогенного происхождения (ксенобиотиков), загрязнения сточными водами, токсическими атмосферными осадками и пр. При возникновении токсичности водной среды вода из среды, поддерживающей жизнь, становится средой, губительной для жизни. Степень токсичности водной среды оценивается методами биотестирования, а также по превышению ПДК (предельно допустимых концентраций).

Острая токсичность выражается в гибели отравленного организма за короткие промежуток времени - от нескольких секунд до 48 ч. Хроническая токсичность среды проявляется через некоторое время в виде нарушений жизненных функций организмов и возникновения патологических состояний (токсикозов). У водных организмов хроническая токсичность выражается в гонадотропном и эмбриотропном действии токсина, что приводит к нарушению плодовитости (продуктивности), эмбриогенеза и постэмбрионального развития, возникновению уродств (мутаций) в потомстве, сокращению продолжительности жизни, появлению «карликовых» форм.

Интегральная токсичность (integral toxicity), по определению Л.П. Брагинского, токсичность сложных смесей, сточных вод, многокомпонентных факторов для водных организмов.

Количественно интегральная токсичность определяется как величина, обратная максимальному разведению (1:2, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 и т.д.), при котором не наблюдается каких-либо нарушений жизненно важных функций тест-организмов при 24-48 часовом биотестировании. Выражается в баллах токсичности (БТи) целыми числами (2, 5, 10, 50, 100 и т.д.) соответственно величинам разведения. Баллы токсичности могут быть четко ранжированы и позволяют выстраивать ряд исследуемых веществ или вод по снижению (повышению) уровня их токсичности.

Толерантность (tolerance) - выносливость (устойчивость) организма к повреждающим воздействиям. Диапазон толерантности - пределы колебаний концентраций токсических веществ, при которых не происходит нарушений функций организма.

Толерантный лимит (tolerance limit, TLm) - количественное выражение концентрации токсина, при которой гибнет или выживает 50% тест-организмов за 48 ч опыта.

Токсикорезистентность (toxin resistance) - сопротивляемость живых организмов к воздействию токсических веществ.

Токсикометрия (toxicometry) совокупность приемов оценки токсичности веществ. Основными приемами токсикометрии являются установление минимально переносимой или пороговой (threshold concentration) концентрации (LC₀), медианной летальной концентрации (LС₅₀), или дозы (LD₅₀), и зоны токсического действия (toxic effect limits) - диапазона токсических концентраций - от LC₀ до абсолютно летальной (LC₁₀₀).

Биомаркеры - это организмы и их характеристики, которые позволяют диагностировать текущее состояние окружающей среды. В качестве характеристик могут выступать физиологические, биохимические, иммунологические и другие свойства (процессы) организмов.

Биоиндикация (bioindication) - метод определения качества среды обитания организмов по видовому составу и показателям количественного развития видов биоиндикаторов и структуре образуемых ими сообществ.

Биоиндикатор (bioindicator) - организм, вид, популяция, сообщество, характеризующиеся специфическими особенностями обитания или указывающие на специфические изменения условий среды. Биоиндикаторы делят на следующие группы:

1. Индивидуальные: размер особей, плодовитость, наличие аномальных особей и т.д.

2. Процессы: увеличение или уменьшение скоростей процесса (например, скорости фотосинтеза).

3. Структурные: видовая структура, число толерантных (интолерантных видов), биотические индексы и т.д.

4. Экосистемные: видовое разнообразие, видовая структура.

Биоиндикаторы загрязнения (bioindicators of contamonation) - 1) организмы, которые поглощают (накапливают) токсические вещества и способны в силу этого быть показателями загрязненности воды данным веществом; 2) организмы, свидетельствующие о загрязненности воды. По набору таких организмов в водоеме судят о качестве воды (Кузьменко и др., 1999).

В отличие от биомаркеров, биоиндикаторы не могут мгновенно реагировать на изменение экологических условий, т.к. их индикаторными свойствами являются популяционные процессы и процессы в сообществе в целом. Основным преимуществом биоиндикаторов перед биомаркерами является тот факт, что далеко не всегда кратковременное изменение условий, на которое реагирует биомаркеры, приводит к негативным изменениям в популяциях, сообществах и экосистемах.

Количественные меры токсичности веществ для живых организмов- это показатели острой токсичности NOEC, LC0, LC50, LC100, устанавливаемые для «чистого» вещества при его лабораторном исследовании. Показатели не имеет универсального значения и устанавливается для каждого тест-объекта индивидуально. NOEC - no observed effect concentration - максимально недействующая концентрация вещества; LC₀ - минимальный порог чувствительности, при котором отмечаются специфические тест-реакции или смертность тест-объектов; LC₅₀ - стандартная мера токсичности вещества, показывающая, какая концентрация вещества вызывает гибель 50% тест-организмов за установленное время (24, 48 или 96 ч);LC₁₀₀ - высший смертельный порог для всех животных или тест-культуры водорослей, использованных в опыте.

Биотестирование, как правило, используют до химического анализа, т.к. этот метод позволяет провести экспресс-оценку природной среды и выявить «горячие точки», указывающие на наиболее загрязненные участки акватории (территории, полигона). На участках, где методами биотестирования выявлены какие-либо отклонения, и исследуемая среда характеризуется как токсичная, аналитическим путем необходимо установить причины этого явления.

Существует два методических подхода для определения токсичности почв. Для экспресс-диагностики используют водные экстракты, содержащих водорастворимые фракции почв. В этом случае биотестирование выполняют на традиционных для водной токсикологии тест-объектах - ракообразных, инфузориях, водорослях. При необходимости исследовать фитотоксические свойства почв в качестве тест-объектов используют семена культурных растений - овса, кресс-салата и др. В этом случае показателями токсичности служат энергия прорастания семян, морфометрические характеристики листа и др.

Загрязнение окружающей среды нефтепродуктами может быть охарактеризовано по их содержанию в тканях живых организмов. Так, в тканях рыб и моллюсков из Северной Балтики (Финский архипелаг) определяли алифатические и ароматические углеводороды (Paasivirta et al., 1981).

Хромато-масс-спектрометрический анализ тканей мидий, выловленных в районе Севастопольской бухты, показал наличие насыщенных и ароматических углеводородов, состав которых соответствовал деградировавшим нефтепродуктам в интервале температур кипения дизельного топлива (Савчук, 1995).

1.4 Использование микроорганизмов в токсикометрии

Использование в качестве аналитических индикаторов микроорганизмов нередко является единственно надежным методом определения малых количеств веществ, так как основано на прямом воздействии химического вещества на живую клетку. Ответная реакция микробной культуры на изменение состава среды представляет собой среднее из показателей миллионов отдельных организмов, что обеспечивает наиболее объективные и достоверные результаты.

Однако микробиологические методы недостаточно разработаны как методически, так и в плане инструментального обеспечения. Растущие масштабы их применения для решения разнообразных аналитических задач в медицине, экологии, в фармацевтической, пищевой и парфюмерной промышленности, а также в системе лабораторий, контролирующих качество природных и сточных вод (Nicolas, 1966; Koch et al., 1964; Kavanagh, 1963; Brown et al., 1976) требуют современного аппаратурного оснащения и автоматизации. В связи с этим интересно рассмотреть индикаторные свойства микроорганизмов с точки зрения способов трансформации их в аналитический сигнал, регистрируемы и с привлечением технических средств.

Под действием химических веществ различных концентраций могут изменяться морфологические, культуральные и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов. Например, в присутствии сублетальных концентраций катионов тяжелых металлов изменяются почти все перечисленные свойства микробных клеток, их форма, размеры, ослабляются ростовые процессы, понижается ферментативная активность, интенсивность дыхания (Сенцова и др.,1985). Под действием Ni²⁺ на морскую бактерию Artrobacter тariпиs значительно увеличиваются размеры клеток: при концентрации Ni²⁺4*10^-4 моль объем их за 4.5 ч возрастает в 250 раз (Gobet et al., 1970). В процессе роста бактерий и дрожжей на среде, содержащей медь, размеры клеток уменьшаются (Авакян, 1973). В присутствии комплексных ионов платины клетки Е. coli приобретают нитевидную форму (Rosenberg et al.,1967).

Многие токсические вещества вызывают появление у бактерий слизистой капсулы, предохраняющей клетку от гибели. Под действием фенола, этилового спирта утрачивается подвижность клеток бактерий рода Proteus (Нестерова, 1972). Регистрируют морфологические изменения путем микроскопирования препаратов живых или фиксированных клеток с помощью электронного микроскопа. Предложено также дополнительное устройство, содержащее ряд камер и позволяющее наблюдать за развитием микроорганизмов в проточных питательных средах высокоапертурными объективами микроскопов (Гашинский, 1973).

Способы регистрации информации, получаемой с помощью микробиологических методов многообразны. Они включают визуальные, приборные и математические методы. На визуальной оценке результатов основаны полуколичественные методы определения антибиотиков (Сиволодский, 1974), латекса трибутилоловосодержащего сополимера АБП-10П, метода оценки токсичности сточных вод. Полуколичественный метод определения оловоорганического соединения АБП-10П разработан учеными (Туманов и др., 1998) на основе регистрации ростовых реакций трех различных по чувствительности штаммов бактерий B. laterosporus, B. pumilis 732 и Sarcina lutea (Туманов и др., 1988). Он позволяет определять нерастворимые в воде соединения (без предварительного их разложения) в диапазоне концентраций 2-40 мкг/мл. Метод оценки токсичности сточных вод (Павленко и др., 1988) с использованием условно прототрофного штамма Saccharomyces cerevisiae дает возможность количественно характеризовать токсико-генетическое действие промышленных сточных вод путем регистрации цитостатического и летального эффектов.

При качественном обнаружении и количественном определении биологически активных веществ часто принимают во внимание зависимость культуральных свойств микроорганизмов от химического состава среды. К ним относятся различные ростовые реакции: стимуляция или ингибирование роста в зависимости от концентрации определяемого вещества и связанные с ними изменения численности клеток, продолжительности отдельных фаз роста, динамики накопления биомассы, размеров бактериальных колоний, характера их поверхности и пигментации (Рубенчик, 1972; Глухова, 1980).

Наиболее простым и широко распространённым способом регистрации ростовых реакций микробных культур является измерение диаметра и площади зон угнетения или стимуляции роста бактерий при выращивании их на плотных средах. Этот принцип положен в основу методов определения многих антибиотиков и витаминов (Егоров, 1965). Он реализован при разработке метода определения трилана (4,5,6-трихлорбензоксизалинона-2), используемого для защиты бумаги и изделий из нее от биоповреждений (Туманов и др., 1982). В качестве аналитического сигнала использована ростовая реакция бактерий Bacillus mesentericus 5 Trevisan, характеризующихся повышенной чувствительностью к трилану и устойчивостью в щелочной среде. Диаметр зоны угнетения роста тест-культуры в растворе 0,1 М КОН пропорционален логарифму концентрации указанного соединения. Предложенный способ позволяет определить трилан в диапазоне концентраций от 5 до 100 мкг в 0,1 мл раствора, а также в бумаге.

Для определения этилмеркурхлорида в качестве аналитических индикаторов использовали культуры гриба Aspergillus niger и дрожжей Torula candida, регистрировали их ростовую реакцию измерением площади зон подавления роста. Предел обнаружения - 0,1 мкг/мл, относительная погрешность метода - 10% (Туманов и др.,1982).

Изменения численности микробных клеток под действием биологически активных веществ часто фиксируют с помощью турбидиметрических методов, измеряя оптическую плотность жидкой культурной среды, в которой выращивают микроорганизмы, с помощью фотоэлектроколориметра или нефелометра.

Метод определения загрязнённости вод, описанный в (Потапова и др., 1988), основан на ингибировании роста культур водных бактерий и позволяет оценивать качество сточных вод, содержащих сернокислую медь в концентрации 1Ч10^-3 мг/л и более, смесь пестицидов пропанида и сатурна в концентрациях 5Ч10^-5 и 1Ч10^-3 мг/л, смесь фенола и формальдегида в концентрациях 5Ч10^-2 и 1Ч10^-2 мг/л, соответственно.

Одним из культурных свойств бактерий является способность к образованию пигментов, которая утрачивается при отсутствии в среде некоторых элементов. На этом основан визуальный способ качественного обнаружения катионов железа, меди, магния и некоторых других элементов (Месробяну и др., 1963).

Отклик микроорганизмов на изменение химического состава среды выражается не только в интенсивности процессов воспроизводства (размножения) или ростовых реакциях, но и в разнообразных физиолого-биохимических реакциях.

В качестве аналитического сигнала могут быть использованы термограммы микроорганизмов. В работе (Monk, 1978) приведены доказательства зависимости количества тепла, выделенного микробными клетками, от химического состава среды.

Объективным показателем содержания в среде токсичных примесей могут служить активность данного микроорганизма, которая изменяется в зависимости от концентрации отдельных веществ.

В последние годы для аналитических целей стали использовать люминесцентные свойства светящихся бактерий, принадлежащих к роду Photobacterium и Beneckea. Биолюминесцентный анализ основан на специфических реакциях с высоким квантовым выходом, позволяющих применять их для определения многих биологических активных веществ.

Показана возможность использования светящихся бактерий для определения фенольных компонентов сточных вод (Данилов и др.,1988). В качестве токсинов использовали типичные представители фенолов сточных вод: монофенолы, резорцин, гидрохинон и продукты его окисления н-бензохинон.

Биологический метод анализа может основываться не только на подавлении жизнедеятельности живых организмов. Перспективным приёмам повышения чувствительности этого метода является использование биологического концентрирования. Процесс биологического концентрирования использовали для выделения малых концентраций жизненно-необходимых катионов из разбавленных растворов (Постнов и др., 2000). В качестве аналитического индикатора применён плесневый гриб Aspergillus niger, выращенный на питательном растворе, содержащем определённые количества катионов железа, меди или цинка. Показателем содержания катионов в растворе служила биомасса гриба и данные последующего спектрального определения их в биомассе после высушивания и минерализации. Установлены уровни концентраций катионов, подавляющих рост культуры гриба; они в десятки раз превышают концентрации, стимулирующие её рост. Таким образом, включение в аналитический арсенал методик, основанных на стимуляции роста индикаторных организмов, расширяет границы традиционного биотестирования, значительно повышает чувствительность биологического метода анализа.

Обобщая приведенные данные, касающиеся особенностей микробиологических методов определения токсических веществ, следует отметить многообразие ответных реакций микробных культур на воздействие химических элементов и соединений и разнообразие способов их трансформации в аналитический сигнал. Выбор наиболее эффективных из них зависит от механизма и глубины воздействия вещества на индикаторный организм, что, в свою очередь, определяет чувствительность и избирательность биометода (Туманов, 1998).

В зависимости от целей анализа возможны как визуальные, так и инструментальные способы оценки и регистрации информации, получаемой с помощью микробиологических методов. При контроле химических загрязнений водной среды и анализе их состава предполагается использование специальной аппаратуры типа ферментеров-хемостатов, турбидостатов. В них автоматически поддерживается режим культивирования по основным параметрам среды (растворенный кислород, температура, рН среды, плотность микробной культуры) (Mitruka et al., 1975; Крайнюкова, 1988). Чувствительные и надежные токсикогpафы для регистрации аналитического сигнала позволяют избежать субъективных ошибок и повысить воспроизводимость результатов.

Перспективны в развитии микробиологических методов биоаналитические устройства - биосенсоры, содержащие иммобилизованные клетки микроорганизмов и обеспечивающие контакт определяемым веществом. Их составной часть являются преобразователи биохимической или ростовой реакции микробного индикатора в аналитический сигнал. В этом случае биологический объект выступает в роли первичного источника информации, которая затем воспринимается находящимся в непосредственной близости вторичным - физическим датчиком.

Современные способы быстрого контроля токсических загрязнений природных и сточных вод предусматривают введение биометрической или другой биоэлектрической информации в ЭВМ, пригодной в качестве элемента мониторинга биосферы (Туманов, 1998).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование в качестве аналитических индикаторов микроорганизмов различных систематических и физиологических групп дает возможность создания методов с различной избирательностью определения.

Из приведенного обзора литературы видно, насколько многообразны ответные реакции микробных культур на воздействие химических элементов и соединений, а также насколько разнообразны способы их трансформации в аналитический сигнал. Выбор наиболее эффективных из них зависит от механизма и глубины воздействия вещества на индикаторный организм, что, в свою очередь, определяет чувствительность и избирательность биометода (Туманов, 1998).

Высокая специфичность методов может быть достигнута применением ауксотрофных штаммов, то есть штаммов, зависимых от наличия в среде тех или иных веществ.

В целях повышения избирательнocти и чувствительности определения биологически активных веществ обоснован новый химико-биологический подход, основанный на предварительном, изменении биологической активнocти определяемого вещества в процессе пробоподготовки. Рассматриваются другие приемы решения поставленных задач путем повышения температуры анализируемого раствора, использования экстракции, биоаккумуляции и нестандартных методик анализа (Постнов, 1999).