Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет

Кафедра инфекционных болезней

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

КЛИНИКО - ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА вируса Эпштейн - Барр

Исполнитель: Сопина С. В.

Научные руководители: Красавцев Е. Л., Кугаев О.Л.

Рецензент: Мицура В.М.

ГОМЕЛЬ, 2009

РЕФЕРАТ

Ключевые слова: вирус Эпштейн - Барр, ВЭБ - инфекция, инфекционный мононуклеоз, атипичные мононуклеары, ДНК диагностика, ДНК ВЭБ, ПЦР, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, специфический иммуноглобулин.

Цель работы: освоение методики выявления ДНК ВЭБ у больных с различной инфекционной патологией, определение чувствительности и специфичности выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом.

Практическая значимость: Определены чувствительность и специфичность выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом, даны рекомендации по срокам обследования больных на ДНК ВЭБ.

Область применения: инфекционные болезни.

Экономическая эффективность: приведены показания для обследования на ДНК ВЭБ, рекомендованы рациональные сроки обследования на ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом.

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение вируса Эпштейн - Барр

1.2 Течение ВЭБ - инфекции

1.3 Лабораторная диагностика ВЭБ - инфекции

1.3.1 Стандарт диагностики ВЭБ - инфекции

1.3.2 Алгоритм диагностики ВЭБ - инфекции

1.3.3 Клинический анализ крови

1.3.4 Серологическая диагностика

1.3.5 Принцип ПЦР - диагностики

1.3.6 Иммунологическое обследование

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методика проведения ПЦР - анализа на выявление ДНК ВЭБ в лаборатории Гомельской областной инфекционной клинической больницы

2.2 Учёт результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Выявление ДНК ВЭБ у лиц с различной инфекционной патологией

3.2 Возрастная структура больных ИМ

3.3 Сроки забора материала на ДНК ВЭБ

3.4 Клинические проявления при ИМ

3.5 Картина крови у больных ИМ

3.6 Чувствительность и специфичность метода ПЦР

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

EA - Early Antigen

EBNA-1 - Epstein-Barr Nuclear Antigen

Ig - иммуноглобулин

MA - Membrane Antigen

VCA - Viral Capsid Antigen

Аг - антиген

Ат - антитело

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВЭБ - Вирус Эпштейн - Барр

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИДС - иммунодефицитное состояние

ИМ - инфекционный мононуклеоз

ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЦНС - центральная нервная система

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы: Среди врачей бытует устойчивое представление о вирусе Эпштейн-Барр как возбудителе инфекционного мононуклеоза -- заболевания, характеризующегося самопроизвольным выздоровлением и, в соответствии с классической литературой, не требующего этиотропного или патогенетического лечения, что порождает подчас легкомысленное отношение к инфекции в целом. Однако этиологическая роль ВЭБ при инфекционном мононуклеозе была описана уже после того, как в 1964 г. вирус впервые был обнаружен в лимфоме Беркита. А накопленные за истекший период знания свидетельствуют просто о колоссальной роли ВЭБ в инфекционной, онкологической и иммунологической патологии человека.

Первая встреча с вирусом зависит от социальных условий, в которых проживает человек. Большинство детей в развивающихся странах или в социально - неблагополучных семьях инфицируется ВЭБ в возрасте до 3-х лет. В развитых странах инфицирование ВЭБ может происходить позже.

Контагиозность при ВЭБ - инфекции умеренная, что, вероятно, связано с низкой концентрацией вируса в слюне. На активацию инфекции влияют факторы, снижающие общий и местный иммунитет [1,2]. Вирус Эпштейн - Барр вызывает активную форму заболевания, а также может длительное время персистировать в клетках человека в латентном виде. Особенностью гуморального иммунного ответа на инфекцию, вызванную ВЭБ, является дифференцированная во времени выработка иммуноглобулинов классов G и M на различные белки вируса. Это позволяет с высокой точностью диагностировать различные стадии ВЭБ - инфекции у пациента. Дополнительным подтверждением течения острых стадий инфекционного процесса может служить тест по выявлению ДНК ВЭБ в крови и/или слюне методом ПЦР.

Этот тест весьма эффективен для выявления ВЭБ - инфекции у новорожденных, когда выявление серологических маркеров малоэффективно вследствие несформировавшейся иммунной системы, а также в сложных и сомнительных случаях[1,4].

Цель: освоение методики выявления ДНК ВЭБ у больных с различной инфекционной патологией, определение чувствительности и специфичности выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом.

Задачи:

1. Определить частоту выявления ДНК ВЭБ у лиц с различными клиническими диагнозами;

2. Определить чувствительность и специфичность выявления ДНК ВЭБ у больных инфекционным мононуклеозом;

3. Разработать рекомендации по срокам забора материала у больных с инфекционным мононуклеозом.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение вируса Эпштейн - Барр

Вирус Эпштейн - Барр представляет собой В-лимфотропный вирус человека, который относится к семейству Herpesviridae, подсемейства Gammaherpesviridae, рода Lymphocryptovirus и является вирусом герпеса человека 4 типа. Для него характерна сферическая форма и наличие 4 структурных компонентов: сердцевина, капсид, внутренние оболочки, внешние оболочки. Сердцевина содержит линейную двунитчатую вирусную ДНК длиной 172 тысячи пар оснований, состоит из 80 генов. Диаметр вируса равен 180 нм. В составе вирионов обнаружено более 30 гликопротеидов, которые находятся на поверхности и вызывают образование вируснейтрализующих антител [2,4].

Вирус чувствителен к воздействию эфира, весьма специфичен в отношении роста: размножается в культурах лимфобластов опухоли Беркитта, крови больных ИМ, лейкемических клетках и в культуре клеток мозга здорового человека. Устойчивость ВЭБ во внешней среде низкая. Он быстро погибает при высыхании, высокой температуре, обработке всеми дезинфицирующими средствами [3].

ВЭБ отличается от других вирусов семейства герпеса способностью реплецироваться только в В - лимфоцитах приматов, не вызывая при этом лизиса поражённых клеток. Другой важной особенностью ВЭБ является его способность персестировать в культуре клеток, оставаясь в репрессированном состоянии, и интеграция в определённых условиях с ДНК клетки хозяина [4].

Содержит специфические антигены, которые выявляются с помощью РСК, ИФА, иммунодиффузии:

v капсидный антиген (VCA)

v ранний антиген (EA)

v ядерный антиген (EBNA)

v мембранный антиген (MA)

Проникновение ВЭБ в клетку хозяина является сложным многоступенчатым процессом и включает в себя прикрепление вирионов к клеточным рецепторам, эндоцитоз и слияние мембран вирионов и клетки. В результате этого капсид освобождается от белков внешней оболочки, а комплекс ДНК-белок вируса проникает в ядро [5]. Вирионная ДНК выходит в нуклеоплазму и транскрибируется клеточной РНК - полимеразой, затем проходит процессинг мРНК, синтез кодируемых продуктов и частичный обратный транспорт их в ядро, репликация ДНК и формирование дочерних молекул [6]. Образовавшиеся в ядрах клеток незрелые капсиды попадают в цитоплазму, где заканчивается формирование зрелых капсидов и внешней оболочки вируса с последующим транспортом к поверхности и выходом их из клетки [7]. При проникновении в организм человека первоначально ВЭБ поражает эпителиальные клетки носо - и ротоглотки, а затем инфицирует В-лимфоциты, участвующие в диссеминации возбудителя по организму [8].Схематично жизненный цикл вируса Эпштейн - Барр представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Жизненный цикл вируса Эпштейн - Барр

Эпителиальные клетки могут быть инфицированы вирусом через ВЭБ -специфичный С2 - рецептор. При этом процессы деления, дифференцировки и созревания клеток эпителиального слоя протекают параллельно с процессом активного вирусного воспроизводства [9,10]. Таким образом, "эпителиальная ВЭБ - инфекция" - играет решающую роль в воспроизводстве и пожизненной персистенции вируса в организме человека [11].

1.2 Течение ВЭБ - инфекции

Установлено, что ВЭБ имеет глобальное распространение и обнаруживается у населения всего земного шара. Он является «вездесущим» (убиквитарным) человеческим патогеном, поражающим эпителиальные клетки слизистых оболочек (дыхательных путей, пищеварительного тракта, половых органов), а также клетки иммунной системы, в том числе В-лимфоциты, в которых происходит репликация вирусных частиц [12].

Существует 2 типа EBV - тип 1 и тип 2, также называемые типами А и В. Генетические отличия между типами вируса составляют 25-30%. Оба они циркулируют во всем мире, однако тип 1 имеет большее географическое распространение, тогда как тип 2 чаще встречается в Африке и реже - в странах Северной Америки. Как правило, наличие в организме одного типа ВЭБ предотвращает инфицирование другим, однако описаны случаи инфицирования пациентов обоими типами вируса. Тип 1 ВЭБ способен более активно вызывать трансформацию В-лимфоцитов in vitro, нежели тип 2, однако отличия между типами вирусов в отношении вызываемых симптомов отсутствуют.

В настоящее время доказано, что ВЭБ является этиологическим агентом таких заболеваний, как инфекционный мононуклеоз, назофарингеальная карцинома (НФК), лимфома Беркитта, Т - клеточная лимфома, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, хроническая активная ВЭБ - инфекция, лейомиосаркома, лимфоидная интерстициальная пневмония, "волосатая" лейкоплакия, врожденная ВЭБ - инфекция [13]. В организме ослабленных людей ВЭБ часто может вызывать лимфопролиферативные изменения. Так, у ВИЧ - инфицированных и больных, перенесших курс иммунодепрессивной терапии, проводимый при пересадке органов, нередко наблюдается развитие тяжёлых диссеминированных форм новообразований в лимфоузлах, а также поражение слизистой оболочки рта волосатой лейкоплакией.

У людей без выраженных дефектов иммунной системы инфекция ВЭБ протекает субклинически и сопровождается положительными серологическими реакциями. Однако при массированном поступлении вируса в организм или недостаточности иммунитета может наблюдаться вирусемия. Вирус проникает в лимфоузлы и органы, богатые ретикуло-эндотелиальными клетками, развивается лимфоаденопатия, заметно увеличиваются печень и селезёнка. Симптомы интоксикации и лихорадка обусловлены воздействием токсинов, а катар верхних дыхательных путей, полости рта и глотки - непосредственным воздействием вируса [14,15,16].

Антитела к ВЭБ обнаруживают у 60% детей первых 2 лет жизни и у 80-90% взрослых. Широкому эпидемическому распространению ВЭБ способствуют большое количество больных и лиц, выделяющих вирус, также многообразие путей передачи вируса.

Резервуар и источник инфекции:

o человек с манифестной или стёртой формой болезни;

o носитель возбудителя.

Инфицированные лица выделяют вирус с последних дней инкубации и на протяжении 6-18 месяцев после первичной инфекции. В смывах из ротоглотки у 15-25% серопозитивных здоровых людей также обнаруживают вирус. Эпидемический процесс поддерживают лица, ранее перенёсшие инфекцию и на протяжении долгого времени выделяющие возбудитель со слюной.

Механизм передачи - аэрозольный.

Пути передачи:

· контактно - бытовой (со слюной во время поцелуев матерью своего ребенка);

· парентеральный;

· вертикальный;

· половой путь;

· распространение вируса через предметы обихода или воздушно-капельным путем маловероятно, но в некоторых руководствах указывается на то, что инфекция всё же может передаваться воздушно-капельным путем.

Естественная восприимчивость людей высокая, однако, преобладают лёгкие и стёртые формы болезни. О наличии врождённого пассивного иммунитета может свидетельствовать крайне низкая заболеваемость детей первого года жизни. Иммунодефицитные состояния способствуют генерализации инфекции [17,18,19].

Основные эпидемиологические признаки.

Заболевание распространено повсеместно; в основном регистрируют спорадические случаи, иногда - небольшие вспышки. Наиболее часто заболевают подростки. Лица старше 40 лет болеют редко, но у ВИЧ - инфицированных реактивация латентной инфекции возможна в любом возрасте. При заражении в раннем детском возрасте первичная инфекция протекает в виде респираторного заболевания, в более старших возрастах - бессимптомно. К 30-35 годам у большинства людей в крови выявляют антитела к вирусу инфекционного мононуклеоза, поэтому клинически выраженные формы редко встречают среди взрослых. Заболевания регистрируют на протяжении всего года, несколько реже - в летние месяцы. Заражению способствуют скученность, пользование общим бельём, посудой, тесные бытовые контакты [20].

Общепринятая классификация заболевания отсутствует.

Клинические формы ВЭБ - инфекции: 1) инфекционный мононуклеоз; 2) хроническая активная ВЭБ - инфекция; 3) X-сцепленная лимфопролиферативная болезнь: *летальный инфекционный мононуклеоз,? *приобретенная гипогаммаглобулинемия, *злокачественные?лимфомы; 4) назофарингеальная карцинома; 5) лимфома Беркита; 6) болезнь Ходжкина; 7) лимфопролиферативная болезнь: *плазматическая? гиперплазия, *В-клеточная гиперплазия,? *В-клеточная лимфома,? *иммунобластная лимфома.

Таким образом, выделяют опухолевые и неопухолевые формы ВЭБ - инфекции, при которых вирус играет роль этиологического фактора [21,22,23].

Возможно несколько вариантов исхода острого инфекционного процесса:

1. выздоровление (ДНК ВЭБ можно выявить только при специальном исследовании в единичных В - лимфоцитах или эпителиальных клетках);

2. бессимптомное вирусоносительство или латентная инфекция (вирус определяется в слюне или лимфоцитах при чувствительности метода ПЦР 10 копий в пробе);

3. хроническая рецидивирующая инфекция:

а) хроническая активная ВЭБ - инфекция по типу хронического инфекционного мононуклеоза;

б) генерализованная форма хронической активной ВЭБ - инфекции с поражением ЦНС, миокарда, почек и др.;

в) ВЭБ - ассоциированный гемофагоцитарный синдром;

г) стертые или атипичные формы ВЭБ - инфекции: длительный субфебрилитет неясного генеза, клиника вторичного иммунодефицита -- рецидивирующие бактериальные, грибковые, часто микст - инфекции респираторного и желудочно-кишечного тракта, фурункулез и другие проявления;

4. развитие онкологического (лимфопролиферативного) процесса (множественные поликлональные лимфомы, назофарингеальная карцинома, лейкоплакии языка и слизистых ротовой полости, рак желудка и кишечника и др.);

5. развитие аутоиммунного заболевания -- системной красной волчанки, ревматоидного артрита, синдрома Шегрена и др. (следует отметить, что две последние группы заболеваний могут развиваться через большой промежуток времени после инфицирования);

6. ВЭБ может играть важную роль в возникновении синдрома хронической усталости.

Пожалуй, наиболее распространенным заболеванием, вызываемым ВЭБ, является инфекционный мононуклеоз - острое вирусное заболевание, известное как болезнь Филатова, моноцитарная ангина, идиопатическая железистая лихорадка, болезнь Пфейффера, острый доброкачественный лимфобластоз. До 60% заболевших инфекционным мононуклеозом - это лица в возрасте 2-20 лет. Следует отметить, что у детей первых 4-х лет жизни инфицирование ВЭБ чаще всего не сопровождается клиническими проявлениями и происходит бессимптомно, либо проявляется как респираторная вирусная инфекция. Если же первая встреча с ВЭБ приходится на более старший возраст, то возникают клинические проявления типичного ИМ.

Основные синдромы ВЭБ -инфекции:

I. Острое начало, с повышения температуры тела и появления симптомов интоксикации; реже отмечается постепенное начало: несколько дней наблюдается недомогание, слабость, вялость, снижение аппетита. Температура тела субфебрильная или нормальная. Ко 2-4-му дням болезни температура достигает 39-40°С; лихорадка и симптомы интоксикации могут сохраняться в течение 2-3 и более недель.

II. Генерализованная лимфаденопатия относится к патогномоничным симптомам ВЭБ и с первых дней болезни проявляется в виде системного поражения 5-6 групп лимфоузлов (ЛУ), с преимущественным увеличением до 1-3 см в диаметре переднее - и заднешейных, подчелюстных ЛУ. ЛУ слегка болезненны при пальпации, не спаяны между собой и окружающими тканями, располагаются в виде «цепочки», «пакета»; видны при повороте головы, придают шее «фестончатые» очертания. Иногда отмечается пастозность мягких тканей над увеличенными ЛУ.

III. Тонзиллит -- наиболее частый и ранний симптом ВЭБ - инфекции, сопровождается увеличением миндалин до II-III степени. Лакунарный рисунок подчеркнут за счет инфильтрации ткани миндалин или сглажен из-за лимфостаза. На миндалинах -- налеты желтовато-белого или грязно-серого цвета в виде островков, полосок. Они исходят из лакун, имеют шероховатую поверхность (напоминают кружево), легко снимаются без кровоточивости, растираются, не тонут в воде. Характерно несоответствие размера налета и степени увеличения регионарных ЛУ. При фибринозно - некротическом характере налетов в случае их распространения за пределы миндалин необходим дифференциальный диагноз с дифтерией. Налеты на миндалинах исчезают, как правило, через 5-10 дней.

IV. Признаки аденоидита обнаруживают у подавляющего большинства больных. Отмечаются заложенность носа, затруднение носового дыхания, храпящее дыхание с открытым ртом, особенно во сне. Лицо больного приобретает «аденоидный» вид: одутловатость, пастозность век, переносицы, дыхание через открытый рот, сухость губ.

V. Гепатомегалия может быть обнаружена с первых дней болезни, однако чаще выявляется на второй неделе. Нормализация размеров печени происходит в течение полугода. У 15-20% больных в качестве осложнения развивается гепатит.

VI. Спленомегалия относится к поздним симптомам, встречается у большинства больных. Нормализация размеров селезенки происходит в течение 1-3 недели.

VII. Экзантема при ВЭБ появляется на 3-14-й дни болезни, имеет полиморфный характер -- пятнистая, папулезная, пятнисто-папулезная, розеолезная, мелкоточечная, геморрагическая. Определенной локализации нет. Сыпь наблюдается в течение 4-10 дней, иногда оставляет пигментацию [24,25,26,27].

Для перечисленных ниже заболеваний доказана ассоциация с инфекцией вирусом Эпштейн - Барр [28].

Ш Болезнь Ходжкина (лимфогранулематоз) (англ.Hodgkin's disease)

Ш Волосатая лейкоплакия (Hairy leukoplakia)

Ш Гепатит

Ш Инфекционный мононуклеоз (мультигландулярный аденоз, железистая лихорадка, болезнь Филатова)

Ш Лимфома Беркитта (центральноафриканская лимфома)

Ш Множественный склероз

Ш Назофарингеальная карцинома (носоглоточное раковое образование)

Ш Неходжкинкие лимфомы, включая лимфому Бэркита

Ш Общая вариабельная иммунная недостаточность

Ш Первичная церебральная лимфома

Ш Пострансплантационные лимфопролиферативные расстройства

Ш Синдром Алисы в стране чудес (англ. Alice in Wonderland syndrome)

Ш Синдром Стивенса Джонсона (англ. Stevens Johnson syndrome)

1.3 Лабораторная диагностика ВЭБ - инфекции

1.3.1 Стандарт диагностики ВЭБ - инфекции

В обязательный стандарт диагностики ВЭБ - инфекции входят:

ь клинический анализ крови;

ь общий анализ мочи;

ь биохимическое исследование крови;

ь бактериологическое исследование слизи ротоглотки и носа;

ь серологические маркеры ВЭБ, других герпес-вирусов, хламидий, микоплазм;

ь УЗИ органов брюшной полости;

ь консультация ЛОР - врача;

ь по показаниям -- рентгенография придаточных пазух носа, органов грудной клетки;

ь ЭКГ.

Дополнительный стандарт диагностики (в специализированном лечебно-профилактическом учреждении):

Ш маркеры ВЭБ, других герпес - вирусов, хламидий, микоплазм методом полимеразной цепной реакции (ПЦР);

Ш иммунограмма второго уровня;

Ш консультация иммунолога;

Ш по показаниям -- коагулограмма, морфологическая картина стернальной пункции;

Ш консультация гематолога, онколога [29].

1.3.2 Алгоритм диагностики ВЭБ - инфекции

Лабораторная диагностика ВЭБ - инфекции базируется на цитологическом исследовании крови или костного мозга, серологических исследованиях (определение гетерофильных и противовирусных антител) и ПЦР. Алгоритм лабораторной диагностики представлен в таблице 1. ВЭБ может быть обнаружен методом ПЦР в сыворотке крови, слюне, ткани опухоли и костном мозге. При этом важно сопоставление результатов клинических, серологических и молекулярных обследований в определении ВЭБ - инфекции, как причины имеющегося заболевания [30].

вирус дезоксирибонуклеиновый инфекционный чувствительность

Таблица 1 - Лабораторная диагностика и клиническая значимость маркеров ВЭБ - инфекции

Маркер ВЭБ - инфекции	Время возникновения	Клиническое значение
Гетерофильный тест	С момента развития болезни до нескольких месяцев	Острая стадия ИМ, отражает темпы реконвалесценции, дифференцирование между первичной и реактивацией хронической ВЭБ - инфекции
VСА - Ig М	С момента развития болезни до двух месяцев	Острая стадия ИМ
ЕА - Ig G	С первой недели болезни до нескольких лет (в норме)	Острая стадия ИМ, коррелирует с тяжестью болезни, при персистировании более двух - трёх лет указывает на хроническую форму ВЭБ - инфекции
ЕВNА -Ig G	Через несколько недель после клинических проявлений с последующим пожизненным персистированием	Стадия реконвалесценции, анамнестические антитела
ДНК в плазме	До клинических проявлений болезни	Репликация вируса в организме, показание к противовирусной терапии и критерии эффективности проведенного лечения

1.3.3 Клинический анализ крови

1. незначительный лейкоцитоз (до 15-20x10⁹ клеток/л);

2. лимфомоноцитоз с атипичными мононуклеарами (в анализе крови в разгар заболевания отмечается значительное преобладание (иногда до 90%) лимфомононуклеарных клеток с характерной широкой и базофильной цитоплазмой. Часть из них имеет обычную морфологию, другие мононуклеары атипичны со значительной степенью полиморфности. Определение процентного содержания таких мононуклеарных клеток имеет важное значение для диагностики инфекционного мононуклеоза. Считается, что для постановки диагноза ИМ достаточно обнаружения 10-20% атипичных мононуклеаров. Однако гематологические изменения, напоминающие картину ИМ, могут наблюдаться при цитомегаловирусной инфекции, токсоплазмозе, острых респираторных вирусных заболеваниях, ветряной оспе, кори, инфекционных гепатитах и других заболеваниях. Поэтому для постановки дифференциального диагноза необходимо проведение дополнительных лабораторных исследований);

3. гемолитическая анемия вследствие гемофагоцитарного синдрома или аутоиммунная анемия;

4. тромбоцитопения или тромбоцитоз [31].

1.3.4 Серологическая диагностика

Одним из первых, получивших широкое распространение методов серологической диагностики заболеваний, связанных с ВЭБ, является непрямой иммунофлюоресцентный анализ вирусспецифических Ат. В качестве антигена в нем используется вирус, культивированный на лимфобластоидных клетках. Данный метод до настоящего времени считается "золотым стандартом" серодиагностики ВЭБ, хотя его трудно стандартизировать за счет вариабельности как антиген - продуцирующих клеток, так и характеристик препарата антигена. Кроме того, в нем применяется визуальная, т.е. субъективная оценка результатов анализа, и он не поддаётся автоматизации.

Более перспективным, простым в постановке, пригодным для рутинных массовых анализов и поэтому приобретающим широкую популярность методом серодиагностики ВЭБ инфекций является иммуноферментный анализ. Он позволяет решить перечисленные выше проблемы, а кроме того, использовать для анализа отдельные высокоочищенные и стандартизованные белки-антигены ВЭБ, полученные методами генной инженерии[32].

Методом иммуноферментного анализа определяют Ат к антигенам ВЭБ, что позволяет осуществить лабораторную диагностику ВЭБ и определить период инфекционного процесса.

Особенностью гуморального иммунного ответа человека на инфекцию ВЭБ является дифференцированная во времени наработка иммуноглобулинов классов G и M на различные вирусные белки. Это позволяет с высокой эффективностью диагностировать различные стадии ВЭБ - инфекции у пациента. На графике 1 приведена в общем виде динамика наработки антител к различным группам иммуногенных белков ВЭБ при типичном развитии инфекционного процесса в организме человека.

График 1 - Динамика наработки антител к различным группам иммуногенных белков ВЭБ в организме человека

v EA (Early Antigen) - ранний антиген, включает белки р54, р138, соответственно диффузный (EA-D) и рестриктрирующий (EA-R) компоненты;

v EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen) - ядерный антиген, белок р72;

v VCA (Viral Capsid Antigen) - капсидный антиген, включает комплекс белков р150, р18, р23; к настоящему времени показано, что иммунодоминантными белками в этом комплексе являются р18 и р23;

v MA (Membrane Antigen) - мембранный белок, gh125 (BAKF4). Антитела к ядерному антигену вируса Эпштейн - Барр (EBV-EBNA). Появляются спустя недели или месяцы после начала болезни (на стадии реконвалесценции) и сохраняются всю жизнь (кроме лиц с иммунодефицитом);

Ат класса IgM к VCA появляются одновременно с клиникой острой ВЭБ - инфекции, сохраняются в течение 2-3 месяцев, повторно синтезируются при реактивации ВЭБ. Длительная персистенция высоких титров этих Ат характерна для хронической ВЭБ - инфекции, ВЭБ - индуцированных опухолей, аутоиммунных заболеваний, ИДС;

Ат класса IgG к EA достигают высокого титра на 3-4-й неделе острой ВЭБ инфекциии, исчезают через 2-6 месяца. Они появляются при реактивации, отсутствуют при атипичной форме ВЭБ - инфекции.

Высокие титры Ат данного класса выявляют при хронической ВЭБ ? инфекции, ВЭБ - индуцированных онкологических и аутоиммунных заболеваниях, ИДС;

Ат класса IgG к EBNA появляются через 1-6 месяцев после первичной инфекции. Затем их титр уменьшается и сохраняется в течение всей жизни. При реактивации ВЭБ - инфекции происходит повторное увеличение их титра [33,34].

Ранние антигены ВЭБ экспрессируются на первых стадиях вирусной репликации в клетках до начала синтеза вирусной ДНК. NА-1 участвует в образовании нуклеопротеинового комплекса, включающего двухспиральную вирусную ДНК, а VCA формирует оболочку капсида ВЭБ.

Таблица 2 - Иммунный ответ на разных клинических стадиях инфекционного мононуклеоза

Маркер	Острая фаза	Транзиторная фаза	Рековалесцентная фаза
VCA-Ig G	нарастают	персистируют на невысоком уровне	персистируют пожизненно на невысоком уровне
VCA-Ig M	присутствуют	снижаются	нет или очень мало
EBNA-1 Ig G	нет или очень мало	начинают нарастать	персистируют пожизненно на невысоком уровне
EA Ig G	начинают нарастать	персистируют на невысоком уровне	персистируют пожизненно на невысоком уровне
гетерофильные антитела	присутствуют	снижаются	нет или очень мало

В таблице 3 приведена возможная интерпретация результатов комплексного тестирования с применением ИФА. Активная фаза инфекционного мононуклеоза характеризуется продукцией у больного IgM и IgG к VCA и, в большинстве случаев, наличием IgG и IgM, специфичных к комплексу ранних антигенов.

Таблица 3 - Интерпретация серологических данных при ВЭБ - инфекциях

АТ к NA-1 начинают детектироваться в крови инфицированных только через 3-6 месяцев. Их концентрация сохраняется на достаточно высоком уровне длительное время, почти всю жизнь.

АТ к ЕА могут обнаруживаться у больных в сроки от нескольких месяцев до года. При реактивации инфекции происходит сероконверсия антител (как IgG, так и IgM) к VCA и ЕА. При этом концентрация АТ в крови быстро достигает высоких значений. Следует подчеркнуть, что, как правило, это происходит при наличии у больного высоких тиров IgG к NA-1. Отсутствие маркера IgG-NA-1 в крови наблюдается иногда при иммунодефицитных состояниях больного.

Считают, что увеличение титров IgG к VCA и ЕА можно рассматривать как индикатор усиливающейся активности ВЭБ или реактивацию инфекции, нередко происходящую у больных лимфомой Беркитта, назофарингеальной карциномой или при иммунодефицитных состояниях.

Для более эффективной диагностики рекомендуется наблюдать изменение профиля АТ к ВЭБ в крови в течение длительного периода времени, а также использовать тест-системы с различными вирусными белками-антигенами [35].

1.3.5 Принцип ПЦР - диагностики

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство нуклеиновой кислоты (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты нуклеиновой кислоты. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой нуклеиновой кислоты (НК). После этого синтезируются два коротких ДНК - зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК - мишени. Праймер - самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК [36]. Ход ПЦР схематично показан на рисунке 2, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате - термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера.

В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии (рисунок 3). Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксированно искусственно синтезированным праймером.



Рисунок 2 - ПЦР: Полимеразная Цепная Реакция (Andy Vierstraete, 2001)

Рисунок 3 - Экспоненциальная амплификация ДНК в ПЦР (Andy Vierstraete, 2001)

Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР - фрагмент НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования.

Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом электрофореза в геле [37].

1.3.6 Иммунологическое обследование

Желательно оценить основные показатели противовирусной защиты: состояние системы интерферона, уровень иммуноглобулинов основных классов, содержание цитотоксических лимфоцитов (CD8+), Т-хелперов (CD4+).

В иммунном статусе при ВЭБ - инфекции встречаются два вида изменений: повышенная активность отдельных звеньев иммунной системы и/или дисбаланс и недостаточность других. Признаками напряженности противовирусного иммунитета могут быть повышенные уровни интерферона в сыворотке крови, IgА, IgМ, IgЕ, циркулирующие иммунные комплексы, нередко -- появление антител к ДНК, повышение содержания естественных киллеров (CD16+), Т-хелперов (CD4+) и/или цитотоксических лимфоцитов (CD8+). Система фагоцитов может быть активирована.

В свою очередь, иммунная дисфункция/недостаточность при этой инфекции проявляется снижением способности к стимулированной продукции интерферона -альфа и/или гамма, дисиммуноглобулинемией (снижение содержания Ig G, реже-Ig А, повышение содержания Ig М), снижением авидности антител (их способности прочно связываться с антигеном), снижением содержания DR+ лимфоцитов, CD25+ лимфоцитов, то есть активированных Т-клеток, уменьшением числа и функциональной активности естественных киллеров (CD16+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), снижением функциональной активности фагоцитов и/или изменением (извращением) их реакции на стимулы, в том числе на иммунокорректоры [31].

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были госпитализированные больные Гомельской областной инфекционной клинической больницы, обследованные на ВЭБ - инфекцию за февраль - май 2008 года. Основным лабораторным методом диагностики ВЭБ - инфекции в лаборатории инфекционной больницы является метод полимеразной цепной реакции.

2.1 Методика проведения ПЦР - анализа на выявление ДНК ВЭБ в лаборатории Гомельской областной инфекционной клинической больницы

Методика проведения анализа включает три стадии:

1. Выделение ДНК из клинического образца.

2. Проведение ПЦР - амплификации

3. Детекция продуктов ПЦР - амплификации методом электрофореза в агарозном геле.

Для ПЦР - анализа ВЭБ - инфекции в лаборатории Гомельской областной инфекционной больницы используются наборы фирмы «АмплиСенс» (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).

Таблица 4 - Состав комплекта

Реактив	Объем (мл)
Лизирующий раствор	30
Раствор для отмывки 1	30
Раствор для отмывки 2	100
Сорбент универсальный	1,25
ТЕ-буфер для элюции ДНК	5,0

Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 100 проб, включая контроли. Объем пробы, необходимый для выделения ДНК, - 0,1 мл.

Дополнительно к комплекту реагентов прилагается контрольный образец этапа выделения:

Реактив	Объем(мл)
ОКО	1,6

Взятие клинического материала. Транспортирование и хранение проб.

Для проведения анализа используется цельная кровь. Забор крови проводится утром натощак в пробирку типа Vacuette, с 6 % раствором ЭДТА из расчета 50 мкл ЭДТА на 1 мл крови. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают, чтобы перемешать консервант.

Хранить материал можно не более 1 суток при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 16 °С. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.

Доставка проб осуществляется в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами.

ЭТАП 1. Выделение ДНК из проб (проводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки исследуемого материала).

На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Обработка заключается в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК. В случае обработки сыворотки или плазмы крови необходима депротеинизация фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом. Обработка производится в микроцентрифужных пробирках типа "Eppendorf" объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5-2 часа.

Материалы и оборудование:

1. Ламинарный бокс.

2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.

3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин.

4. Вортекс.

5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости.

6. Набор электронных или механических дозаторов переменного объема.

7. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл.

8. Штативы для наконечников и микропробирок на 1,5 мл.

9. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл.

10. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл.

11. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16^оС.

12. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

13. Емкость с дезинфицирующим раствором.

Порядок работы:

1. Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60-65°С до полного растворения кристаллов.

2. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный и положительный контроли выделения). Внести в каждую пробирку по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

3. В пробирки с лизирующим раствором внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения внести 100 мкл ОКО. В пробирку положительного контроля (ПК) выделения внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО ДНК ВЭБ.

4. Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 °С.

Процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

5. Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.

6. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

7. Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

8. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

9. Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, следуя п. 8, удалить надосадочную жидкость полностью.

10. Поместить пробирки в термостат с температурой 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

11. В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе.

Поместить в термостат с температурой 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

12. Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР. Пробы транспортировать аккуратно, не взмучивая сорбент.

Очищенную ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °С, и в течение года при температуре не выше минус 16 °С.

ЭТАП 2. Проведение ПЦР - амплификации (проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения ПЦР - амплификации).

Общий объем реакции - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в методике подобрана "гнездная" (nested) система праймеров, комплементарных 5?-нетранслируемой области вирусного генома. Используются 2 пары праймеров ("внешние" - для 1 стадии, и "внутренние" - для 2-ой стадии). В этом случае продукт амплификации с внешней парой праймеров служит матрицей для амплификации с внутренней парой праймеров.

Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа "Eppendorf" объёмом 0,5мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Затем в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор) и проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. Время проведения реакции в зависимости от заданной программы составляет 2-3 часа. Контроль реакции осуществляется одновременно с постановкой ПЦР на клиническом материале: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды. Отрицательный контроль необходим, чтобы проверять компоненты реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя и исключить учет ложноположительных результатов.

Материалы и оборудование:

1. Амплификатор для микропробирок 0,5 мл; для микропробирок 0,2 мл.

2. ПЦР-бокс.

3. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.

4. Вортекс.

5. Набор электронных или механических дозаторов переменного объема.

6. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 (0,2) мл.

7. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл.

8. Штативы для наконечников и микропробирок на 0,5 (0,2) мл.

9. Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.

10. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

11. Емкость для сброса наконечников.

Порядок работы:

Во всех наборах для амплификации семейства «АмплиСенс» обязательно применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска, перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95°С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР

1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР - смесью-1-R ВЭБ для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

2. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R EBV.

3. Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР.

Б. Проведение амплификации

1. Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с аэрозольными барьерами, внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из исследуемых или контрольных проб этапа выделения ДНК.

2. Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К-) - вместо ДНК-пробы внести в подготовленную пробирку 10 мкл ДНК-буфера;

б) положительный контроль (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК ВЭБ.

3. Запустить на амплификаторе нужную программу (см. таблицу 5). Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы) поставить пробирки в ячейки амплификатора и нажать кнопку продолжения программы.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

Таблица 5 - Программа для амплификации ДНК вируса Эпштейн - Барр

	Амплификаторы с регулированием температуры по матрице:«MiniCycler», «PTC-100» («MJ Research»)	Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): «GeneAmp PCR System 2400» («Perkin Elmer»), «Omn-E» («Hibaid»), «Терцик» («ДНК-Технология»)
цикл	температура	время	циклов	температура	время	циклов
0	95 °С	пауза	95 °С	пауза
1	95 °С	2 мин	1	95 °С	2 мин	1
2	95 °С	1 мин	42	95 °С	10 с	42
	65 °С	1 мин		65 °С	10 с
	72 °С	1 мин		72 °С	10 с
3	72 °С	1 мин	1	72 °С	1 мин	1
4	10 °С	Хранение	10 °С	Хранение

4. Время амплификации на амплификаторе с регулированием температур по матрице примерно 2 ч, на амплификаторе с активным регулированием - 1 ч 30 мин.

5. После окончания реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР - амплификации (ЗОНУ 3).

Пробы после амплификации можно хранить в течение 16 ч при комнатной температуре, в течение 1 недели при температуре от 2 до 8°С (однако, перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска).

Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.

ЭТАП 3. Детекция продуктов ПЦР - амплификации методом электрофореза в агарозном геле (проводится в ЗОНЕ 3 - помещении для детекции продуктов ПЦР - амплификации).

В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном или полиакриамидном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ - облучения (длина волны 290-330 нм) способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или нa водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50-60°С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. После застывания геля в карманы наносится амплификат, смешанный с буфером для нанесения образца, содержащего краситель. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин. Гель просматривают в ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора и, желательно фотографируют. Результат оценивают по наличию в анализируемой пробе фрагмента ДНК, полоса которого располагается на том же уровне, что и полоса контрольного препарата ДНК. Такие фрагменты синтезируются только при наличии в исследуемом материале клеток соответствующего возбудителя.

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР - амплификации

Проводится в зоне 3 - комнате для анализа продуктов амплификации.

Работа с амплифицированными ДНК должна проводится в отдельной комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляции в зоне 1 и 2. Перед проведением электрофореза в пробирки с продуктами амплификации вносится фермент урацил - ДНК - гликозилаза.

Приготовление рабочих растворов и агарозного геля

1. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трис- боратного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать. ВНИМАНИЕ! Бромид этидия - канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке.

2. Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой -- 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65-70 ?С.

3. Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.

Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

Толщина геля должна быть около 0,6 см.

4. После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Материалы и оборудование:

1. Камера для горизонтального электрофореза объёмом не более 400 мл.

2. Источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В.

3. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей .

4. Видеосистема с цифровой камерой для регистрации результатов и передачи изображения.

5. Аквадистиллятор.

6. Холодильник от 2 до 8 °С.

7. Микроволновая печь для плавления агарозы.

8. Колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы на 250 мл.

9. Мерный цилиндр на 1 л.

10. Штатив для микропробирок на 0,5 (0,2) мл.

11. Отдельный механический или электронный дозатор объемом 10-40 мкл.

12. Одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе.

13. Пластиковая ёмкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

14. Отдельный халат и одноразовые перчатки.

Порядок работы:

1. Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10-15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.

2. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры «SE-2» («Хеликон») и источника питания «Эльф-4» («ДНК-Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза - 18-20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.