Клинико-морфологические особенности рака прямой кишки у пациентов с различной выживаемостью

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Клинико-морфологические особенности рака прямой кишки у пациентов

с различной выживаемостью

Исполнитель

Д.Н. Войтенко

Перечень условных сокращений

Ат - антитело

ВНРТК - врожденный неполипозный рак толстого кишечника

ИГХ - иммуногистохимия

ИГХМ - иммуногистохимический метод

ИО - иммунный ответ

КРР - колоректальный рак

ЛУ - лимфатический узел

ОАМ - опухолeассоциированные макрофаги

ПКР - послеоперационные края резекции

ПЛТ - предоперационная лучевая терапия

РОК - рак ободочной кишки

РПК - рак прямой кишки

ХЛ - хирургическое лечение

ХГА - хромогранин А

ЭК - эндотелиальные клетки

G - грейд

VEGF - васкулярный эндотелиальный фактор роста

ДК - дендритные клетки

Введение

По данным канцер-регистра в Республике Беларусь с 1990 по 2006 годы, заболеваемость раком прямой кишки (РПК) увеличилась в 1,4 раза (с 13,0 до 17,9 на 100000 населения). Заболеваемость РПК населения в Беларуси в 2009 г. составила 19,2 на 100000 населения [1,2].

В настоящее время для диагностики и прогнозирования течения и исходов различных форм злокачественных новообразований прямой кишки кроме традиционных критериев (возраст пациента, размер опухоли, форма и темп роста, локализация в различных отделах прямой кишки, наличие регионарных и отдаленных метастазов, гистологическая форма, степень злокачественности) применяются молекулярно-генетические маркеры.

Для понимания биологических особенностей канцерогенеза РПК современные международные стандарты диагностики злокачественных новообразований предусматривают комплексное исследование опухолевых биоптатов. Комплексный анализ факторов, участвующих в поддержании тканевого гомеостаза РПК, включает в себя оценку пролиферативной активности (Ki-67, циклин D1), апоптоза (p53, bcl-2), уровень секреции иммуноглобулинов (IgA), характеристику Т-клеточного звена (CD3) и В-клеточного звена (CD20) местного иммунитета, наличие ОАМ (CD68), состояние сосудов микроциркуляторного русла и более крупных сосудов (CD34), наличие эндокринных клеток в паренхиматозном компоненте (ХГА) и др. Ещё одной из причин немногочисленного внедрения молекулярных маркеров в диагностическую практику является высокая стоимость подобных исследований и сложность интерпретации данных одновременного анализа множества прогностических факторов. Тем не менее, даже использование традиционных молекулярных маркеров и корреляция их с клинико-морфологическими показателями с последующим статистическим анализом позволит получить достоверные данные не только о чувствительности опухоли к различным видам терапии, но и разработать модели индивидуального прогнозирования течения заболевания [3, 4, 5].

Целью работы: анализ клинико-морфологических и иммуногистохимических показателей рака прямой кишки у пациентов после радикальной операции.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести оценку клинико-морфологических показателей рака прямой кишки.

2. Провести анализ иммуногистохимических показателей рака прямой кишки

3. Определить прогностическую значимость клинико-морфологических и иммуногистохимических маркеров для определения выживаемости пациентов.

Глава 1. Обзор литературы

рак хирургический лечение

1.1 Этиология, пато- и морфогенез

Среди предполагаемых этиологических факторов можно выделить роль питания и внешней среды. Низкий уровень заболеваемости встречается у вегетарианцев, а высокий - среди людей, употребляющих пищу богатую белками, легкоусвояемыми углеводами, и животными жирами.[6-8]

Среда с высоким содержанием жиров является донором экзогенных фосфолипидов, которые метаболизируются бактериальная флорой кишечника в диацилглицерол, который проникает в клетки эпителия кишечника, стимулируя активность протеинкиназы-С и активизирует механизмы внутриклеточной пролиферации.[9,10]

Высока частота колоректальных карцином среди рабочих асбестовых производств, лесопилок, при попадании в организм афлaтоксина. К группе канцерогенных факторов относится также курение и ожирение.[11-13]

Лучевая терапия, применяемая для лечения новообразований органов малого таза, способствует развитию радиационного индуцированного колита и является фактором риска РПК. [14,15]

Возраст больных влияет на течение РПК: у молодых лиц агрессивно протекающая малодифференцированная форма часто ассоциируется с длительно протекающими заболеваниями: неспецифическим язвенным колитом, семейным аденоматозным полипозом, врожденным неполипозным раком толстого кишечника. Хотя эта группа не является многочисленной: лица старше 40 лет составляют до 98% больных. [16,17]

Модель «ступенчатого» канцерогенеза является наиболее обоснованной для объяснения морфогенеза КРР и представляет цепь последовательных изменений: мутаций в онкогенах и генах-супрессорах приводят к снижению метилирования ДНК и активации ras-онкогена, что способствует гиперплазии, образуются очаговые пролифераты с регенерацией и метаплазией, аденомы, дисплазия, прединвазивный рак, инвазивный рак.

1.2 Маркеры онкогенеза, их прогностическая значимость

Фактор транскрипции р53 является центральным интегратором клеточного ответа на стресс, повреждения ДНК, а также играет важную роль в процессах канцерогенеза. В результате мутаций опухолевый супрессор р53 трансформируется в онкоген, запуская экспрессию генов, негативно регулирующих клеточный цикл или вызывающих апоптоз. Белок р53 локализуется в ядре клеток и очень нестабилен. Вещества, повреждающие ДНК, делают его стабильным и поэтому его концентрация в ядре резко повышается. Белок р53 способствует остановке клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. M. Diez и соавторы установили что гиперэкспрессия р53 в ткани РПК встречается в 43-59% случаев и ассоциируется со сниженной дифференцировкой опухоли, распространенной стадией опухолевого процесса, ранним развитием рецидивов и метастазов. [18-20]

Белок BCL2, кодирующийся геном BCL2, также является регулятором апоптоза. Нарушение экспрессии этого гена может увеличивать продолжительность жизни клеток без влияния на их пролиферацию. Высокое содержание BCL2 в клетке способствует ее выживанию, предохраняя от апоптоза. Механизм его действия связан с перераспределением кальция внутри клетки. В то же время высокая концентрация р53 приводит к уменьшению концентрации BCL2. Мутация только р53, либо мутация р53 и BCL2 не приводят клетку к апоптозу и это является основной причиной выживания клеток с поврежденным геномом. В некоторых работах показана прямая связь между экспрессией BCL2 и нейроэндокринной дифференцировкой опухоли. [21] Имеются сообщения, что гиперэкспрессия в тканях КРР BCL2 и отсутствие экспрессии p53 ассоциируется с более благоприятным прогнозом. [22-24]

Для оценки пролиферативной активности используется протеин Ki-67. Известно, что пациенты с одновременной гиперэкспрессией р53 и Ki-67 имеют меньшую продолжительность жизни. [25]

Для исследования клеточного цикла используются циклины - белки, оказывающие регулирующий эффект на рост активированной клетки. Этот эффект реализуется посредством активации циклинзависимых киназ (cdk2). В настоящее время принята классификация циклинов в соответствии с фазами клеточного цикла: циклины фазы G1 - D1, D2 и D3, циклины S-фазы - A и Е, фазы G2/M - B1 и B2. Уровень циклинов направленно меняется в ходе клеточного цикла таким образом, что в каждой стадии цикла активен обычно только один определенный комплекс Cdk. Прогрессию фаз G1>S регулируют циклин D-, E- и A-зависимые киназы, а фаз G2>М - циклин-В-зависимые. [26]

Местный имунный ответ, представленный макрофагами, гистиоцитами, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами, имеет определенную прогностическую значимость и направлена на ограничение местного роста опухоли. Большое количество гистиоцитов и макрофагов в опухоли - хороший прогностический признак. При злокачественных новообразованиях формируется субпопуляция супрессорных макрофагов, способных блокировать иммунологическую реактивность иммунокомпетентных клеток посредством продуцирования простагландинов, радикалов кислорода и продуктов метаболизма арахидоновой кислоты. [27] Для идентификации ОАМ применяется маркер CD68, который является гликозилированным трансмембранным протеином, участвующим в движении лизосом. Он экспрессируется во всех клетках, содержащих лизосомы (моноциты, дендритные клетки (ДК). Данные о прогностической значимости содержания в перитуморозном инфильтрате макрофагов и дендритных клеток неоднозначны, поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения роли макрофагов в противоопухолевом иммунитете. [28,29]

S100-протеины представляют собой кальций-связывающие протеины, которые являются маркером ДК, которые присутствуют в следовых количествах во всех органах, в том числе и в слизистой кишечника. Миелоидные предшественники дифференцируются в классические эпителиальные CD1a и неэпителиальные тканевые ДК, которые мигрируют через лимфатические узлы в Т-зависимые области вторичных лимфоидных органов. В результате происходит стимуляция клонов нативных Т-клеток, играющих основную роль в развитии противоопухолевого иммунитета. [30]

Возникающие из В-лимфоцитов плазматические клетки участвуют в реакциях иммунитета посредством синтеза IgA. В поверхностных отделах слизистой оболочки располагаются также Т-лимфоциты, отвечающие на специфическую антигенную стимуляцию, участвующие в реакциях повышенной чувствительности замедленного типа, повышении чувствительности макрофагов и взаимодействующие с предшественниками антителообразующих клеток. Антиген-реактивные Т-клетки, секретирующие гуморальные медиаторы и цитотоксические антитела, продуцируемые В-клетками, осуществляют сенсибилизацию макрофагов, которые играют большую роль в разрушающих опухолевую клетку реакциях. Характерным антигеном Т-клеток является CD3, а в качестве маркера В-клеток используется CD20, который является негликозилированным фосфопротеином, экспрессируемым на мембране зрелых В-клеткок. Важно одновременное сбалансированное взаимодействие Т- и В-клеточного местного иммунного ответа. Подтверждением этого является факт низкой выживаемости больных с преобладанием В-клеточного иммунного ответа и высокой выживаемости при сочетании двух типов иммунного ответа. [31]

Об опухолевой прогрессии можно косвенно судить по состоянию сосудов микроциркуляторного русла и более крупных сосудов. Опухоль достигая в диаметре более 1 мм приобретает возможность метастазирования с началом ангиогенеза в ней. Во взрослом организме определяющую роль в ангиогенезе играют основной фактор роста фибробластов и VEGF [32]. VEGF - цитокин, действующий как специфический митоген для эндотелиальной клетки (ЭК) и фактор, индуцирующий повышение проницаемости сосудов. В норме VEGF экспрессируют активированные макрофаги, эпителиальные и мезангиальные клетки клубочков почек, тромбоциты и кератиноциты. Пролиферации ЭК способствует также ряд других факторов: сосудистые эндотелиальные кадгерины (КГ) и ангиопоэтины (АГП-1 и АГП-2). При опухолевом ангиогенезе большую роль играют ангиостатин и эндостатин. В образовании сосудов важна способность ЭК к адгезии к тромбоцитам и эндотелиальным КГ [32, 33]. В распространении опухоли большое значение придается способности ЭК не только к гомотипической адгезии, необходимой для образования сосудов, но и к гетеротипической адгезии. В норме гетеротипическая адгезия проявляется связью ЭК с форменными элементами крови. В условиях патологии способность к адгезии с ЭК и циркулирующими элементами крови приобретают и клетки опухоли. Это происходит при инвазии опухоли в сосуды, а затем во внеклеточный матрикс (ВКМ) и является одним из основных механизмов распространения неопластического процесса и метастазирования [32]. Проникновение клеток опухоли в ВКМ происходит вследствие разрушения базальных мембран посредством желатиназы А [34].

В норме в слизистой прямой кишки мембранный белок MUC1 не синтезируется, но его экспрессия характерна для РПК. Гиперэкспрессия MUC1 в РПК связана со снижением степени дифференцировки опухолевых клеток. При неопластической трансформации наблюдается связывание MUC1с рецепторами эпидермальных факторов роста и тирозинкиназы, что способствует активации ряда клеточных сигнальных систем[35].

1.3 Классификация РПК

Для стадирования КРР предложена классификация Astler-Coller (1953 г.) дополнившая классификацию С.Е. Dukes (1932г.), основанную на степени прорастании опухоли стенки кишки и наличия или отсутствия метастазов в регионарных ЛУ. С 2009 года Международный Противораковый Союз предложил Международную TNM-классификацию (седьмое издание) [36].

В настоящее время для гистологической верификации РПК используется Международная гистологическая классификация опухолей толстого кишечника и прямой кишки ВОЗ, 2000 г. [37].

I. Эпителиальные опухоли

1.1. Карцинома

1.1.1. Аденокарцинома

1.1.2. Муцинозная аденокарцинома

1.1.3. Перстневидноклеточная карцинома

1.1.4. Мелкоклеточная карцинома

1.1.5. Плоскоклеточная карцинома

1.1.6. Железисто-плоскоклеточная карцинома

1.1.7. Медуллярная карцинома

1.1.8. Недифференцированная карцинома

Аденокарцинома составляет около 80 % КРР. Опухоль состоит из атипических структур различной формы: округлых, овальных или трубчатых. Высокодифференцированная форма представлена округлыми железистыми структурами, выстланными цилиндрическим эпителием. Могут встречаться папиллярные структуры и небольшие очаги повышенного слизеобразования. Встречаются также опухоли, состоящие почти исключительно из ворсинчатых структур - папиллярные карциномы. Наличие множественных участков рака папиллярного строения может свидетельствовать о том, что карцинома развилась из ворсинчатой опухоли [38]. Стратификация клеток и ядер умеренно выражена, десмоплазия стромы минимальная или отсутствует. Ядра везикулярные с отчетливыми ядрышками и нарушенной полярностью. Умереннодифференцированная форма представлена хорошо сформированными железами со сложной архитектоникой, наличием псевдокриброзных и криброзных структур. Могут встречаться небольшие очаги папиллярного строения и повышенного слизеобразования. По периферии опухоли часто определяются небольшие очаги сниженной дифференцировки. Клетки остаются цилиндрическими, но высота их снижена, встречаются фокальная светлоклеточная трансформация цитоплазмы в результате внутриклеточного отложения гликогена, полярность ядер преимущественно сохраняется. Низкодифференцированная форма представлена солидными и скиррозными структурами с небольшим количеством плохо сформированных желез с неотчетливыми контурами и просветами. В строме с выраженной десмопластической реакцией определяются отдельно лежащие опухолевые клетки и кластеры. Железы, если они определяются, выстланы уплощенным и кубовидным эпителием с везикулярными ядрами с конденсированным в виде ободка по периферии ядра хроматином. Нуклеарная полярность отсуствует.

Муцинозная аденокарцинома составляет около 10% КРР. Муцинозный компонент определяется внутри- и внеклеточно, могут встречаться «озера» слизи. Клетки местами мелкие с гиперхромными ядрами, без фигур митозов, но встречаются группы клеток с крупными атипичными ядрами и большим количеством митозов, также встречаются клетки перстневидного типа.

Перстневидноклеточная аденокарцинома составляет около 2 % КРР. Более 50% клеток имеют строение перстневидных с выраженным интрацитоплазматическим слизеобразованием. На светооптическом уровне определяются два типа клеток. Это перстневидные клетки, имеющие обширную эозинофильную цитоплазму и эксцентрично расположенное лунообразное ядро и недифференцированные клетки с более темной цитоплазмой и большим гиперхромным плеоморфного вида ядром. Клетки опухоли местами образуют группы различного размера, разделенные фиброзной тканью, либо располагаются поодиночке. Мелкоклеточная карцинома составляет менее 1 % КРР. Опухоль построена из мелких клеток с округлыми гиперхромными ядрами и узким ободком цитоплазмы. Большинство этих опухолей имеют эндокринную дифференцировку.

Плоскоклеточная карцинома составляет менее 1% КРР. Опухоль состоит из относительно крупных клеток с хорошо выраженной цитоплазмой и продолговатыми ядрами, имеющими хорошо контурируемые ядрышки. Раковые клетки формируют солидные и альвеолярные структуры с наличием роговых жемчужин. Отсутствие ороговения свидетельствует о большей дедифференцировке опухоли и в известной мере определяет ее более высокую степень злокачественности. Строма обычно хорошо развита.

Железисто-плоскоклеточная карцинома составляет менее 1% КРР. На светооптическом уровне раковые клетки формируют железистоподобные структуры, которые местами напоминают псевдокриброзные, встречаются лентовидные образования и отдельно лежащие комплексы раковых клеток. Среди железистых структур встречаются клетки с широким ободком эозинофильной цитоплазмы, имеющие строение плоскоклеточного рака. На других участках определяются комплексы плоскоклеточного рака с тенденцией к ороговению. Медуллярная карцинома составляет менее 1% КРР. Опухоль представлена солидными полями злокачественных клеток с везикулярными ядрами, отчетливо выраженными ядрышками, и обширной розовой цитоплазмой. В строме выраженная лимфоидная инфильтрация.

Недифференцированная карцинома составляет менее 1% КРР. Морфологически не определяются признаки дифференцировки, а раковые клетки формируют солидные комплексы. Кроме вышеназванных разновидностей встречаются также редкие формы: светлоклеточная карцинома, микрогландулярная аденокарцинома с минимальной девиацией из бокаловидных клеток, клоакогенная базальноклеточная карцинома, веретеноклеточная и метапластическая карцинома (карциносаркома), гигантоклеточная карцинома (хориокарцинома с трофобластической дифференцировкой), карциноид-карцинома, карциноидная опухоль, меланотическая аденокарцинома и злокачественная меланома [37].

2. Нозологическая характеристика материала и методы его исследования

2.1 Общая клинико-морфологическая характеристика пациентов с раком прямой кишки

Материалом для исследования стали 90 случаев РПК, выявленных у жителей Гомельской области в 1996-2002 гг. Длительность жизни пациентов от начала лечения была прослежена во всех наблюдениях в сроки от 1 до 60 месяцев (максимально до 112 месяцев). В целях рандомизации в исследование были включены только опухоли, имеющие гистологическое строение аденокарциномы. Клинические данные о каждом случае получены из медицинской документации (истории болезни, амбулаторные карты) и Республиканского канцер-регистра. Распространенность опухолевого процесса и гистологическая верификация оценивалась в соответствии с классификацией ВОЗ [33, 201]. Характеристика клинических признаков представлена в таблице 2.1.

Таблица 2.1 - Клинико-морфологическая характеристика пациентов с РПК

Признаки	Показатель
Количество наблюдений	90
Возраст (лет)	62,87 (41,63-69,89)
Продолжительность жизни менее 1 года до 3 лет до 5 лет более 5 лет	3 16 27 44
Локализация нижняя треть ПК средняя треть ПК верхняя треть ПК	20 28 39
Степень дифференцировки G1 G2 G3	10 65 15
Стадия I TNM T1,T2 N0.M0	11
Стадия IIA TNM T3N0M0	37
Стадия IIB TNM T4N0M0	12
Стадия IIIA TNM T1,2 N1M0	12
Стадия IIIB TNM T3,4 N1 M0	16
Стадия IIIC TNM T1,2,3,4 N2 M0	3

2.2 Методика морфологического и иммуногистохимического исследования

Вырезка кусочков тканей проводилась в день операции. В дальнейшем все кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине и подвергали стандартной проводке с заливкой в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали гематоксилин-эозином и использовали для обзорной микроскопии с последующей реклассификацией и уточнением морфологических особенностей новообразований на основании критериев Международной гистологической классификации опухолей РПК [33]. Для детализации структур стромы и паренхимы срезы выборочно окрашивали пикрофуксином по Bан Гизону, проводилась ШИК-реакция и окраска альциановым синим (рисунок 2.1).

Оценка стромального компонента проводилась количественно в процентах на срезах, окрашенных пикрофуксином, по модифицированному методу, предложенному T.J. Flotte с соавторами [198].



Для морфометрического исследования использовался аппаратно-програмный комплекс Nikon с программным обеспечением. Микропрепараты фотографировали с помощью микроскопа Nicon Eclipse 50i c цифровой фотокамерой DS-F1 с разрешением 1689 на 1415 пикселей в 6 полях зрения. Подсчет параметров производили с использованием пакета прикладных программ анализа изображения. Площадь полей зрения составила 600,45?495,12=297 307,55 мкм². (объектив 20) и 299,11?397,67=118 952,07 мкм². (объектив 40). Исследовались срезы опухолевой ткани после ИГХ реакции с помощью непрямого иммунопероксидазного-антипероксидазного метода. В качестве хромогена использовался диаминобензидин. контрокрашивание производилось гематоксилином Майера. Оценка морфологических характеристик опухоли заключалась в определении наличия или отсутствия изменений в окраске клеточных структур для определения их диагностической значимости (рисунок 2.2).

Для более точного учета результатов ИГХ реакции в фоторедакторе Adobe Photoshop CS 8.0 при помощи инструмента «color range» выделяли коричневую окраску, которую дают продукты реакции диаминобензидина, а окружающий фон нейтрализовали при помощи инструмента «magic wand». После бинаризации изображения на фотоснимках проводили морфометрический просчет при помощи анализатора WCIF ImageJ и Aperio Image Scope (рисунок 2.3).

Для оценки результатов ИГХ методов исследования тканей РПК и тканей, используемых в качестве контроля нами была разработана инструкция по применению ИГХ методов исследования новообразований различного генеза (№160-1110 от 11.02.2011г.). Для ИГХ исследований применялись коммерческие Ат фирмы Dako Cytomation (Дания). Материал из опухолевых узлов и краев резекции подвергали ИГХ исследованию с помощью непрямого иммунопероксидазного-антипероксидазного метода, при котором изучали экспрессию мутантного гена mt р53, маркера пролиферации Ki-67, маркера Т-лимфоцитов CD3, маркера В-лимфоцитов CD20, маркера макрофагов и гистиоцитов CD68, маркера апоптоза BCL2, маркера клеточной пролиферации циклина D1, маркера нейроэндокринной активности ХГA, маркера дендритических клеток S100, маркера эндотелиальных клеток CD34 [174].



Из архивных парафиновых блоков готовились серийные срезы толщиной 4 мкм, которые помещали на предметные силанизированные стекла и высушивали в течение суток при комнатной температуре. Перед окрашиванием срезы в вертикальном положении помещали в термостат на 60 мин при температуре 55°С. После этого проводилась депарафинизация в орто-ксилоле (в батарее из двух емкостей по 10 минут в каждой), регидратация в этиловом спирте нисходящей концентрации (в батарее из 3-х емкостей по 3 минуты в каждой) и промывание в дистиллированной воде. Предметные стекла со срезами переносились в подогретый демаскировочный буфер (таблица 2.3) и помещались в водяную баню при температуре 98°С на 30-40 мин. Характеристика первичны антител представлена в таблице 2.3.

Таблица 2.3 - Характеристика использованных первичных антител

Антитела	Номер по каталогу	Клон, источник	Разведение	Время инкубации с первичными антителами, мин	Время демаскировки, мин	Демаскировочный буфер, рН	Контроль
							позитивный	негативный
p53	N 1581	D0-7, мышиные	RTU*	60	40	6,0	ткань лимфомы с известной позитивностью	исключение первичных антител
Циклин D1	М 7155	DCS-6, мышиные	1:40	70	40	9,0
Ki-67	N 1633	MIB-1, мышиные	RTU*	60	40	6,0
BCL2	N 1587	124, мышиные	RTU*	60	30	6,0
ХГА	М0869	DAC-A3, мышиные	1:200	60	30	6,0	ткань надпочечника
CD3	N 1580	поликлональные, кроличьи	RTU*	60	30	6,0	ткань ЛУ
CD20	N 1502	L26, мышиные	RTU*	60	30	6,0	ткань ЛУ
CD34	N 1632	QBEnd 10, мышиные	RTU*	60	30	6,0	ткань гем-ангиомы
CD68	N 1576	PG-M1, мышиные	RTU*	60	30	6,0	ткань ЛУ
S100	N 1573	поликлональные, кроличьи	RTU*	60	30	6,0	ткань невуса
IgA	N 1507	поликлональные, кроличьи	RTU*	60	30	6,0	ткань ЛУ

Примечание * - первичные антитела готовые к применению

После охлаждения до комнатной температуры препараты промывали в растворе трис-буфера (pH=7,5). Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывались 3% H₂O₂ в течение 15 мин. Для подавления неспецифического связывания Ат и устранения фоновой окраски препараты обрабатывали Protein Bloсk (Х0909) (DAKO) в течение 10 мин. Срезы перед нанесением антител обводили специальным делимитирующим составом для предотвращения растекания растворов и экономии реактивов. Инкубацию с первичными Ат осуществляли в течение 60-120 минут при комнатной температуре. В качестве визуализирующей системы использовали набор Universal LSAB2 KIT (K0673) (DAKO) при минимальной экспозиции 40 мин. Непосредственно перед применением готовили рабочий раствор хромогена из расчета 1 капля диаминобензидина на 1 мл азидного буфера (экспозиция 5-10 минут, специфический продукт реакции окрашивался в коричневый цвет разной интенсивности). Затем срезы промывали проточной водой, докрашивали гематоксилином Майера по общепринятой методике и заключали в канадский бальзам. После получения цифрового изображения, оценивалась экспрессии изучаемых маркеров согласно разработанным алгоритмам.

2.3 Критерии оценки результатов иммуногистихимического исследования

2.3.1 Оценка экспрессии mt р53онкопротеина

Для оценки ядерной экспрессии р53 использовали индекс метки (ИМ), высчитывая процент опухолевых клеток с позитивно окрашенными ядрами от общего количества в зонах с наибольшим их содержанием. Анализ экспрессии проводился при увеличении микроскопа 400. В процессе исследования в поле зрения микроскопа изучалось до 300 клеток. Позитивной считали реакцию при коричневой окраске более 5% ядер опухолевых клеток, причем слабопозитивной при 6-30%, умереннопозитивной - при 31-70% и сильнопозитивной - при 71-100% клеток [174].

2.3.2 Анализ экспрессии циклина Д1

Оценка ядерной экспрессии проводилась в 6 случайных полях зрения (объектив 40), исходя из процента окрашенных клеток полуколичественно в 6 случайных полях зрения (объектив 20), исходя из распространенности и интенсивности ИГХ реакции (отсутствие экспрессии или окрашено менее 10% клеток - 0 баллов, от 10 до 25% - 1 балл, от 26 до 50% - 2 балла, от 51 до 75% - 3 балла и более 75% - 4 балла). Ядерная гиперэкспрессия указанного маркера считалась позитивной при окраске более 10% опухолевых клеток [174].

2.3.3 Анализ экспрессии Ki-67

Для оценки ядерной экспрессии Ki-67 использовали индекс метки (ИМ), высчитывая процент опухолевых клеток с позитивно окрашенными ядрами от общего количества в зонах с наибольшим их содержанием. Анализ экспрессии проводился при увеличении микроскопа 400. В процессе исследования в поле зрения микроскопа изучалось до 300 клеток. Позитивной считали реакцию при коричневой окраске более 10% ядер опухолевых клеток, оценивая в области максимальной экспрессии маркера. Пролиферативную активность опухоли оценивали как процент Ki-67 положительных клеток. Высокая пролиферативная активность опухоли соответствует экспрессии Ki-67 в ? 40% клеток, низкая пролиферативная активность - экспрессии Ki-67 в ? 40% клеток [174].

2.3.4 Анализ экспрессии BCL2, S100, CD68, CD20, CD3, ХГА

Оценка экспрессии проводилась в 6 случайных полях зрения (?400), исходя из процента окрашенных клеток полуколичественно в 6 случайных полях зрения (объектив 40), исходя из распространенности и интенсивности ИГХ реакции (отсутствие экспрессии или окрашено менее 10% клеток - 0 баллов, от 10 до 25% - 1 балл, от 26 до 50% - 2 балла, от 51 до 75% - 3 балла и более 75% - 4 балла [174].

2.3.5 Анализ микроциркуляторного русла РПК по экспрессии CD34

Определение плотности микрососудистого русла проводили в местах с наибольшим числом капилляров, подсчитывая их число и число отдельных эндотелиоцитов, считая их единицей измерения. Подсчет проводили в 10 полях зрения (объектив 20, поле зрения микроскопа 0,216 мм²) по модифицированному методу, предложенному S. Svagzdys соавторами [156].

Оценка распространенности и интенсивности ИГХ окрашивания проводилась в 9 случайных полях зрения (объектив 100). Подсчитывали общее число опухолевых клеток (не менее 500) и количество раковых клеток с каждой степенью интенсивности окрашивания. В зависимости от степени выраженности реакции интенсивность распределялась на четыре категории, каждой из которой присваивали бальный эквивалент: реакция отсутствовала - 0 баллов, слабая - 1 балл, умеренная - 2 балла и выраженная - 3 балла. Затем вычисляли коэффициент экспрессии (КЭ) по формуле (модификация формулы de Matos (2006) [199]:

, (2.1)

где

n₀ - число опухолевых клеток с негативной реакцией;

n₁ - число опухолевых клеток со слабой реакцией;

n₂ - число опухолевых клеток с умеренной реакцией;

n₃ - число опухолевых клеток с выраженной реакцией.

Оценка типа (паттерна) ИГХ окрашивания.

Проводилась на основании определения преобладания (>50%) мембранного или цитоплазматического типа окрашивания опухолевых клеток при ИГХ реакции.

2.4 Статистический анализ

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы STATISTICA 6.0 (Stat Soft, GS-35F-5899H) [200]. Для сравнительной характеристики признаков использованы следующие непараметрические методы: сравнение двух независимых выборок - U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney). При необходимости сравнения частот встречаемости признаков в различных группах использовали тест ч². За уровень статистической значимости принимался p<0,05.

Оценка нормальности распределения признаков проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Взаимосвязь между показателями определялась методом непараметрического корреляционного анализа с определением коэффициента Тау Кендалла (ф). При представлении данных были использованы значения медианы (Ме), 25- и 75-го перцентиля: Ме (25‰, 75‰). За уровень статистической значимости принимался р<0,05.

Глава 3. Клинико-морфологическая и иммуногистохимическая характеристика рпк у пациентов после радикального хирургического лечения

Клинико-морфологическая характеристика РПК у пациентов после радикального хирургического лечения. Клинико-морфологическая характеристика РПК у пациентов после ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет представлена на рисунке 4.1

Преобладающим явился размер опухоли более 4-х см, который определялся в 95,0% случаев наблюдений (рисунок 3.1 А). Прорастание опухоли в стенку кишечника, соответствующее уровню Т2 определялась в 20,0%, Т1 - не выявлялось. Степень прорастания опухоли в стенку кишечника, соответствующая Т3-Т4 наблюдалась чаще и составила 80,0%. (рисунок 3.1 Б). Отсутствие регионарного метастазирования (N0) отмечалось менее чем половине случаев наблюдений (40,0%), регионарные метастазы с поражением до 4-х ЛУ (N1) были выявлены в 60,0%, множественное поражение ЛУ (N2) встречалось в 5,0% случаев (рисунок 3.1 В). В группе пациентов с выживаемостью более 3-х лет чаще встречался G1 и G2 (рисунок 3.1 Г).

У пациентов с выживаемостью более 3-х лет преобладали опухоли размером менее 4-х см (65,9%). Глубина прорастания опухоли в стенку кишечника, соответствующая Т3-Т4 наблюдалась чаще, и составила 79,5%. Было выявлено 6,8% случаев, соответствующих grade 1 (рисунок 3.2).

Прорастание опухоли в стенку кишечника, соответствующее уровню Т2 определялась в 20,5%, Т1 - не выявлялось. Отсутствие регионарного метастазирования (N0) отмечалось в большинстве случаев наблюдений (84,1%), регионарные метастазы с поражением до 4-х ЛУ (N1) были выявлены в 15,9%, случаи множественного поражения ЛУ (N2) не встречались.

Для сравнительного анализа между группами больных с различной выживаемостью был использован непараметрический критерий ². Сравнительный анализ в подгруппах больных с различной выживаемостью представлен в таблице 3.1.

Таблица 3.1 - Сравнительный анализ клинико-морфологических показателей у пациентов с различной выживаемостью

Показатель	Выживаемость	р
	До 3-х лет	Более 3-х лет
	n	%	n	%
Размер	?4см	1	5	29	48,3	<0,001
	>4см	19	95	15	25
T	2	4	20	9	15	0,456
	3	9	45	30	50	0,025
	4	7	35	5	8,3	0,033
N	N0	8	40	37	61,7	0,334
	N1	11	55	7	11,7	0,221
	N2	1	5	0	0	-
G	1	0	0	3	5	-
	2	16	80	40	66,7	0,238
	3	4	20	1	1,7

Как видно из таблицы 3.1 размер опухоли более 4-х см значимо чаще определялся у пациентов с выживаемостью до 3-х лет (р<0,001). Степень прорастания опухолью стенки кишечника соответствующая Т3 и Т4 с высокой степенью значимости чаще определялась у пациентов с выживаемостью до 3-х лет (р<0,025 и р<0,033) соответственно. Значимых отличий по особенностям регионарного метастазирования обнаружить не удалось. По степени злокачественности также не было выявлено значимых различий. Иммуногистохимическая характеристика РПК у пациентов после радикального хирургического лечения. Данные ИГХ исследований РПК в подгруппах пациентов с ХЛ и различной выживаемостью представлены в таблице 3.2

Таблица 4.2 - ИГХ показатели у пациентов после ХЛ с различной выживаемостью

Показатель	Общий показатель	Группа	р
		До 3 лет	Более 3 лет
mt p53	24,83 (8,14 - 59,28)	41,53 (3,84 - 81,22)	18,76 (4,16 - 42,15)	0,028
BCL2	18,84 (16,12 - 21,25)	27,36 (24,06 - 29,46)	34,34 (30,44 - 39,65)	0,031
Ki-67	34,61 (30,11 - 36,88)	48,93 (44,04 - 51,24)	27,56 (24,85 - 31,51)	0,019
Циклин Д1	21,21 (17,34 - 25,75)	31,9 (26,36-36,12)	18,82 (15,19-21,15)	0,052
ХГА	16,69 (13,24-19,35)	29,69 (26,34-32,19)	11,84 (8,82-14,05)	0,021
IgA	250,6 (201,69 - 291,85)	210,81 (164,09-256,15)	264,19 (198,56- 330,24)	0,055
CD3	605,73 (549,15-662,11)	484,63 (435,56-532,49)	649,71 (591,16-707,04)	0,024
CD20	141,69 (121,35-168,12)	71,25 (66,25 -78,02)	167,28 (151,55-182,1)	0,019
CD68	190,39(101,15-241,21)	161,24 (128,4-185,56)	201,14(115,62-285,77)	0,044
S100	84,19 (76,25 - 93,15)	64,04 (57,58 - 70,82)	91,54 (82,25 - 99,26)	0,065
CD34	29,65 (25,43 - 31,65)	41,50 (34,5 0- 44,50)	17,80 (16,35 - 18,80)	0,02

Изучение экспрессии mt p53 в объединенной группе (общий показатель) пациентов с ХЛ показало, что позитивная реакция выявлялась в 39 случаях РПК (60,0%), медиана экспрессии в объединенной группе пациентов составила 35,62 (31,14-39,28). Pезультаты экспрессии выявлялись в виде коричневой окраски ядерВ крае резекции определялись единичные слабопозитивные клетки (рисунок 3.3).

В подгруппе пациентов с ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии mt p53 составила 43,79 (36,84-48,22), в то же время в подгруппе пациентов с высокой выживаемостью медиана экспрессии mt p53 была значимо ниже (р=0,028) и составила 28,25 (24,16-32,15). Изучение экспрессии BCL2 в объединенной группе пациентов составила 18,84 (16,12-21,25).



Экспрессия BCL2 в РПК проявлялась в виде коричневого окрашивания цитоплазмы эпителиальных клеток различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в меньшем количестве.

У пациентов с выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии BCL2 была значимо ниже (р=0,031).и составила 27,36 (24,06-29,46) в сравнении с подгруппой с выживаемостью более 3-х лет - 34,34 (30,44-39,65). Изучение экспрессии Ki-67 в объединенной группе пациентов показало, что медиана экспрессии Ki-67 составила 34,61 (30,11-36,88). Экспрессия Ki-67 в РПК проявлялась в виде коричневого окрашивания ядер эпителиальных клеток различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в меньшем количестве (рисунок 3.4).

В группе пациентов с выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии Ki-67 составила 48,93 (44,04-51,24). В группе пациентов с выживаемостью более 3-х лет медиана экспрессии Ki-67 - 27,56 (24,85-31,51), что было значимо ниже в сравнении с пациентами, имеющими низкую выживаемость (р<0,019). При проведении ИГХ исследований экспрессии циклина Д1 у пациентов в объединенной группе установлено, что его медиана составила 21,21 (17,34-25,75). Экспрессия циклина Д1 в ткани РПК проявлялась в виде коричневого окрашивания ядер эпителиальных клеток различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в меньшем количестве (рисунок 3.5).

В подгруппе пациентов с выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии циклина Д1 составила 31,9 (26,36-36,12). В подгруппе пациентов с выживаемостью более 3-х лет медиана экспрессии циклина Д1 - 18,82 (15,19-21,15), однако различия проявлялись на уровне тенденций (р=0,052). ХГА-позитивные нейроэндокринные клетки в объединенной группе пациентов экспрессировались количестве 16,69 (13,24-19,35). Экспрессия ХГА в ткани РПК проявлялась в виде коричневого окрашивания цитоплазмы (рисунок 4.6) отдельных эпителиальных клеток различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в цитоплазме эпителиальных клеток преимущественно базальных отделов.

В ткани РПК в подгруппе пациентов с выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии ХГА-позитивных нейроэндокринных клеток составила 29,69 (26,34-32,19), что было значимо выше (р=0,021), чем в подгруппе пациентов с выживаемостью более 3-х лет - 11,84 (8,82-14,05).

При ИГХ исследовании IgA-позитивных клеток медиана их экспрессии в объединенной группе пациентов составила 250,6 (201,69-291,85). Экспрессия IgA в ткани РПК проявлялась в виде коричневого окрашивания мембран и цитоплазмы плазмоцитов и отдельных эпителиальных клеток различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в большем количестве (рисунок 3.7).

В подгруппе пациентов с выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии IgA-позитивных клеток составила 210,81 (164,09-256,15), что несколько меньше, чем в подгруппе с выживаемостью более 3-х лет- 264,19 (198,56-330,24), но различия проявлялись на уровне тенденций (р=0,055). В объединенной группе пациентов с ХЛ медиана экспрессии CD3-позитивных клеток составила 605,73 (549,15-662,11). Экспрессия CD3 в ткани РПК проявлялась в виде коричневого окрашивания мембран и цитоплазмы Т-лимфоцитов различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в большем количестве (рисунок 3.8).

В подгруппе пациентов с ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет установлено, что медиана экспрессии CD3-позитивных клеток составила 484,63 (435,56-532,49), что значимо меньше (р=0,024), чем в подгруппе пациентов с ХЛ и выживаемостью более 3-х лет - 649,71 (591,16-707,04).



При ИГХ исследовании в объединенной группе с ХЛ показано, что медиана экспрессии CD20-позитивных клеток составила 141,69 (121,35-168,12). Экспрессия CD20 проявлялась в виде коричневого окрашивания мембран В-лимфоцитов различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в большем количестве, в составе лимфоидных фолликулов и отдельных клеток (рисунок 3.9).

В подгруппе с ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии CD20-позитивных клеток составила 71,25 (66,25-78,02), что было значимо меньше (р=0,019), чем в группе пациентов с ХЛ и выживаемостью более 3-х лет - 167,28 (151,55-182,1). При обработке данных ИГХ исследований в объединенной группе с ХЛ показано, что медиана экспрессии CD68-позитивных клеток составила 190,39 (101,15-241,21). Экспрессия CD68 в ткани опухоли проявлялась в виде коричневого окрашивания цитоплазмы макрофагов и гистиоцитов различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в большем количестве.

В подгруппе с ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет показано, что медиана экспрессии CD68-позитивных клеток - 161,24 (128,4-185,56), что значимо меньше (р=0,044), чем в подгруппе с ХЛ и выживаемостью более 3-х лет - 201,14 (115,62-285,77).



Медиана экспрессии S100-позитивных клеток в объединенной группе пациентов с ХЛ составила 12,69 (10,25-14,15). Экспрессия S100 в ткани опухоли проявлялась в виде коричневого окрашивания цитоплазмы дендритических клеток различной интенсивности, в то время как в крае резекции позитивные клетки определялись в большем количестве.

При сравнительном анализе установлено, что в подгруппе пациентов с ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессия S100-позитивных клеток составила 13,65 (14,70-18,50), что было несколько меньше, чем в подгруппе пациентов с выживаемостью более 3-х лет - 12,00 (10,80-14,00), но различия были статистически незначимымыми (р=0,065).

Изучение ИГХ особенностей экспрессии CD34-позитивных клеток в объединенной группе пациентов с ХЛ показало, что медиана составила 27,65 (18,78-35,16). Экспрессия CD34 в ткани опухоли проявлялась в виде коричневого окрашивания ядер эндотелия сосудов микроциркуляторного русла различной интенсивности, при этом в сравнении с тканью опухолей пациентов после проведеныя ЛТ визуально количество плотность сосудов была менее выражена. В крае резекции позитивные клетки определялись в меньшем количестве (рисунок 3.10).

В подгруппе пациентов с ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет медиана экспрессии CD34-позитивных клеток составила 41,50 (34,50-44,50), что больше (р=0,02), чем в группе с ХЛ и выживаемостью более 3-х лет - 17,80 (16,35-18,80).

Сравнительный анализ экспрессии иммуногистохимических маркеров в ткани РПК и краях резекции у пациентов с ХЛ. ИГХ характеристика РПК и краев резекции у пациентов, подвергавшихся ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет представлена в таблице 3.3.

Таблица 3.3 - ИГХ характеристика РПК у пациентов, после ХЛ и выживаемостью менее 3-х лет

Показатель	Группа	р
	РПК	Край резекции
Ki-67	22,35 (12,70-39,50)	12,70 (6,80-22,80)	0,049
CD68	20,80 (17,60-22,30)	24,60 (17,80-50,30)	0,048
CD3	29,50 (19,00-45,00)	26,85 (13,90-62,30)	0,743
CD20	5,90 (5,40-6,90)	6,55 (5,40-11,60)	0,504
S100	13,65 (14,70-18,50)	14,90 (14,20-16,20)	0,066
CD34	41,50 (34,50-44,50)	30,45 (22,50-34,50)	0,002

При изучении маркера пролиферации Ki-67 установлено, что уровень экспрессии при РПК почти в два раза превышал аналогичный показатель в краях резекции (р=0,049). Количество ОАМ (CD68) в тканях РПК был значимо ниже, чем в краях резекции (р=0,048). Количество сосудов на единицу площади, определяемое по маркеру CD34, в тканях РПК было значимо выше, чем в краях резекции (р=0,002). Изучение содержания дендритических ретикулярных клеток (S100) в краях резекции не выявило статистической значимости по сравнению с РПК (р=0,066). Изучение уровня экспрессии CD3 и CD20 не выявило статистической значимости между сравниваемыми группами (р=0,743 и р=0,504, соответственно).

Таблица 3.4 - ИГХ характеристика РПК у пациентов, после радикального ХЛ и выживаемостью более 3-х лет

Показатель	Группа	р
	РПК	Край резекции
Ki-67	21,40 (18,70-30,80)	9,9 (8,5-18,6)	0,043
CD68	186,50 (163,40-245,15)	56,75 (45,8-89,9)	<0,001
CD3	78,70 (69,70-105,45)	76,80 (62,6-85,0)	0,25
CD20	23,15 (18,75-25,95)	3,5 (3,0-3,8)	<0,001
S100	12,00 (10,80-14,00)	10,4 (8,7-11,5)	0,078
CD34	17,80 (16,35-18,80)	15,75 (15,4-16,6)	0,097

Как следует из таблицы 3.4, уровень экспрессии показателя пролиферации Ki-67 в ткани РПК более чем в два раза превышал таковой в крае резекции (р=0,043). Уровень экспрессии CD68, отражающий наличие ОАМ в ткани РПК более чем в три раза превышал таковой в крае резекции (р<0,001). Уровень экспрессии CD20, отражающий наличие В-лимфоцитов, в ткани РПК в шесть раз превышал подобный показатель в крае резекции (р<0,001).

Выводы

1. Проведенное исследование показало, что низкая выживаемость пациентов с РПК после ХЛ характеризуется большими размерами опухоли, более глубокой инвазией стенки ПК при уровне прорастания Т3-Т4 (р<0,05). В то же время, такие показатели как поражение метастазами ЛУ, степень дифференцировки ткани опухоли, в отличие от пациентов группы с ЛТ не имели значимости в группах с различной выживаемостью.

2. Сравнительный анализ экспрессии маркера пролиферации Ki-67 и апоптоза mt р53 у пациентов с различной выживаемость показал, что низкая выживаемость характеризовалась более высокими значениями указанных маркеров (р=0,019 и р=0,028) соответственно. В то время как показатели экспрессии маркера апоптоза BCL2 у пациентов с выживаемостью менее 3-х лет были значимо ниже, чем у пациентов с выживаемостью более 3-х лет (р=0,031).

3. Значимыми для определения прогноза выживаемости являются показатели экспрессии маркеров местного иммунитета (CD3, CD20, CD68), которые в тканях РПК у пациентов с выживаемостью более 3-х лет определялись на более высоком уровне (р<0,05).

4. Экспрессии маркера нейроэндокринных клеток ХГА у пациентов с выживаемостью менее 3-х лет были выше, чем в у пациентов с выживаемостью более 3-х лет (р=0,021). Количество сосудов на единицу площади, определяемое по экспрессии маркера CD34, в тканях РПК у пациентов с низкой выживаемостью было значимо выше, в сравнении с группой пациентов с выживаемостью более 3-х лет (р=0,02).

Список использованных источников

1. Злокачественные новообразования в Беларуси 2000 - 2009 / С.М. Поляков [и др.]; под ред. М.М. Сачек, А.И. Ларионова. - Минск: РНПЦ МТ, 2010. - 205 с.

2. Курбыко, Т.И. Эпидемиологический анализ заболеваемости населения Республики Беларусь злокачественными новообразованиями прямой и ободочной кишки / Т.И. Курбыко, Н.Е. Порада // Сахаровские чтения 2008 года: экологические проблемы XXI века: Материалы 8-й междунар. науч. конф., 22-23 мая 2008 г., г. Минск, Республика Беларусь / под ред. С.П. Кундаса, С.Б. Мельнова, С.С. Позняка. - Минск: МГЭУ им А.Д. Сахарова, 2008. - С. 70-71.

3. Напалков, Н.П. Демографический процесс и злокачественные новообразования / Н.П. Напалков // III съезд онкологов и радиологов СНГ: материалы съезда, Минск , 25 - 28 мая 2004 г.: в 2 ч. - Минск , 2004. - Ч.1. - С. 15 - 30.

4. Клинические рекомендации. Онкология / под ред. В.И. Чиссова, С.Л. Дарьяловой.- М.: ГЭОТАР, - Медиа, 2006.- С.352-374.

5. Эпидемиология злокачественных новообразований в Беларуси / И.В. Залуцкий [и др.]. - Минск: Зорны верасень, 2006.- С.59 - 69.

6. Meat, fish, and colorectal cancer risk: the European Prospective Investigation into cancer and nutrition / T. Norat [et al.] // Natl. Cancer Inst. - 2005. - Vol. 97. - P. 906-916.

7. Dietary patterns and risk of cancer: a factor analysis in Uruguay / E. De Stefani [et al.] // Int. J. Cancer. - 2009. - Vol. 124. - P. 1391-1397.

8. Dietary soy and isoflavone intake and risk of colorectal cancer in the Japan public health center-based prospective study / M. Akhter [et al.] // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2008. - Vol. 17. - P. 2128-2135.

9. Bile acids as endogenous etiologic agents in gastrointestinal cancer / H. Bernstein [et al.] // World J. Gastroenterol. - 2009.- Vol.15, № 27.- P. 3329-3340.

10. Rowland, I.R. The role of the gastrointestinal microbiota in colorectal cancer / I.R. Rowland // Curr. Pharm. Des. - 2009. - Vol. 15. - P. 1524-1527.

11. Associations between cigarette smoking, lifestyle factors, and microsatellite instability in colon tumors / M.L. Scattery [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. - 2000. - Vol. 92. - P.1831-1836.

12. Body size and risk of colon and rectal cancer in the European Prospective Investigation Into Cancer and Nutrition (EPIC) / T. Pischon [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. - 2006. - Vol. 98. - P. 920-931.

13. Relation of body mass index to cancer risk in 362552 Swedish men / C. Samanic [et al.] // Cancer Causes Control. - 2006. - Vol. 17. - P. 901-909.

14. Carcinoma of the colon and rectum / S.R. Hamilton [et al.] // World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System / S.R. Hamilton [et al.].- Lyon, 2000. - P. 103-125.

15. Survival of patients with colorectal cancer in Austria by sex, age, and stage / G. Haidinger [et al.] // Wien Med. Wochenschr. - 2006. - Vol. 156. - P. 549-551.

16. Boyle, P. Epidemiology of colorectal cancer / P. Boyle, M.E. Leon // Br. Med. Bull. - 2002. - Vol. 64. - P. 1-25.

17. Environmental and heritable factors in the causation of cancer analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland / P. Lichtenstein [et al.] // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 343. - P. 78-85.

18. Influence of the c-erbB-2, nm23, bcl-2, and p53 protein markers on colorectal cancer / S. Demirbas [et al.] // Turk. J. Gastroenterol. - 2006. - Vol. 17. - P. 13-19.

19. Jurach, M.T. Expression of the p53 protein and clinical and pathologic correlation in adenocarcinoma of the rectum / M.T. Jurach, L. Meurer, L.F. Moreira // Arq. Gastroenterol. - 2006. - Vol.43. - P. 9-14.

20. Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma / D.P. Zhao [et al.] // J. Zhejiang Univ. Sci. B. - 2005. - Vol. 6. - P. 1163-1169.

21. Bcl-2 expression and its korrelation with neuroendocrine differentiation in colon carcinomas / P. Atasov [et al.] // Tumori. - 2004.- Vol. 90. - P. 233-238

22. Tissue microarray molecular profiling of early, node-negative adenocarcinoma of the rectum: a comprehensive analysis / A. Hoos [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2002. - Vol.8. - P. 3841-3849.

23. Influence of the c-erbB-2, nm23, bcl-2, and p53 protein markers on colorectal cancer / S. Demirbas [et al.] // Turk. J. Gastroenterol. - 2006. - Vol. 17. - P. 13-19.

24. Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma / D.P. Zhao [et al.] // J. Zhejiang Univ. Sci. B. - 2005. - Vol. 6. - P. 1163-1169.

25. Immunohistochemical expression of bcl-2 in UICC stage I and III colorectal carcinoma patients: correlation with c-erbB-2, p53, Ki-67, CD44, laminin and collagen IV in evaluating prognostic significance / H. Zavrides [et al.] // Pol. J. Pathol. - 2006. - Vol.57. - P. 149-159.

26. Alao, J.P. The regulation of cyclin D1 degradation roles in cancer development and the potential for therapeutic invention / J.P. Alao // Mol. Cancer. - 2007. - Vol. 6. - P. 1186-1193.

27. High macrophage infiltration along the tumor front correlates with improved survival in colon cancer / J. Forcell [et al.] // Clin. Cancer Result. - 2007.- Vol.13. - P. 1472-1479.

28. Олейник, Е.К. Динамика экспрессии маркеров активации лимфоцитов больных с опухолями желудочно-кишечного тракта на различных стадиях заболевания / Е.К. Олейник, М.И. Шибаев, В.М. Олейник // Вопр. онкол. - 2005. - Т. 51. - №5. - С. 571-574.

29. The density of macrophages in the invasive front is inversely correlated to liver metastasis in colon cancer / O. Zhou [et al.] // J. Transl. Med. - 2010.- Vol. 8. - P. 13-21.

30. Балдуева, И.А. Система дендритных клеток и ее роль в регуляции функциональной активности Т- и В- лимфоцитов человека / И.А. Балдуева [и др.] // Вопр. Онкол. - 1999.- Т. 45. - №4. - С. 473-483.

31. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы / Р.И. Хаитов, Б.В. Пинегин, А.А. Ярилин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009 - 352 с.

32. Papamichael, D. Prognostic role of angiogenesis in colorectal cancer / D. Papamichael // Anticancer Res. - Vol. 21. - 2005. - P. 4349-4353.

33. Hubbard, J. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer / J. Hubbard, A. Grothey // Curr. Opin. Oncol. - 2010. - Vol. 22. - P. 374-380.

34. Капланская, И.Б. Ангиогенез, межклеточные контакты и стромально-паренхиматозные взаимоотношения в норме и патологии / И.Б. Капланская, Е.Н. Гласко, Г.А. Франк // Рос. Онкол. Журнал. - 2005. - №.4. - С. 53-57.