5. Методи діагностики активності ферментів біотрансформації

Порозуміння важливості генетичного поліморфізму для забезпечення адекватної фармакотерапії вимагає організаційних засобів, які віддзеркалюють прогрес науки в цьому напрямки. Тому генотипові тестування запропоновано для клінічного випробування препаратів. Нещодавно FDA затвердило тест систему для визначення метаболізму ліків ферментами CYP 450. Amplichip CYP 450 тест є варіантами ДНК, що можуть виявити 29 різновидів поліморфізму CYP 2D6 і 2 варіанти поліморфізму CYP 2С19, при використанні зразків крові людини. Дослідження „Roche Diagnostic" коштує 500 $ та не покривається страховими компаніями, тому на сьогодні досі обговорюється доцільність їх використання.

Для визначення генотипу застосовують полімеразну ланцюгову реакцію та визначення Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

В різних тканинах вивчають експресію різних генів, що кодують відповідні ізоферменти. Для визначення фенотипу застосовують маркерні ліки (зонди) - типові субстрати, метаболіти яких можна визначити в біологічних рідинах (плазмі крові, сечі, слині), наприклад, біохімічними методами, високоефективним рідинним хроматографом. Далі аналізується співвідношення лікарський засіб/метаболіт - (metabolic ratio). В групі обстежених визначається поширеність метаболічного співвідношення та будується крива розподілу. За наявності генетичного поліморфізму розподіл буде полімодальним.

Для аналізу активності ферментів родини цитохрому Р450 запропоновано генетичне тестування. Так, в січні 2005 p. FDA видало рішення на засто-сування першого фармакогенетичного тесту AmpliChip CYP450 (ДНК-мікрочіп) для генотипування двох генів ферментної системи цитохрому Р450 CYP2D6 та CYP2C19, активних учасників метаболізму як мінімум кожного четвертого препарату рецептурного відпуску. До речі, завдяки ДНК-мікрочіпу, експертам вдалось довести, що причиною смерті 9-річного хлопчика стало не передозування Прозака (антидепресивний засіб), а дефект гену СУР206.

Отже, врахування ролі цитохрому Р 450 у метаболізмі ліків, допомагає передбачити наслідки взаємодії препаратів у. кожній конкретній ситуації та пояснити відповідь пацієнта на обраний дозовий режим терапії. Звичайно, поки що діагностика ізоформ ферментів ще не доступна широкому колу лікарів, але в недалекому майбутньому таке дослідження стане нормою, що допоможе ідентифікувати осіб за можливим ризиком несприятливих подій.

6. Вплив полімормізму окремих ферментів родини CYP450 на медикаментозне лікування

CYP1A1 є найбільш важливим у продукції потенційно канцерогенних різновидів від PAHS. Присутність високих рівнів таких ізоформ часто зустрічається в тканинах уражених пухлинами, як наприклад, рак легень чи молочних залоз. Фермент еволюціонував як захист проти молекул подібних РАН, активізуючи їх в епоксидах або інших реактивних різновидах, які потім кон'югуються у II фазі до неактивних форм, що елімінуються.

Описано кілька варіантів мутації цього CYP1A1. з якого CYP1 А1*2 і CYP1A1*3 є найбільш вивченими. Вони відрізняються тільки на одну амінокислоту від інших форм і це робить їх сприйнятливими до індукції та формування більш реактивних форм, що у свою чергу, збільшує ризик раку. Це важко довести експериментально і потрібно провести ще певні дослідження.

CYP2A6 Цей CYP відіграє токсикологічну та ендогенну ролі в кліренсі ряду субстратів, як наприклад, нікотин. Є поліморфізмів з утворенням кількох ізоформ, з яких чотири мутанти функціонально не активні. Деякі не функціональні мутанти існують в невеликий кількості (<3%) серед європейців, хоча одна специфічна мутація знайдена майже у 20% в китайській популяції та у 5% - в японській. Клінічно значимий поліморфізм спостерігається, якщо PAF (фактор формування) антагоніст SM-12502 стане широко використовуватися, оскільки цей агент виключно 2А6.

CYP2D6 Його ген знаходиться на 22 хромосомі, і здається, що цей CYP не має життєвої ендогенної функції. Він не non-inducible, але було відмічено в 1970-х, що детоксикація деяких (зараз застарілі) препаратів (sparteine і debrisoquine), буде дуже уповільненою у малого відсотку європейців. Фермент досі ще іноді називають дебрізохінгідроксилаза або спартеїн/дебрізохін гідроксилаза. Подальше дослідження показало, що 2D6 підлягає різноманітним дефектам, які включають делецію одного нуклеотиду, як в SNPs або двох делецію двох нуклеотидів, чи навіть повну відсутність гену, коли фермент 2D6 не синтезується взагалі. Якщо пацієнт гомозиготний для будь-якої з цих мутацій, то він повільний метаболізатор ферменту CYP2D6. Частота гомозигот або повільний метаболізаторів варіює залежно від раси - близько 3-10% європейців, 4% Afro-Caribbeans і менш 1% азіатів. Потенційно, в Європі, могло бути більш ніж 30 мільйонів повільних метаболізаторів і можливо 10-15 мільйонів в США. Нормальні, або “wild type” індивідууми для цього гена є екстенсивними метаболізаторами. Відомо, що у гетерозиготи спостерігається деяке зменшення активності ферменту. Описано багаторазові копії 2D6 гена, що може приводити аж до 13 копій ферменту замість одного. Ці індивідууми відомі як над швидкі метаболізатори і вимагають застосування надвисоких доз препаратів, ніж особи з нормальним “wild type” і, можливо, у 20 разів більші, ніж у повільних метаболізаторів. Ці ultrarapid метаболізатори виявляють в Арабській популяції та у в північно-східній Африці. Можливо, це є природною відповіддю на особливості дієти, з наявністю продуктів з певними токсинами, що зустрічаються у цій зоні. Зрозуміло, що у повільних метаболізаторів можна очікувати масу побічних реакцій при прийомі ліків.

CYP2D6 і антипсихотики. Нібито проблем у хворих на недостатньо, але, що контролюють симптоми, добре відомі великою кількістю побічних ефектів. Серед найважчих - tardive дискінезії (Tds), мимовільн рухи губ, м'язів, рук і ніг, які з'являються першого року лікування. Tds - частина розладів, відомих як „пірамідальні ефекти". Через 10 років у ніж половини пацієнтів на антипсихотиках розвивається Tds. Причини Tds і дискінезій все ще не ясні, але вони могли бути споріднені з неврологічним пошкодженням, викликаним і/або їх метаболітами. Tds може без, хоча роблять їх значно частіше. Хворі на поліморфізм CYP2D6 більше до симптомів TD, особливо якщо гетерозиготи. Це ілюструє часткову пов'язану з гетерозиготним генотипом. Рішення - заміна ів на препарати, які менш пов'язані з 2D6. як наприклад, респерідон.

Трициклічні антидепресанти (ТЦА). Ці були основними в лікуванні депресії селективних інгібіторів зворотнього захвату серотоніну (SSRIs) і нових похідних, як наприклад, міртазапін. Вони ефективні після вживання протягом тривалого періоду (шести тижнів або більше) та мають атропіноподібні побічні ефекти (сухість, закрепи, і т.п.). Якщо пацієнт не давав відповідь на, то дозу збільшували. Але ТЦА мають вузький терапевтичний індекс, що часто приво до побічних реакцій. У повільних метаболізаторів типова подвійна проблема високої частоти атропіно-подібних побічних ефектів у поєднанні з вужчим терапевтичним індексом та, як наслідок, із ризиком смерті від незначного передозування.

Бета-блокатори. Уповільнення кліренсу бета-блокаторів, як наприклад тімололу, пропранололу та метопрололу, може акцентувати значно їх побічні ефекти, які включають бронхоспазм, розлади серцевої діяльності, головні болі, сексуальна дисфункція, кошмари, депресію, проблеми з метаболізмом глюкози і загальною втомою.

СІЗЗС. Метаболізм СІЗЗС складний, оскільки вони одночасно екстенсивно окислюються, та активно перешкоджають синтезу CYP2D6. Citalopram метаболізується 2D6 до деметильованих похідних за участі 2С19. Fluoxetine перетворюється N-деметилюванням за допомогою ферментів до норфлуоксетину, який необоротно інгібує 2D6. Поліморфізм 2D6 впливає на Citalopram і fluoxetine на багато більш, ніж paroxetine, який метаболізується 2D6 в низьких концентраціях, але є інгібітором у вищих концентраціях. Fluvoxamine і sertraline не залежні від 2D6, хоча sertraline може перешкоджати ферменту in vivo. Комбінації С133С і ТЦА можуть викликати серйозне накопичення ліків у “wild type” індивідуумах, особливо у осіб схильних до поліморфізму.

Антиаритміки. Флекаїнід, мексилетин та енкаїнід мають могу вплив на серце електрофізіологію і вони чутливі до дозування. Так, 2D6 у повільних метаболізаторів призводить до ризику високої концентрацій цих агентів, що збільшують аритмії замість їх купування.

Опіоїдні анальгетики. Вони включають кодеїн, фентаніл, мепередін, пропоксіфен і петідін. Кодеїн - проліки, оскільки є метильованою версією морфію і повинно бути О-деметилювання 2D6, щоб звільнити морфій, який є анальгетиком. Отже, у повільних метаболізаторів кодеїн матиме ефективність. Оксікодон зазвичай перетворюється на оксіморфон частково за допомогою 2D6 і ефективність цього препарату також знижується у повільних метаболізаторів. Трамадол набагато менш токсичний, ніж морфій, і у процесі О-деметилювання перетворюється на активний метаболіт, що має ефекти опіатів. Фентаніл - надзвичайно сильний опіат, який метаболізується N-деалкілуванням ЗА4 і 2D6 до норфентанілу та інших метаболітів. Повільні метаболізатори мають ризик зростання кількості побічних ефекті при прийомі опіатів у відносно низьких дозах.

Інші препарати. Венлафаксін - інгібітор зворотнього захоплення серотоніну- та норадреналіну і часто виступає препаратом другої лінії у лікуванні депресій після відсутності ефекту від С133С. Він набагато безпечніший, ніж ТЦА, оскільки не є токсичним, немає холінергічних ефектів як ТЦА. На жаль, при першому застосуванні венлафаксину очікувана ефективність не була вражаючою, а побічні ефекти були високі (неспокій і нудота). Це, можливо, проявилось тому, що препарат зазвичай використовували при неефективності СІЗЗС флуоксетину, який є могутнім 2D6 через його метаболіт норфлуоксетин. Цей ефект зберігається кілька тижнів, і це приводить до двома шляхами з утворенням активних метаболітів О- деметил вейлафаксину (ODV) і N-деметилвенлафаксину (NDV). СІЗЗС можливо, впливали на ефективність фвенлафаксину, уповільнюючи його кліренс та збільшуючи побічні ефекти. Це свідчить, що довший „washout" період потрібний після прийому СІЗЗС перед тим як призначити венлафаксін. Тразодон, інший не трициклічний антидепресант або СІЗЗС альтернативний антидепресант, також метаболізуеться 2D6, хоча ще не ясно, яких ефектів очікувати у повільних метаболізаторів.

CYP2C8 Значення поліморфізму CYP2C8 все ще не з'ясовано, хоча представлена інформація щодо метаболізм протипухлинного препарату таксол. Певно 20% європейців мають гетерозиготні форми за SNPs. Поки що було ідентифіковано п'ять поліморфних форм CYP2C8*I-5. CYP2C8*3 і можливо *4 у європейців, які певно мають проблеми при метаболізмі таксолу та арахідонової кислоти, хоча пізніші спостереження свідчать, що цей поліморфізм клінічно не істотний. Даний факт свідчить про необхідність вивчення поліморфізму CYP2C8.

CYP2C9 Цей фермент інтенсивно вивчався і він головний фермент метаболізму ряду, як наприклад нестероїдні протизапальні препарати (діклофенак, ібупрофен, напроксен), гіпоглікемічні препарати похідні сульфосечовини, як наприклад, толбутамід та гліпізід, блокатори рецепторів ангіотензину II лозартан та ірбесартан і ряд інших сульфонаміди, амітриптілін, СІЗЗС, фенітоїн, тамоксифен і s-варфарин). знаходиться на 10 хромосомі і підлягає поліморфізму, який відносно рідко спостерігається у європейців, близько 1-3%. Поліморфіз у жителів Сходу набагато нижчий, близько 0.5%, хоча у гонконзькій популяції вища. Варфарин метаболізуеться 2С9 до неактивного 7-гідрокси похідного і у повільний метаболізаторів може накопичуватися у нормальній дозі та призводити до надмірної антикоагуляції. Проте, клінічно, у пацієнтів контролюють згортальну здатність крові (INR 1.5-3) та титрують дозу препарату. У деяких індивідуумі доза у півміліграму може повністю протидіяти згортанню крові, що менше ніж у 10 разів у звичайній ситуації. Проблеми, можуть з'явилися у початковій стадії терапії, коли надмірна антикоагуляція з'являється при досить низькій дозі і вимагає певного досвіду. Клінічне значеня 2С9 поліморфізму, можливо, є досить рідкою проблемою, порівняно з тим же 2D6. Але все-таки, низька активність 2С9, можливо, потенційно впливає більш ніж на півмільйона жителів тільки у Великобританії.

CYP2C19 Поліморфізм CYP (хромосома 10) був виявлений у середині 1990-х, він метаболізує значну кількість фенітоїн, S-mephenytoin, і деякі барбітурати, бензодіазепіни, циталопрам, циклофосфаміл, індометацин, лансопразол, омепразол, прімідон, R-варфарин, прогуаніл, пропранолол, нелфінвір. кломіпрамін. Частота поліморфізму низька у європейців (3-5%), афро-карібський регіон (2-5%), але набагато частіше у жителів Сходу (15- 20%). Дві мутації спостерігаються у 99% азіатів - повільних метаболізаторів, але у 90% європейців, також відмічаються інші генетичні дефекти. Знову, мутації - SNPs.

CYP3A CYP3A (хромосома 7) пов'язаний метаболізм половини всіх, інтенсивні зусилля були направлені на вивчення особливостей метаболізму CYP3A. Останній є реактивним до всіх індукторів та, що людину. CYP3A метаболізм ліків є здебільшого сумою CYP3A4 та ЗА5 ізоформ, хоча CYP3A7 і CYP3A43 (дуже низький) також відіграють певну роль. У «wild- type» індивідуумах співвідношення між обома варіантами, як головний CYPs, може скласти близько 50:50.

Щодо CYP3A4, він добре зберігає стійкість до мутацій - хоча виявляється >1% ізоформ. PXR зв'язуючі елементи у регуляторній ділянці гену не мають вираженої мінливості, хоча є дефекті у промоутера CYP3A4 в деяких індивідуумів, які мають ізоформу CYP3A4*1B, що зменшує активність CYP у відповідь на гормони. Передбачають, що це приводить до збільшення гормонального рівню і, можливо, спричиняє новоутворення, як наприклад, рак простати. Поки що це не доведено. Інший рідкісніші варіанти CYP3A4 включають CYP3A4*2 і *3, також як і *4-6, виявлені у китайців. Ймовірно, що ще деякі варіації CYP3A4 будуть виявлені у популяціях у майбутньому.

Поки що передбачається, що ЗА4 не має вираженого поліморфізму, а CYP3A5, певним чином, має. CYP3A5*1 - функціональна версія, поки єдиний поліморфний нуклеотид викликає неправильне зчитування гена CYP3A5, що приводить до утворення скороченого і каталітично неадекватного CYP3A4*3. CYP3A5 відсутній або нефункціонуючий приблизно в 70% європейців, але тільки в 40% Afro-Caribbeans. Хоча, якщо поглянути радикально, клінічний ефект не був повністю зрозумілий і, можливо, не настільки великий починаючи з CYP3A4 і ЗА5, проте здається дуже подібний. Звичайно з антипсихотиками подібно до галоперидолу є маленька різниця у метаболізму CYP3A4 і ЗА5 особливо при наявності інгібіторів. Схильність до новоутворень, пов'язаних з метаболізмом гормонів, ймовірно пов'язують з поліморфізмом в СУРЗА5. як наприклад, *3 варіант, замість СУРЗА4.

Інші попіморфізми СУР

Є дані, що СУР2В6 (хромосома 19) поліморфний: він впливає на близько 3-4% європейців. Відомо, що цей СУР метаболізує відносно невелику кількість ліків, яка включає фенобарбітал, бупропіон, циклофосфамід, метадон, іфосфамід.

Висновки

Фармакокінетика і фармакодинамика лікарських засобів (ЛС) відрізняється в різних людей. Це зв'язано з різними процесами в організмі: з харчуванням, віком, різними захворюваннями, генетичною особливістю пацієнтів. Зміни в генах білків-транспортерів, ферментів, рецепторів і т.д. можуть приводити до зміни фармакологічної відповіді. Такі зміни можуть передаватися з покоління в покоління, поширюватися в популяції. Генетичний поліморфізм характерний і для ферментів цитохрома Р-450.

Вивчені 30 різних форм ферменту P450 (CYP450) людини.

Отримані дані дозволяють припускати, що біля половини з ферментів Р450 відповідально за окислювання субстратів з навколишнього середовища, а саме 1А2, 2А6, 2С19, 2D6, 2Е6, 3А4. CYP2D6 втягнуті у реакції окислювання близько 30 різних ліків, таких як бета-адренергики, антиаритміки, психотропні, антидіабетичні ліки. Інформація про каталітичну активність і рівень експресії різних ферментів у печінці і кишечнику свідчить про важливу роль CYP3A4 у метаболізмі багатьох екзогенних субстратів. Цей фермент вносить основний вклад в окислювання принаймні 50 лікарських речовин, таких як блокатори кальцієвих каналів, імуносупресанты, седативні, психотропні, антигістамінні препарати, антибіотики і стероїдні форми. Генетичний поліморфізм вивчений як мінімум для 4 ферментів Р450 (1А1,2А6, 2С19, 2D6), менш явні свідчення поліморфізму для Р450 (1А2, 2Е6). І що цікаво, дотепер не виявлено поліморфізм по CYP3A4.

Експресія мутантних аллелей може приводити до синтезу ферментів зі зміненою активністю, що у свою чергу може бути причиною зміни швидкості метаболізму ксенобиотиков. У залежності від її в популяції виділяють наступні групи: «активні» метаболізатори, що мають нормальний ген того чи іншого ферменту (до них належить більшість населення); «повільні» метаболізатори - носії мутацій, що приводять або до синтезу дефектного ферменту, або взагалі до його відсутності, результатом чого є чи зниження навіть неможливість метаболізму якого-небудь ксенобіотика; «швидкі» метаболизатори - носії мутацій гена, що приводять до синтезу ферменту з високою активністю.

Поширеність «повільних» і «швидких» метаболізаторов серед населення неоднакова. Найбільші розходження були виявлені між африканською й іншою популяціями, істотну різницю у швидкості биотрансформации мають представники різних народів Азії, причому як між собою, так і в порівнянні з європейцями.

Швидкість біотрансформуючих процесів в індивідуума визначають по активності визначеного ферменту метаболізму (метод фенотипування); по ідентифікації мутантних алелей ферментів детоксикации ксенобіотиків (метод генотипувания); шляхом сполучення цих методик.

В даний час генотипически ідентифіковано більш 1000 ізоферментів цитохрома Р-450, розроблена їхня класифікація. Але для практичної медицини методики генотипування залишаються недоступними через складність їхнього проведення і високої вартості. Фенотипічні ж методи (визначення біотрансформуючої здатності організму по швидкості метаболізму модельної речовини) недосконалі. Так довгий час тест, що застосовується з цією метою антипіриновий, відбиває активність ферменту CYP1A2 системи цитохрома Р-450, внесок якого в окислювання лікарських засобів складає лише 8,2%. Розробити універсальний тест для визначення активності всіх підродин цитохрома Р-450 неможливо, але на наш погляд актуальний пошук модельної речовини для дослідження CYP2D6 тому що цей фермент відповідає за метаболізм більш 35% найбільше часто застосовуваних лікарських засобів (нейролептиків, антидепресантів, в-адреноблокаторів, наркотичних препаратів, гіпотензивних засобів), а також канцерогенів групи нітрозамінів.

З погляду сучасної біології і медицини саме від метаболічного статусу організму залежать: ризик розвитку і характер плину багатьох захворювань, у тому числі злоякісних пухлин; успіх фармакотерапії, особливо якщо вона призначається на тривалий час, і одночасно застосовуються кілька препаратів. У залежності від швидкості біотрансформуючих процесів та саме речовина може робити різну дію на різних індивідуумів: від індиферентного до токсичного. Крім того особливості метаболізму повинні враховуватися при трансплантації органів і тканин додатково до використовуваного критерію імуносумісності. Саме біотрансформуючі особливості організму повинні служити критерієм при професійному доборі працівників у хімічній промисловості й в інших шкідливих виробництвах. У цілому ж проблема набагато ширше і торкається не тільки медичного аспекту. Цілком можливо, що від особливостей метаболізму залежить виникнення лікарської і токсикологічної залежності (алкоголізму і наркоманії). Але тип елімінації не є фатальною неминучістю, він може бути змінений за допомогою індукторів чи інгібіторів печіночних ферментів.

Таким чином, тип елімінації пацієнта є прогностичним чинником ризику різних патологічних процесів, визначає плин захворювань і успіх фармакотерапії.

У результаті існує можливість прогнозувати фармакологічну відповідь на ліки, а також підвищити ефективність і безпеку застосування ліків.

Список використаної літератури

1. Верткин А.Л., Клиническая фармакология: Учебное пособие/А.Л. Верткин, С.Н. Козлов. - М.: ГЕОТАР - Медиа, 2007. - 461с.

2. Клиническая фармакология: Учебник / Под ред. В.Г. Кукеса. - 3-е изд. перераб. и доп. - М.: ГЕОТАР - Медиа, 2006. - 944с.

3. Клиническая фармакология: Учебник для вузов / Под ред. В.Д. Соколова. - М.: "Колос", 2002. - 464с.

4. Кузнецова Н.В., Клиническая фармакология: Учебник/Н.В. Кузнецова. - 2-е изд. перераб. и доп. - М.: ГЕОТАР - Медиа, 2009. - 271с.

5. Мешковский А.П. Надлежащая клиническая практика/А.П. Мешковский // Фармаптека. - 2008. - №12. - с.13-17.

6. Сидоренкова Н.Б., Манукян, А.В., Пронина, Н.В. Основы клинической фармакологии / Под ред. Н.Б. Сидоренковой. - Барнаул: Издательство АГМУ, 2003. - 337с.

7. Харкевич Д.А., Фармакология: учебник для медвузов / Д.А. Харкевич. - 8-е изд. перераб. и доп. - М.: ГЕОТАР - медиа, 2005. - 735с.