Основные гематологические, биохимические и иммунологические показатели крови собак, зараженных возбудителем Opisthorchis felineus

Основным индикатором при описторхозе, являются такие показатели крови, как общий белок крови, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП), билирубин, амилаза и холестерин.

Биохимический анализ позволяет определить в сыворотке крови уровень общего белка. В норме общий белок находится в диапазоне 56-75 г/л.

Концентрация общего белка в сыворотке зависит главным образом от синтеза и распада двух основных белковых фракций - альбумина и глобулинов. Физиологическая роль белков крови многогранна:

поддерживают коллоидно-онкотическое давление, сохраняя объем крови, связывая воду и задерживая ее, не позволяя выходить из кровеносного русла;

принимают участие в процессах свертывания крови;

поддерживают постоянство рН крови, являясь одной из буферных систем крови;

соединяясь с рядом веществ (холестерин, билирубин и др.), а также с лекарственными препаратами, доставляют эти вещества к тканям;

поддерживают нормальный уровень катионов - кальция, железа, меди, магния в крови, образуя с ними недиализируемые соединения;

играют важнейшую роль в иммунных процессах;

служат резервом аминокислот;

выполняют регулирующую функцию, входя в состав гормонов, ферментов и других биологически активных веществ.

Синтез белков плазмы крови осуществляется в основном в клетках печени и ретикулоэндотелиальной системы. При анализе содержания общего белка в сыворотке различают нормальный его уровень, пониженный (гипопротеинемию) и повышенный (гиперпротеинемию).

Гипопротеинемия возникает вследствие нарушения образования белка в организме: при недостаточности функции печени (гепатиты, циррозы, токсические повреждения), нарушении всасывания (при энтеритах, энтероколитах, панкреатитах). Гиперпротеинемия нередко развивается вследствие дегидратации в результате потери части внутрисосудистой жидкости. При острых инфекциях содержание общего белка часто повышается вследствие дегидратации и одновременного возрастания синтеза белков острой фазы. При хронических инфекциях содержание общего белка в крови может нарастать в результате активации иммунологического процесса и повышенного образования иммуноглобулинов. Также этот показатель повышается при возникновении инфекционных воспалительных процессов или заболеваниях печени [40, 42].

Липиды играют важную роль в клеточном метаболизме. Так, жирные кислоты (в свободной форме и в виде триглицеридов) являются источником энергии для метаболических процессов, а холестерин и фосфолипиды - важнейшими компонентами клеточных мембран.

Липиды - группа низкомолекулярных веществ, характеризующихся различной растворимостью в органических растворителях и нерастворимых в воде. Липиды в крови находятся в основном в форме хиломикронов и форме липопротеидов. В плазме крови присутствуют три основных класса липидов: триглицериды (нейтральные жиры), фосфолипиды, холестерин и его эфиры.

Холестерин (ХС) является вторичным одноатомным циклическим спиртом. ХС поступает в организм с пищей, но большая часть его образуется эндогенно (синтезируется в печени). Холестерин является компонентом клеточных мембран, предшественником витамина D, стероидных гормонов и желчных кислот. Уровень ХС в крови является наиболее важным показателем состояния липидного обмена. Нормальные величины концентрации общего ХС в крови собак составляет 3,11-5,18 ммоль/л [42].

Желчными пигментами называют продукты распада гемоглобина и других хромопротеидов - миоглобина, цитохромов и гемсодержащих ферментов. К желчным пигментам отно-сится билирубин.

При физиологических условиях в организме животного постоянно происходит разрушение эритроцитов. Высвободившийся при этом гемоглобин разрушается на белковую часть - глобин и часть, содержащую железо, - гем. Железо гема включается в общий обмен железа и снова используется. Свободная от железа порфириновая часть гема подвергается катаболизму, это в основном происходит в ретикулоэндотелиальных клетках печени, селезенки и костного мозга. Метаболизм гема осуществляется в микросомальной фракции ретикулоэндотелиальных клеток сложной ферментной системой - гемоксигеназой. К моменту поступления гема из гемовых белков в гемоксигеназную систему гем превращается в гемин (железо окисляется в ферри-форму). Гемин в результате ряда последо-вательных окислительно-восстановительных реакций метаболизируется в биливердин, который, восстанавливаясь под действием биливердинредуктазы, превращается в билирубин, который затем утилизируется из организма.

Нарушение этого процесса можно отследить по изменению такого показателя, как общий билирубин. В норме в крови он содержится в концентрации 0,00-17,00 мкмоль/л. При увеличении данного показателя возникает желтушный синдром, который может свидетельствовать о различных патологиях: циррозе или раке печени, отравлении ядами или желчекаменной болезни.

В качестве унифицированного метода определения билирубина в сыворотке крови используется метод Индрашика, который позволяет определять как содержание общего билирубина, так и его фракций. Принцип этого метода состоит в следующем: при взаимодействии сульфониловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота (диазореактив), которая с прямым («конъюгированным», «связанным») билирубином дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности окраски судят о концентрации прямого билирубина. После добавления к сыворотке крови кофеинового реактива непрямой («свободный», «неконъюгированный») билирубин переходит в диссоциированное, растворимое состояние и с диазореактивом также дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности этой окраски определяют общее содержание (прямого и непрямого) билирубина. По разнице между общим содержанием билирубина и концентрацией прямого билиру-бина вычисляют содержание непрямого билирубина.

Содержание прямого билирубина в сыворотке в норме составляет 0,00-5,00 мкмоль/л, непрямого - 1,50-17,00 мкмоль/л [40, 42].

Ферменты - специфические белки, выполняющие в организме роль биологических катализаторов. Ферментный состав сыворотки крови относительно постоянен и имеет разнообразное происхождение. Нормальные уровни активности ферментов в сыворотке отражают соотношение между биосинтезом и высвобождением ферментов (при обычном обновлении клеток) [42].

Интенсивные биохимические исследования последних лет позволили выявить в крови, внутренних органах, в желудочном и кишечном соке избирательные изменения ферментативной активности при гельминтозах, которые могут быть трех типов:

повышение активности постоянно присутствующих ферментов в крови, моче, кале, которое обусловлено наследственностью, токсическими и алиментарными ферментопатиями;

повышение содержания ферментов, обусловленное нарушением внутриклеточной организации ферментов и патологической проницаемостью гистогематических барьеров;

появление в крови, кале, моче ферментов, которые в здоровом организме отсутствуют. Их появление связано с нарушением проницаемости гистогематических барьеров, либо с адаптивным синтезом защитных ферментов.

Вышеописанные изменения ферментативной активности являются внутренними механизмами, регулирующими паразито-хозяинные отношения.

Перечисленные изменения в ряде случаях при гельминтозах являются настолько специфичными, что их обнаружение может служить решающим подтверждением клинического диагноза, а изучение их в динамике патологического процесса ценным показателем эффективности применяемого метода лечения животного, но и очень часто важным прогностическим тестом. К таким важным ферментам при гельминтозах относится активность в сыворотке крови аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, альфа-амилазы, свидетельствующие о функциональном состоянии печени и поджелудочной железы, активность кишечной щелочной фосфатазы и энтерокиназы, показывающие уровень ферментативной активности тонкого и толстого отделов кишечника [33].

Повышение скорости обновления ферментов, повреждения клеток или их индуцирование обычно приводят к повыше-нию активности ферментов в сыворотке крови. В сыворотке крови выделяют три группы ферментов: клеточные, секреторные и экскреторные.

В сыворотке крови активность клеточных ферментов низка или вообще отсутствует. При патологических процессах активность ферментов этой группы в сыворотке крови зависит от скорости высвобождения из клеток, которая в свою очередь определяется скоростью повреждения клеток, и от степени повреждения клетки.

Секреторные ферменты (церулоплазмин, псевдохолинэстераза, липопротеиновая липаза) поступают непосредственно в плазму крови и выполняют в ней специфические функции. Эти ферменты синтезируются в печени и постоянно высвобождаются в плазму. Их активность в сыворотке крови выше, чем в клетках или тканях. В клинической практике они представляют интерес, когда их активность в сыворотке крови становится ниже нормы за счет нарушения функции печени.

Экскреторные ферменты образуются органами пищеварительной системы (поджелудочной железой, слизистой оболочкой кишечника, печенью, эндотелием желчных путей). К ним относятся альфа-амилаза, липаза, щелочная фосфатаза и др. В норме их активность в сыворотке крови низка и постоянна. Однако при патологии, когда блокирован любой из обычных путей экскреции, активность этих ферментов в сыворотке крови значительно увеличивается [42].

Аспартатаминотрансфераза катализирует перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты (аминокислота) на альфа-кетоглутаровую кислоту (кетокислота).

Активность ACT в крови повышается при ряде заболеваний, особенно при поражении органов и тканей, богатых данным ферментом. ACT повышается также при остром гепатите и других тяжелых поражениях гепатоцитов. Аспартатаминотрансфераза и ее определение обеспечивают точную оценку функции печени. В норме данный показатель колеблется между 0,00-56,00 МЕ/л. Аланинаминотрансфераза (АЛТ) катализирует перенос аминогруппы с аланина (аминокислота) на альфа-кетоглютаровую кислоту (кетокислота).

Самых больших концентраций АЛТ достигает в печени. В норме уровень активности АЛТ составляет 0,00-39,00 МЕ/л. Появление данного фермента в крови происходит лишь при деструкции клеток печени или сердца.

В клинической практике широко применяется одновременное определение в крови активности ACT и АЛТ. Оно несет гораздо больше информации о локализации и глубине поражения, активности патологического процесса; позволяет прогнозировать исход болезни.

Коэффициент де Ритиса, т.е. отношение ACT/АЛТ, в норме равное 1,33, при заболеваниях печени ниже этой величины.

Степень подъема активности аминотрансфераз говорит о выраженности цитолитического синдрома. Активность АЛТ при заболеваниях печени изменяется в первую очередь и наиболее значительно по сравнению с ACT [40, 42].

Гамма-глютамилтрансфераза (гамма-глютамилтранспептидаза) содержится в печени, поджелудочной железе, почках. В других тканях ГГТП встречается в небольших количествах. Изменение ее активности в сыворотке имеет большое диагностическое значение при заболе-ваниях печени и гепатобилиарного тракта. Этот фермент более чувствителен к нарушениям в клетках печени, чем АЛТ, ACT, щелочная фосфатаза и т.д.

В норме активность фермента составляет 0,00-87,00 МЕ/л. Активность ГГТП является признаком гепатотоксичности и положительна в 90 % случаев заболеваний печени.

При острых гепатитах активность ГГТП повышается раньше, чем активность ACT и АЛТ. На высоте заболевания активность ГГТП ниже, чем активность аминотрансфераз, и нормализуется значительно медленнее. Это позволяет использовать ГГТП как контроль выздоровления [42].

Альфа-амилаза относится к группе гидролаз, катализирующих гидролиз полисахаридов, включая крахмал и гликоген, до простых моно- и дисахаридов (мальтоза, глюкоза). Плазма крови человека содержит альфа-амилазы двух изозимных типов: панкреатическую (Р-тип), вырабатываемую поджелудочной железой, и слюнную (S-тип), продуцируемую слюнными железами. В физиологических условиях амилаза сыворотки крови состоит на 40% из панкреатической амилазы и на 60 % из слюнной амилазы.

Определение активности альфа-амилазы имеет важное значение в диагностике заболеваний поджелудочной железы. При возникновении в организме воспалительных процессов или повреждения тканей железы происходит повышение его нормального уровня, который в норме составляет 28,00-100,00 МЕ/л [40, 42].

Е.В. Польшковой установлены характерные изменения биохимических показателей гомеостаза в организме собак при гельминтозах: снижение общего белка в сыворотке крови в 1,1 раза, повышение в 1,4-1,5 раза активности АСТ и снижение активности АЛТ в 1,1 раза, бактерицидной и лизоцимной активности в 1,3-1,7 раза [34].

Характеристика биохимических показателей крови при описторхозе колеблется в зависимости от продолжительности инвазионного процесса.

Н.В. Поликутин и А.Н. Шинкаренко, изучая патогенез описторхоза у кошек, отметили, что активность аминотрансфераз увеличивается преимущественно на тридцатые сутки, а затем снижается. Однако активность щелочной фосфатазы и альфа-амилазы продолжает возрастать до девяностого дня заражения [36].

Подобные результаты получил и А.Н. Шинкаренко, рассматривая вопрос экологии паразитов собак и мер борьбы с вызываемыми ими заболеваниями в Нижнем Поволжье. В крови больных описторхозом собак концентрация общего белка на 30 сутки инвазии снизилась на 8,4% (Р<0,05), альбуминов на 12,1%, на 60 сутки - соответственно на 10,3% и 16,1%, на 90 сутки на 11,1% и 19% по сравнению с показателями контрольных агельминтных плотоядных. Касаемо альфа- и бета-глобулинов. У больных собак на 30-60 сутки концентрация их несколько снизилась (Р<0,05), но на 90 сутки инвазии она существенно не отличалась от таковых контрольных плотоядных. Количество гамма-глобулинов на 15-30 сутки инвазии существенно не менялось, но на 60-90 сутки у больных собак оно было на 11,4-18,8% выше показателей интактных плотоядных.

В сыворотке крови больных описторхозом собак постепенно нарастала активность ферментов, принимающих участие в обмене белка, минеральных веществ, углеводов и жиров. Так, на 30-60-90 сутки инвазии в крови больных собак активность АЛТ была соответственно в 12,8-9-6.3 раза, АCТ на 62,6-50-40,5%, щелочной фосфатазы на 38,5-44,2-50,4%, альфа-амилазы на 26-25-28,1% больше показателей контрольных интактных животных. Активность аминотрансфераз в крови больных собак наивысшего уровня достигала на 30 сутки инвазии, после чего несколько снижалась, тогда как активность щелочной фосфатазы и альфа-амилазы постепенно нарастала и достигла своего пика на 90 сутки болезни [33].

И.Г. Гламаздин и соавт. при исследовании крови собак, зараженных гельминтами, отмечали снижение уровня содержания альбуминов сыворотки крови, резкое увеличение содержания в- и г-глобулинов, повышение активности щелочной фосфатазы, амилазы, увеличение концентрации билирубина, рост активности АЛТ, ЛДГ, снижение уровня мочевины.

Полученные результаты указывали на то, что при гельминтозах происходят очень серьезные нарушения в крови и изменения активности ферментов [43].

В современном обществе, несмотря на высокий уровень ветеринарной медицины проблема паразитарных заболеваний, в частности гельминтозы собак и кошек, остается актуальной и в настоящее время. Необходимость проведения комплексных клинико-гематологических и биохимических исследований при описторхозе собак не вызывает сомнения.

К биохимическому анализу крови, как к одному из методов лабораторной диагностики, прибегают с целью оценки работы внутренних органов организма, в случае описторхоза - печени.

Полученные результаты показателей крови отражают состояние углеводного, липидного, белкового и минерального обменов, в том числе и активность ключевых ферментов, входящих в состав сыворотки крови.

Биохимические исследования, направленные на выявление патологии отдельных систем и органов пораженного организма, возникающей в ответ на развитие в нем паразитов, дают возможность изучить патогенез заболевания и разработать научно обоснованные методы лечения и профилактики [44].

Течение иммунологических процессов у животных, зараженных гельминтозами

Из факторов, отрицательно влияющих на иммуннобиологическую реактивность животных, важное место занимают стрессы и иммуннодепрессанты. К последним относят и паразитов, которые могут усугублять процессы иммунной системы, способствовать развитию иммунодефицитного состояния у животных и повышению их восприимчивости к болезням вообще и к гельминтозам в частности.

Подчиняясь общефизиологическим закономерностям, иммунитет при гельминтозах имеет свои особенности, которые зависят от паразито-хозяинных отношений, физиологических и экологических особенностей гельминтов. Гельминтов, вызывающих только местные изменения в организме хозяина, нет. Происходящие при гельминтозах изменения в органах и тканях служат показателем нарушения обмена веществ, наличия дистрофических процессов, аллергических и иммуноморфологических реакций, т.е. являются ответной реакцией организма на патогенное действие гельминта.

Тканевые барьеры хозяина играют большую роль в реализации его иммунобиологической защиты. Преодолевая эти барьеры, часть личинок гельминтов может задержаться в них, а затем погибнуть, подвергнуться фагоцитозу, петрифицироваться или продолжить свое развитие [45].

Проникновение и существование паразита в организме человека (хозяина), помимо его непосредственного воздействия, сопровождается развитием и реакцией эндогенного характера. Личинки гельминтов оказывают прямое повреждающее действие на организм больного выделяемыми ими ферментами, способствуя активации системы комплемента, выделению простагландинов клетками тканей хозяина, окружающими гельминта. Эти процессы провоцируют возникновение воспалительных реакций. Вместе с тем пролиферация лимфоидных и макрофагальных элементов в тканях, выделение ими лизосомальных ферментов, активация системы комплемента обеспечивают пораженному организму первый этап неспецифической защиты от инвазии.

Параллельно с первой ферментативно-токсической фазой патогенеза развивается вторая фаза - иммунологическая [46].

Ученые, рассматривая механизм иммунитета при инфекционных и инвазионных болезнях, делят его на клеточный и гуморальный. Действительно, иммунный ответ, как известно, является сложным иммунокомпонентным процессом, включающим цепь молекулярных и клеточных событий, которые разворачиваются в определенной последовательности [47].

С первых часов попадания инвазионных личинок в организме начинается процесс иммуногенеза, протекающий по общим законам с включением клеточных и гуморальных механизмов иммунитета. Ферменты и метаболиты, выделяемые личинками описторха в период созревания, обладают высокой антигенной активностью. Реакции иммунитета реализуются путем фиксации антител или иммунных комплексов антиген-антитело на поверхностных тканях паразита. Иммунные комплексы с иммуноглобулинами G и А присоединяют комплемент. К измененной поверхности тела паразита или его яйца привлекаются эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги, проявляя цитотоксический эффект путем активного выделения клеточных ферментов - гидролаз, пероксидаз, пептидаз и др. В защитных реакциях принимают участие тучные клетки, базофилы, тромбоциты. Фиксация на этих клетках иммунных комплексов приводит к выделению медиаторов свертывающей системы крови, вазоактивных аминов (адреналина, ацетилхолина), простагландинов [46].

Гельминты - многоклеточные паразиты, несущие широкий спектр поверхностных антигенов. Их рост и созревание в организме хозяина сопровождаются выделением ферментов, гормонов, продуктов метаболизма, изменением состава поверхностных антигенов, что обусловлено стадийностью их развития.

Развитию паразита в организме хозяина способствует такой феномен, как иммунологическая индукция. Она заключается в способности гельминтов изменять процесс синтеза белка в зависимости от особенностей протеиногенеза у промежуточного и окончательного хозяев с образованием общих белковых антигенов [48].

Явления молекулярной мимикрии и иммунологической индукции позволяют считать, что полиморфизм белков организма хозяина должен играть существенную роль в эволюции системы хозяин-паразит, а следовательно, и оказывать влияние на основные патогенетические механизмы при гельминтозах [49].

Иммунологический фактор и иммунологические показатели играют ведущую роль в патогенезе и серологической диагностике гельминтозов. В настоящее время в качестве серологического метода диагностики гельминтозов наиболее широко применяется иммуноферментный анализ [18].

Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и т.д., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Чувствительность данного анализа достаточна для выявления антител описторхиса как в доимагинальный, так и в имагинальный периоды инвазии [51, 52].

В качестве антигенов используют:

цельный экстракт марит описторхов, полученных от инвазированных плотоядных;

экскреторно-секреторный антиген, полученный путем культивирования описторхисов в питательной среде;

яичный антиген.

Данные антигены используются с целью выявления специфических антител - иммуноглобулинов.

Клиническое течение описторхоза отличается большим разнообразием. Острая и хроническая стадии описторхоза существенно отличаются клинически, что обусловлено различными патогенетическими механизмами.

Иммунологический фактор играет ведущую роль в патогенезе острой фазы гельминтозов, определяя известную стереотипность их клиники и её сходство с иммунологическими реакциями непаразитарной природы [53, 54].

Иммунный ответ в этот период во многом соответствует обычной реакции макроорганизма на внедрение чужеродного агента, клинически проявляется как аллергический синдром. В сыворотке крови отмечено значительное повышение специфических к паразиту IgE, IgM и IgG - антител, вырабатываемых иммунной системой в ответ на проникновение в организм чужеродного агента. Именно они обеспечивают первичный иммунный ответ. Повышение иммуноглобулинов в остром периоде описторхоза сочетается с увеличением уровня ЦИК. Высокие показатели исследуемых иммуноглобулинов свидетельствуют о выраженном стимулирующем эффекте описторхозных агентов, а также способности В-лимфоцитов трансформироваться в антител-образующие клетки [53, 55, 56].

По сообщению В.Г. Кузнецовой и соавт. диагностическая ценность ИФА довольно высока в острую фазу описторхоза. Результаты иммуноферментного анализа положительны более чем у 90% зараженных и титр антител достаточно высок (1:400-1:800) [7].

При переходе заболевания в хроническую стадию признаки аллергического влияния паразитов уменьшаются, уровень антител класса IgM значительно падает, затем они вообще исчезают и тогда в клинике преобладают симптомы поражения внутренних органов.

В хроническую фазу описторхоза воздействие продуктов обмена гельминтов продолжается, однако аллергический фактор уже не носит столь выраженного характера. Уровень специфических IgM на 6-8 неделе снижается. В крови начинают циркулировать специфические к описторхозу IgG, обеспечивающие длительный иммунный ответ, вырабатывающиеся плазматическими клетками иммунной системы.

Н.В. Карбышева и соавт., изучая динамику показателей иммунной системы при хроническом описторхозе, установили достоверное повышение уровня IgG.

Хроническая фаза описторхоза характеризовалась и достоверно повышенным образованием ЦИК. При проведении корреляционного анализа была установлена обратная взаимосвязь между уровнем ЦИК и концентрацией IgA (-0,64, p<0,001) при меньшей зависимости образования ЦИК от содержания IgM (-0,26) и IgG (-0,32).

Таким образом, выявленная в целом активация гуморального звена иммунной системы при хронической фазе описторхоза отражала особенности ответа при взаимодействии с антигеном, характеризующимся слабовыраженной иммуногенностью. Гуморальные компоненты иммунного ответа при описторхозной инвазии являются лишь её специфическими маркерами, но не обладают защитными свойствами, что и обеспечивает длительное выживание O. felineus в организме хозяина [57].

В случаях хронических форм титры противоописторхозных антител существенно ниже, и реакция может быть отрицательной. Положительная реакция ИФА отмечается лишь у 51,6% зараженных хроническим описторхозом. Кроме того, до сих пор неизвестно, как долго сохраняются антитела после устранения инвазии, поэтому использовать эту реакцию для диагностики паразитологического выздоровления нельзя [7, с.46].

В этот период большее значение приобретает механический и токсический фактор воздействия гельминтов [58].

Формирование иммунного ответа - защитная реакция организма и в тоже время это главный механизм патогенеза гельминтозов. Выраженность иммунологического ответа обычно соответствует иммуногенности паразита и интенсивности инвазии [59, 60, 61].

N.Kaewpitoon at al., у хомяков, зараженных O. viverrini, иммунный ответ наблюдали уже через 7-14 дней после заражения, его уровень стремительно увеличивался на протяжении 2 месяцев инвазионного процесса.

Величина иммунологических показателей напрямую зависила от интенсивности инвазии. Хомяки, инфицированные по 50 и 100 метацеркарий, показали более высокие титры антител, чем зараженные по 25 личинок.

B формировании иммунного ответа и количественных показателей уровня антител немаловажную роль играет иммуногенность антигенных веществ паразита. Что касается описторхозной инвазии, то уровень вырабатываемых антител к соматическому и яичному антигенам, значительно выше в сравнении с экскреторно-секреторным [62].

Однако повышенные титры специфических антител, определяемые в серологических тестах, не дают основания для установления окончательного диагноза, так как иммунологические реакции, могут предшествовать по времени выделению яиц или протекать, когда паразиты уже элиминированы из организма.

Окончательный диагноз на описторхоз устанавливается только при обнаружении в дуоденальном содержимом или фекалиях яиц возбудителя [63].

Сохраняя постоянство своего состава, кровь, тем не менее, является достаточно лабильной системой, быстро отражающей происходящие в организме изменения, как в норме, так и в патологии. Она очень быстро реагирует на возникающие в организме патологические процессы, биохимические реакции и другие факторы. Отклонение множества устойчивых количественных, биохимических и иммунологических показателей (констант) крови от нормы служит одним из важных диагностических признаков заболеваний [64].

1.2 Собственные исследования

1.2.1 Краткая характеристика предприятия

Научно-инновационный центр современной биотехнологии организован на основании приказа Президента АО «Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина» № 148 от 27 декабря 2004 года. А в 2008 году, в связи с ростом финансирования НИР, укрепления научного потенциала и материально-технической базы, преобразован в Научно-исследовательский институт биотехнологии (приказ № 94 от 06 марта 2008 года).

Основные задачи НИИ:

-разработка научных проектов и участие в конкурсах по приоритетным направлениям фундаментальных и прикладных биотехнологических исследований, а также в международных проектах;

-формирование творческих коллективов из числа ведущих ученых кафедр и родственных научных организаций, а также аспирантов и магистрантов для реализации проектов республиканских научных заданий и международных программ;

-участие в формировании программ и методик научных исследований и осуществление контроля за их реализацией ответственными исполнителями тем;

-поиск и привлечение перспективных научных сотрудников из числа выпускников докторантуры, аспирантуры и магистратуры, с целью укрепления кадрового потенциала «Института»;

-обеспечение интеграции с научными учреждениями и ВУЗами республики, научными центрами зарубежных стран;

-содействие в пропаганде передовых научных достижений и внедрение результатов научных исследований в народное хозяйство и учебный процесс;

-организация научно-производственных конференций, семинаров-совещаний, с целью переподготовки научных и практических работников для сельскохозяйственной биотехнологии;

-максимальное использование материально-технической базы «Института» при подготовке высококвалифицированных специалистов - биотехнологов, путем привлечения студентов старших курсов для участия в выполнении научно-исследовательских проектов.

Организационная структура:

Отдел биотехнологии растений (Руководитель к.с-х. н., доцент Швидченко В.К.):

1. лаборатория селекции с/х растений;

2. лаборатория диагностики заболеваний с/х растений;

3. лаборатория микроклонального размножения растений;

Отдел биотехнологии животных (Руководитель к.б. н., доцент Боровиков С.Н.):

1. лаборатория иммунодиагностики инфекционных болезней;

2. лаборатория клеточной инженерии;

3. лаборатория молекулярно-генетических методов исследований.

Основные направления научной деятельности

-разработка тест-систем, соответствующих международным стандартам, для диагностики инфекционных и инвазионных болезней сельскохозяйственных животных (бруцеллез, туберкулез, лейкоз, описторхоз, эхинококкоз и др.) на основе моноклональных антител и внедрение их в лабораторную практику;

-разработка экспресс-тестов для ветеринарно-санитарной оценки (обнаружение остаточных количеств антибиотиков) продуктов животного происхождения.

-создание на основе методов биотехнологии новых форм, линий и сортов наиболее важных продовольственных культур;

-разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику технологии производства безвирусного семенного картофеля;

-разработка и внедрение в сельскохозяйственную практику биотехнологических методов размножения посадочного материала уникальных генотипов лиственных и хвойных пород и плодовых и ягодных культур.

По научно-технической программе: «Разработка и использование генно-инженерных и клеточных технологий в медицине, сельском хозяйстве, охране окружающей среды, пищевой и перерабатывающей промышленности на 2009-2011 годы»:

-Разработка способов иммуноферментной диагностики описторхоза;

-Разработка иммуноферментной тест-системы для серологической экспресс-диагностики эхинококкозов сельскохозяйственных животных;

По бюджетной программе №042 «Прикладные научные исследования в области АПК»

-Разработка высокоэффективной импортозамещающей тест-системы для экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота;

-Разработка методов обнаружения антибиотиков в продуктах животного происхождения с целью повышения их качества;

-Создание форм, линий и сортов озимой, яровой пшеницы и тритикале методами классической селекции с использованием физиолого-биохимических, биотехнологических и генно-инженерных тестов;

-Создание форм, линий и сортов ярового ячменя и овса методами классической селекции с использованием физиолого-биохимических, биотехнологических и генно-инженерных тестов;

-Создать банк оздоровленных сортов картофеля in vitro и в полевых условиях;

-Создание с использованием методов биотехнологии 1 сорта картофеля салатного типа, приспособленного для сухостепной зоны Северного Казахстана и разработка научного обеспечения создания производства отечественных диагностикумов.

По программе «Повышение конкурентоспособности сельскохозяйственной продукции»

-Разработка тест-систем нового поколения для экспресс - диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к онкорнавирусу типа С;

-Разработка экспресс - метода ИФА для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале и объектах внешней среды;

-Разработать и внедрить в с/х практику технологию производства безвирусного семенного картофеля на основе сокращения сроков производства элиты при повышении урожайности, качества и значительном снижении себестоимости получаемой продукции;

-Разработать и внедрить в с/х практику Северного Казахстана биотехнологические методы ускоренного размножения посадочного материала плодовых и ягодных культур для возрождения промышленного садоводства.

В настоящее время в НИИ сельскохозяйственной биотехнологии выполняется ряд работ в рамках различных бюджетных программ. В рамках бюджетной программы 055 «Научная и/или научно-техническая деятельность», разработанной сроком с 2012 по 2014 год, выполняется получение и использование моноклональных антиидиотипических антител и иммунодиагностике описторхоза, разработка экспресс-тестов для определения в крови кардиомаркеров - белков, специфичных для инфарктного состояния. Также идет разработка ПЦР тест-систем для диагностики паратуберкулеза животных. Наряду с этим, осуществляется изучение свойств антиидиотипических антител как основы для разработки новых диагностических и профилактических биопрепаратов.

Согласно Бюджетной программе 042 «Прикладные научные исследования в области АПК», идет работа по отработке технологии производства стандартных антигенов для диагностики лейкоза КРС на основе использования методов клеточной инженерии, а также разрабатываются системы генетической идентификации возбудителей бактериальных инфекционных болезней животных и птиц и иммунохромотографический тест для определения ангельминтиков в продуктах животноводства.

В рамках Бюджетной программы 026 «Предоставление инновационных грантов в рамках направления Производительность - 2020» разрабатывается иммунохромотографический тест для выявления микобактерий M.bovisили их антигенов в патологическом материале и других биологических объектах.

Работа по созданию набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скотаосуществляется согласно программе оказания услуг технологического бизнес-инкубирования ТОО «Региональный технопарк г.Астаны»

В будущем НИИ биотехнологии планирует расширение научных исследований в области клеточной инженерии, молекулярной биологии и нанотехнологии, направленных на усовершенствование диагностики инфекционных болезней, получение новых сортов и гибридов с-х растений.

1.2.2 Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись возбудитель Opisthorchis felineus (церкарии, метацеркарии описторхиса и мариты), рыбы из семейства карповых (Cyprinidae) - преимущественно язь, плотоядные животные - собаки.

В качестве материалов исследования использовались:

- сыворотки собак, зараженных Opisthorchis felineus, полученные в рамках выполнения проекта «ИФА - тест на основе рекомбинантного белка экскреторно-секреторного продукта возбудителя описторхоза»;

- патологический материал - печень и желчный пузырь.

Буферные растворы:

- 10ХPBS рН 7,2-7,4 (500 мл): NaCl - 43,7 г; KCl - 2,23 г; Na2HPO4 - 16,06 г; KH2PO4 - 2,03 г; остальное - дистиллированная вода.

- 1ХPBS (500 мл): 10хPBS - 50 мл; дистиллированная вода - 450 мл.

- 1ХPBS с TW-20 (1 л): дистиллированная вода - 900 мл, 10ХPBS - 100 мл, твин-20 - 500 мкл.

ЦФР (100 мл): 0,2М Na2HPO4 - 25,7 мл; 0,1М лимонная кислота - 24,3

мл; остальное - бидистиллированная вода.

При планировании и проведении экспериментов с участием лабораторных животных ориентировались на международные законы и правила, в которых отражены критерии гуманного обращения, содержания и кормления: Международные руководящие принципы для биомедицинских исследований с участием животных (2012 г.) и Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (2005 г.).

Формирование экспериментальной группы собак проводили из числа беспородных животных, возрастом около 3-х месяцев. Содержание животных проводилось согласно нормам, установленным в Приложении А Европейской конвенции.

Перед началом эксперимента собаки предварительно подвергались вакцинированию против инфекционных болезней (чумы, бешенства и гепатита) и дегельментизации. Через 2 дня после дегельментизации у всех собак отбирались образцы крови.

Обнаружение инвазированных особей среди рыб семейства карповых проводили путем детекции в мышечной ткани метацеркариев O. felineus, используя метод компрессионной микроскопии.

Заражение животных проводили путем вольного скармливания рыбой из семейства карповых (язь, карась, лещ, линь, плотва, чебак), пораженной метацеркариями O. felineus.

В период эксперимента у животных каждые 10 дней брались образцы крови для исследований основных гематологических и биохимических показателей, а также для изучения выработки специфических антител против возбудителя O. felineus на всем этапе инвазионного процесса.

Подопытных животных подвергали патолого-анатомическому вскрытию спустя 50 дней после заражения с целью выделения от собак половозрелых форм О. felineus - метацеркарий.

Выделенные личиночные формы были использованы для получения экскреторно-секреторного антигена. Антиген готовили по способу [65] с небольшими изменениями. Для этого живые мариты описторхов, полученные от экспериментально зараженных собак, после отмывки физиологическим раствором, культивировали в неполной среде Игла при температуре 37°С (5% СО2) в течение 24 часов. После этого переносили на матрац со свежей питательной средой Игла, содержащей антибиотики, и дополнительно инкубировали в течение 72 часов. Полученная культуральная среда очищалась центрифугированием и фильтрацией через мембранные фильтры (0,45 мкм, Millipore) и использовалась в качестве экскреторно-секреторного антигена.

Активность и специфичность полученного антигена, а также динамику иммунологических показателей проверяли в иммуноферментном анализе, используя специфические сыворотки.

1.2.3 Результаты исследований

Формирование экспериментальной группы лабораторных животных

На проведение экспериментов с использованием лабораторных животных было получено разрешение Этической комиссии факультета, Протокол заседания №1 от 07.04.2015 г.

В результате была сформирована экспериментальная группа собак, состоящая из 5 особей в возрасте двух-трех месяцев. Животные содержались в стандартных условиях вивария на смешанном сбалансированном рационе питания с оптимальным соотношением белков, жиров и углеводов (рисунок 4).

Рисунок 4 - Экспериментальная группа собак



Обнаружение инвазированных особей среди рыб семейства карповых

Для проведения экспериментального заражения проводили поиск инвазированных особей среди рыб семейства карповых.

Отлов рыбы проводили в озерах Акмолинской области, многие из которых имели сообщение с рекой Нура, являющейся одним из очагов развития O. felineus. Рыба доставлялась с озер Коргалжынского (Шолак, Шалкар, Есей, Каражар, Биртабан, Садыбай, р. Нура), Астраханского (Камысты), Аршалынского (Байдал), Целиноградского (Майбалык) районов. Для исследования отбирались следующие виды рыб: карп, язь, плотва, лещ, окунь, карась, чебак (рисунок 5).

Рисунок 5 - Рыба, выловленная для выловленная для исследования на наличие заражения метацеркариями возбудителя O. felineus

Для обнаружения метацеркариев в тканях рыбы использовали компрессионный метод. Для этой цели исследовали по 5 проб мышц с подкожной клетчаткой с обеих сторон рыбы: по 3 пробы из спинной и 2 из брюшной части мышц с каждой стороны. Готовые компрессионные препараты просматривали под бинокуляром при увеличении в 16 раз (рисунок 6).



Рисунок 6 - Приготовление компрессориев для исследования мышечной ткани рыбы на наличие метацеркариев описторхоза

животное гельминтоз антиген казахстан

Всего было исследовано 1049 особей рыб различных видов из семейства карповые. Данные по исследованию рыбы на наличие метацеркариев возбудителя описторхоза, в зависимости от видового состава и места обитания, приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты исследования рыбы на наличие описторхоза

№ п/п	Место вылова рыбы	Название водоема	Вид Рыбы	Всего исследовано, шт.	Из них, шт.
					положительно	отрицательно
1	2	3	4	5	6	7
1	Коргалжынский район	о. Шолак	Язь	234	99	135
			Лещ	113	5	108
			плотва	363	22	341
			Чебак	2	-	2
2	Астраханский район	о. Камысты	карась	35	-	35
3	Коргалжынский район	о. Есей	Язь	41	3	38
			Чебак	12	-	12
			карась	13	-	13
			Лещ	1	-	1
			Окунь	2	-	2
4	Коргалжынский район	о. Каражар	Язь	96	-	96
			карась	15	-	15
			Лещ	10	-	10
5	Коргалжынский район	о. Биртабан	карась	6	-	6
6	Коргалжынский район	Река Нура, Садыбай	язь	9	2	7
			лещ:	20	-	20
			Окунь	2	-	2
			плотва	1	-	1
7	Коргалжынский район	о. Шалкар	Язь	10	2	8
			плотва	3	-	3
8	Коргалжынский район	Река Нура	карась	31	-	31
9	Целиноградский район	о.Майбалык	Лещ	10	-	10
			Карп	10	-	10
10	Аршалинский район	о. Байдал	Линь	10	-	10
Итого	1049	133	916

Исходя из данных таблицы 2, следует, что рыба из семейства карповые, выловленная в озерах четырех районов Акмолинской области, больше всего подвержена инвазии возбудителем описторхоза в Коргалжынском районе. При этом зараженность описторхозом рыбы в инвазированных водоемах колеблется в зависимости от вида и составляет: язь - 36%, лещ - 4,4%, плотва - 6%.

Заражение собак (антигельминтики, копрологию (перед и после), вакцинация, заражение)

Инвазированную описторхозом рыбу использовали для скармливания собакам на 12 день после последней вакцинации путем вольного скармливания в течение 4 дней.

Изучение гематологических показателей крови зараженных собак. Перед началом заражения у всех собак опытной группы были отобраны образцы крови для изучения основных показателей крови.

Периферическую кровь брали из поверхностных вен - латеральной голени. Пробы брали ранним утром натощак.

Анализ основных показателей крови проводили в клинико-диагностической лаборатории «Олимп» (г. Астана).

Полученные данные показали, что все показатели крови экспериментальных собак находились в физиологической норме.

Анализ результатов крови, включающий гематологические исследования, очень хорошо коррелировал с развитием инвазионного процесса. Отбор крови у животных проводили до заражения, на 10, 26, 37 дни после начала заражения.

Рассматривая общие показатели лейкоцитов в крови, то следует отметить неоднозначную картину, и варьирование значений происходит в зависимости от животного. Возможно, такое варьирование лейкоцитов в крови экспериментальных животных, связано с изменением различных типов данных клеток. Развернутый анализ крови определяет процентное соотношение лейкоцитов различных типов: нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов (Приложение 1). Доля некоторых из них при определенных заболеваниях организма может возрастать, а других - пропорционально снижаться. В нашем случае мы наблюдали картину, где показатели различных видов лейкоцитов варьируют при изучаемой инвазии.

Основным индикатором при постановке эксперимента, являются показатели эозинофилов, так как данный показатель всегда находится на высоком уровне и принимает активное участие в борьбе с паразитарными инвазиями. Главнейшее их свойство - это экспрессия Fc-рецепторов, специфичных для IgE. Физиологически это проявляется в мощных цитотоксических свойствах эозинофилов, и их активном участии в противопаразитарном иммунитете. Данные, полученные при изучении данного показателя в крови экспериментальных животных представлены на рисунке 6.



Рисунок 7 - Концентрация эозинофилов в крови собак

Говоря о данных представленных на рисунке. Показатели эозинофилов в крови собак на 10 день после начала заражения, резко увеличивались и были в пределах 7,9-31,3%. Также увеличение было зафиксировано и на 26 день после заражения животных, после чего данный показатель начал снижаться к 37 дню. Данные показатели являются свойственными эозинофилам в инвазионном процессе, так как большая их часть недолго остается в крови и, попадая в ткани, длительное время находится там [66, 67].

Кроме того следует отметить и повышение уровня лимфоцитов у всех экспериментальных животных уже на 10 день после заражения. Лимфоциты являются основными клетками иммунной системы организма и выделяют в кровь антитела, блокирующие молекулы антигенов и выводящие их из организма. Данный показатель, также как и вышеописанные, доказывает наличие в организме экспериментальных животных протекание инвазионного процесса.

Если же рассматривать показатели сегментоядерных нейтрофилов, то они варьировались в зависимости от животного. У трех из пяти собак наблюдается повышение данного показателя в процессе развития инвазионного процесса, тогда как у двух других собак показатели значительно снижаются.

Показатели общего содержания базофилов в крови собак также были неоднозначны. Анализ общего содержания базофилов у собак №1, 4 и 5 показал их полную противоположность по отношению к сегментоядерным нейтрофилам. Если в первом случае показатели увеличивались, то общее содержание базофилов у этих животных снижалось при длительности протекания инвазионного процесса. У собаки №3 показатели базофилов на 10 день были в норме, на 26день инвазии резко снизились, и уже на 37 день было зарегистрировано увеличение данного показателя.

Моноциты в крови животных, за исключением собаки №2, показали снижение с развитием инвазионного процесса.

Рассматривая показатели общего содержания плазмоцитов в крови экспериментальных животных, можно прийти к выводу, что у всех собак также замечено снижение данного показателя в процессе инвазионного процесса.

Таким образом, проведя развернутый анализ различных типов клеток лейкоцитов, полученных от экспериментальных животных, можно сделать вывод, что каждый тип клеток специфически реагирует на присутствие в организме животных возбудителя описторхоза и на течение инвазионного процесса.

При изучении и анализе в крови показателей тромбоцитов у первых двух опытных собак, данный показатель увеличивался в процессе инвазии, тогда как у остальных животных, данный показатель снижался.

Практически такой же результат показал и тромбокрит, отражающий долю объема периферической крови, которую занимают тромбоциты. Средний объем тромбоцита показал снижение у всех животных на протяжении проведения эксперимента.

Большие изменения в сторону увеличения общего содержания в процессе развития инвазионного процесса, показали такие показатели, как эритроциты, гемоглобин и его распределение по объему.

Как известно, эритроциты представляют собой красные кровяные тельца, которые образуются в красном костном мозге. Эритроциты содержат в своем составе гемоглобин, чья функция сводится к переносу кислорода из легких к тканям и органам, а углекислого газа обратно к легким. Распределение гемоглобина по объему при его увеличении или снижении одного из них приводит к полицитемии или анемии, соответственно. Все три показателя тесно связаны между собой и дополняют друг друга, поэтому увеличение или снижение одного из них, ведет к корреляционным изменениям остальных показателей. Изменения показателей эритроцитов и гемоглобина в крови собак в процессе инвазионного процесса, представлены на рисунке 8.

Рисунок 8 - Показатели эритроцитов в крови животных

Такие показатели, как средний объем эритроцита, распределение эритроцитов по объему, среднее содержание гемоглобина в эритроците оставались в норме с незначительными отклонениями. А вот средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах оставалась в норме на начальных этапах эксперимента повышалась только на 37 день заражения животных.

Также со значительными отклонениями был детектирован цветовой показатель крови, показывающий относительное содержание гемоглобина в эритроцитах. Наблюдается очень тесная корреляционная связь при соотношении показателей эритроцитов с гематокритом. На всем протяжении эксперимента, гематокрит увеличивается вместе с общим содержанием эритроцитов.

Динамика общего содержания гемоглобина в крови животных также повышалась, как и показатели содержания эритроцитов. Эти данные вполне коррелируют с распределением гемоглобина по объему, где также происходит повышение общих показателей.

Полученные результаты указывают на то, что при инвазировании животных возбудителем описторхоза происходит сдвиг физиологической нормы гематологических показателей крови, среди которых наиболее выражены эозинофилы, лимфоциты, эритроциты, концентрация гемоглобина и его распределение по общему объему.

Биохимические показатели крови собак, искусственно зараженных О.felineus

Кроме гематологических показателей, проводилась работа по изучению биохимических показателей крови на 50 день после заражения животных. Основным индикатором при описторхозе, являются такие показатели крови, как аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП), билирубин, амилаза и холестерин [68, 69]. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Основные биохимические показатели экспериментальных животных на 50 день после заражения

Показатель	Норма	Единицы	Номер экспериментальной собаки
			Контр	1	2	3	4	5
Общий белок	56-75	г/л	47,5	63	53,8	53,8	50,9	52,7
АЛТ	0,00-39,00	МЕ/л	20	337,00	35,00	26,00	49,00	38,00
АСТ	0,00-56,00	МЕ/л	41	98,00	25,80	70,80	42,40	144,20
Билирубин (общий)	0,00-17,00	мкмоль/л	<2,5	1,10	0,40	0,30	0,50	1,00
Билирубин (прямой)	0,00-5,00	мкмоль/л	<1,5	1,20	1,00	1,20	1,40	0,90
Билирубин (непрямой)	1,50-17,00	мкмоль/л	1	-0,10	-0,60	-0,90	-0,50	0,10
ГГТП	0,00-87,00	МЕ/л	0	35,00	3,00	2,00	4,00	8,00
Общая амилаза	28,00-100,00	МЕ/л	515	812,00	881,00	876,00	740,00	321,00
Холестерин	3,11-5,18	ммоль/л	6,82	6,07	7,58	7,58	5,93	7,34

Из данной таблицы видно, что по сравнению с контролем, показатели сыворотки крови экспериментальных животных отличались повышенным содержанием практически всех изучаемых параметров. Так, стоит отметить повышенное содержание в крови экспериментальных собак трансаминаз АЛТ и АСТ, ГГТП, общей амилазы и общего белка. Все эти показатели являются маркерами при диагностике заболеваний печени, в том числе и описторхоза.

Получение экскреторно-секреторного антигена

С целью обнаружения половозрелых форм гельминта исследовались желчные ходы печени и желчный пузырь.

Как показали результаты паталого-анатомического вскрытия, все подопытные животные были заражены описторхисами. Результаты количественного содержания описторхов в каждом органе представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Количество описторхов в желчном пузыре и в печени у собак, зараженных описторхозом (по результатам исследований)

Номера собак	В желчном пузыре	В печени	Общее количество
1	52	363	415
2	150	217	367
3	19	569	588
4	16	266	282
5	26	769	795



Половозрелых гельминтов собирали в чашки Петри со стерильным физиологическим раствором, отмывали от крови, проверяли их активность и видовую принадлежность визуально под микроскопом при увеличении 20х10 (рисунок).

Для получения экскреторно-секреторного антигена живые мариты описторхов культивировали в неполной среде Игла в течение 72 часов. В результате сбора культуральной жидкости и ее очистки получено 45 мл экскреторно-секреторного антигена.

Характеристика иммунологических показателей на протяжении всего периода описторхозной инвазии

Тестирование специфических антител против ЭСП возбудителя проводили в непрямом варианте твердофазного иммуноферментного анализа. При этом экскреторно-секреторный антиген адсорбировали в ячейках полистистиролового планшета для иммунологических реакций («Nunc», Дания) в объеме 0,1 мл при 4°С в течение 18 часов.

После инкубации планшет отмывали три раза ЗФР с 0,05% твин-20 на аппарате StatFax 2600.