Антитіла молока і сироватки крові людини: характеристика каталітичної активності та вплив на ріст і виживання клітин
Гуморальна імунна система. Відмінності імунного статусу організму вагітних жінок і породіль від нормального. Компоненти молозива та молока жінок. Формування каталітичних центрів ензимів та їх властивості знешкоджувати вірусні та бактеріальні антигени.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 20.02.2009 |
| Размер файла | 106,7 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Отже, нами вперше встановлено, що у сироватці крові хворих на розсіяний склероз і в молозиві клінічно здорових породіль містяться абзими, здатні гідролізувати гістон Н1. Показано, що IgG - і sIgA-абзими різняться між собою за чутливістю до дії інгібіторів відомих протеаз.
Вплив антигістонових АТ на ріст і виживання клітин in vitro. Оскільки анти-гістон Н1 антитіла, очищені із сироватки крові хворих на розсіяний склероз та із молока людини за антигенною специфічністю можна віднести до ауто-АТ, важливо було визначити їхній вплив на ріст і виживання клітин in vitro. Мішенями тут слугували Т-клітини лінії Jurkat. Встановлено, що анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль і анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз відрізняються між собою за дією щодо цих клітин. Із рис.17 видно, що дія анти-гістонових sIgA-антитіл упродовж 72 год суттєво не вливає на ріст Т-клітин лінії Jurkat. У той же час, під впливом антигістонових IgG-антитіл спостерігався помітний приріст кількості цих клітин.
Отримані нами дані вказують на те, що анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть володіти промітогенною активністю щодо Т-клітин лінії Jurkat. Тому було припущено, що відмінність у дії антигістонових АТ сироватки крові хворих на розсіяний склероз та антигістонових АТ молозива породіль на Т-клітини лінії Jurkat може бути пов'язана із їхньою здатністю до інтерналізації. Підставою для цього припущення слугували дані про те, що IgG-антитіла, специфічні до деяких ядерних антигенів, можуть не лише проникати у клітини ссавців, але й транспортуватися в ядро цих клітин (Ma et al., 1993; Avrameas et al., 1998).
Щоб перевірити цю гіпотезу, анти-гістонові-АТ обох ізотипів інкубували із Т-клітинами лінії Jurkat і визначали їхню субклітинну локалізацію за допомогою анти-IgG і анти-IgA антитіл, кон'югованих із пероксидазою хрону. Результати мікроскопії фіксованих препаратів клітин показали (рис.18), що після 2-годинної інкубації значна кількість анти-гістонових IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз потрапляє у цитоплазму клітин-мішеней
У той же час, присутність анти-гістонових sIgA-антитіл у клітинах була незначною. Здатність анти-гістонових IgG-антитіл інтерналізуватися у клітини ссавців було також підтверджено при використанні трансформованих фібробластів лінії L929 (рис. 19).
Отримані результати свідчать про те, що на відміну від анти-гістонових sIgA-антитіл молозива породіль, антигістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть інтерналізуватися клітинами ссавців.
Зв'язок між стимулюючим ефектом анти-гістонових IgG на ріст лейкемічних лімфоцитів людини лінії Jurkat in vitro, їхньою протеолітичною активністю щодо гістону Н1 та здатністю до інтерналізації цих АТ дозволяє запропонувати гіпотезу про механізм активації проліферації клітин під дією цих антитіл. В основі цього механізму може лежати деконденсація хроматину, викликана гідролізом лінкерного гістону Н1 під впливом IgG-абзимів, які за певного функціонального стану клітин-мішеней можуть проникати в їхнє ядро.
Характеристика фосфотрансферазної активності АТ молозива породіль і сироватки крові хворих на СЧВ. Фосфорилювання білків і ліпідів є ключовими реакціями, задіяними у регуляції життєдіяльності клітин. Раніше нами було встановлено, що sIgA молока жінок володіють спорідненістю до АТР і казеїнкіназною активністю (Kit et al., 1995). У наступних дослідженнях ми показали, що sIgA молока жінок також можуть володіти ліпідкіназною активністю. Ліпідкіназну активність антитіл було виявлено при аналізі продуктів фосфорилювання хроматографічних фракцій, отриманих гель-фільтрацією препаратів sIgA, очищених із молока жінок послідовними хроматографіями на протеїн А-агарозі і ДЕАЕ-фрактогелі (рис.7А).
Для дисоціації можливих імунних комплексів у препаратах sIgA гель-фільтрацію проводили у присутності 50 мМ NaOH (рис. 20А). Хроматографічний пік було розділено на 2 фракції і після нейтралізації рН було проаналізовано їхню протеїнкіназну активність. У sIgA-антитіл фракції 2 виявлено фосфорилювання секреторного компоненту (SC) і важких ланцюгів (Н) цих імуноглобулінів (рис. 20В, доріжка 2). На відміну від фракції 2, у sIgA фракції 1, при низькому рівні фосфорилювання поліпептидів імуноглобулінів, спостерігали також утворення низькомолекулярного 32P-міченого продукту (рис. 20В, доріжка 1), який не фарбувався Coomassie (рис. 20Б, доріжка 1).
На підставі даних було зроблено припущення, що виявлені нами фосфорильовані продукти належать до фосфоліпідів. Це припущення було підтверджене після екстракції цих продуктів розчином хлороформ-метанол (2: 1) і їхнім розділенням ТШХ у буферній системі, яку використовують для аналізу фосфоліпідів (рис. 20Г). Отже, sIgA-антитіла молока породіль можуть володіти як протеїнкіназною, так і ліпідкіназною активністю. При цьому ліпіди знаходяться у комплексі із імуноглобулінами і не дисоціюють при високих значеннях рН. На основі комбінованого аналізу цих сполук із застосуванням методів ензиматичної та хімічної деградації було зроблено висновок (Gorbunov et al., 2000, 2005), що субстратами каталізу sIgA-абзимів молока є 2 гліколіпіди, до складу яких входить один залишок сіалової кислоти та 4-5 залишків жирних кислот.
Результати наших досліджень показали, що ліпідкіназна активність властива також IgG-антитілам сироватки крові хворих на СЧВ (рис.21).
При електрофоретичному аналізі продуктів фосфорилювання препаратів IgG, очищених із сироватки крові хворих на СЧВ хроматографією на протеїн А-сефарозі (рис.21Б, доріжка 1), як і у випадку sIgA-антитіл молока людини, спостерігали утворення низькомолекулярних 32Р-мічених сполук небілкової природи (рис.21В, доріжка 1), які також екстрагувалися із реакційного середовища розчином хлороформ-метанол (2: 1) і розділялися ТШХ на три фракції (рис.21Г, доріжка 1). Радіоактивно мічені продукти ліпідної природи було також виявлено при фосфорилюванні препаратів IgG (рис.21Г, доріжка 2), очищених на колонці із АТР-сефарозою (рис.21А). При цьому фосфорилювання ліпідів не спостерігалося у випадку, коли із [-32P] ATP інкубували IgG, які не володіли спорідненістю до АТР (рис.21В, доріжка 2).
Отримані дані дозволяють припустити, що у сироватці крові хворих на СЧВ, подібно як у молоці людини, можуть бути присутні IgG-абзими, які володіють фосфотрансферазною активністю. Ми також припустили, що ліпіди можуть впливати на протеїнкіназну активність IgG-антитіл. Для перевірки цього припущення IgG піддавали гель-фільтрації у буферній системі, яка містила 5% діоксану (рис.22). При інкубації IgG, очищених у такий спосіб від ліпідів, із [-32P] ATP було виявлено включення 32Р у важкі (Н) і легкі (L) ланцюги IgG. При цьому рівень фосфорилювання їхніх поліпептидів значно зростав у випадку, коли до реакційної суміші додавали 1 мкМ нерадіоактивного АТР.
Нами також проаналізовано, як впливає видалення ліпідів на рівень фосфорилювання АТ, очищених із молозива породіль і сироватки крові хворих на склеродермію. Встановлено, що руйнування комплексів ліпід-АТ гель-фільтрацією у присутності іонного розчинника діоксана стимулює фосфорилювання, не тільки IgG сироватки крові хворих на СЧВ, але й sIgA-антитіл молозива породіль і IgG-антитіл сироватки крові хворих на склеродермію. Очищені у такий спосіб від ліпідів препарати IgG здорових донорів не виявляли протеїнкіназної активності.
Отже у молоці клінічно здорових жінок і у сироватці крові хворих на СЧВ присутні абзими із фосфотрансферазною активністю. Характерною ознакою цих каталітично активних антитіл є їхня спорідненість до АТР і ліпідів. Висока спорідненість АТ до ліпідів дозволяє класифікувати виявлені абзими як антифосфоліпідні IgG. Підтвердженням цього можуть слугувати дані про те, що АТ із спорідненістю до фосфоліпідів можуть перехресно реагувати із АТР (Wasef et al., 1993; Chapman et al., 2005). Можна припустити, що за рахунок конкуренції цих сполук за антиген-зв'язувальні ділянки молекул АТ відбувається перенос макроергічного гамма-фосфату молекули АТР на акцепторні групи ліпідів, і, можливо, білків. Крім того, не виключено, що фосфотрансферазна активність властива деяким ізотипам імуноглобулінів сироватки крові. На це вказують дані про те, що афінно-очищені IgA сироватки крові клінічно здорових донорів можуть фосфорилювати казеїн у присутності [-32P] ATP. Для виявлення ділянок АТ, які залучені у фосфотрансферазну реакцію, ми використали комп'ютерний аналіз рівня гомології первинних структур білків імуноглобулінової надродини і відомих протеїнкіназ. За допомогою цього підходу було встановлено, що Fc-фрагменти імуноглобулінів містять послідовності, гомологічні до деяких протеїнкіназ. Отримані результати слугували поштовхом для дослідження протеїнкіназної активності рецептора Т-гелперних клітин СD4.
Протеїнкіназна активність rsCD4. Рецептор СD4 - це глікопротеїн, який розташований на зовнішній поверхні плазматичної мембрани Т-гелперів, задіяний в активації внутрішньоклітинних процесів у цих клітинах, і, крім того, спільно із рецептором (TCR) /CD3 бере участь у різних міжклітинних взаємодіях [Gay et al., 1987; Doyle and Strominger, 1987]. За своєю будовою рецептор СD4 належить до надродини імуноглобулінових білків і тому деякі властивості цього білка можуть бути спільними з ознаками ауто-АТ та абзимів (рис.23А).
Спочатку нами було проведено пошук амінокислотних послідовностей СD4 із найвищим рівнем гомології щодо відомих протеїнкіназ. Для такого аналізу використано банк генів протеїнкіназ KinBase та програму порівняння Kinom Blast Server (www. kinase. com). Встановлено, що найвищим рівнем гомології до протеїнкіназ володіє послідовність довжиною 100 амінокислотних залишків, яка входить до структури двох імуноглобулінових доменів позаклітинної ділянки рецептора СD4. Отримані дані дозволили припустити, що позаклітинний фрагмент СD4 володіє протеїнкіназною активністю. Для перевірки цієї гіпотези було використано рекомбінантний розчинний рецептор rsCD4 (“Genentech”, США), послідовність якого гомологічна позаклітинному фрагменту СD4 (рис.23А). Аналіз протеїнкіназної активності rsCD4 показав (рис.23Б), що у присутності [-32P] ATP відбувається фосфорилювання рецептора (доріжка 1). Фосфорилювання rsCD4 не відбувалося, коли білок попередньо прогрівали при 65 0С (доріжка 2) або коли до реакційної суміші додавали 3 мМ АТР (доріжка 3). Інкубація rsCD4 із [?-32P] ATP також не призводила до його фосфорилювання (доріжка 4). Отримані дані вказують на те, що рецептор rsCD4 володіє протеїнкіназною активністю. Додатковим аргументом на користь цього можуть слугувати дані фосфорилювання казеїну коров'ячого молока у присутності rsCD4 та [-32P] ATP (рис.23Б, доріжки 5, 6). Наступними дослідами було показано, що подібно до класичних протеїнкіназ, для фосфорилювання рецептора rsCD4 необхідною є наявність двовалентних катіонів. Їхній вплив на протеїнкіназну активність rsCD4 у порядку зростання виглядає наступним чином: Ca2+ > Zn2+> Mn2+> Ni2+> Mg2+ > Cu2+ >Co2+. Реакція фосфорилювання також інгібувалась діетилпірокарбонатом, що вказує на участь у каталізі залишків гістидину. Визначення амінокислотної специфічності фосфорилювання показало, що фосфорилювання казеїну за участю rsCD4 відбувається за залишками серину.
Встановлено, що інкубація rsCD4 із плазмою крові людини призводить до фосфорилювання двох білків із мол. масою 62 і 12 кДа. Це вказує на те, що у плазмі крові можуть бути присутні ендогенні субстрати протеїнкіназної активності цього рецептора.
Отже нами встановлено, що рекомбінантний аналог білка, який належить до надродини імуноглобулінів, а саме рецептора Т-гелперних клітин СD4 володіє протеїнкіназною активністю.
Біологічна роль протеїнкіназної активності рецептора СD4 залишається невідомою. Оскільки у протеїнкіназній активності задіяний позаклітинний фрагмент рецептора, за місцем локалізації ензиму в клітині СD4 можна віднести до ектопротеїнкіназ плазматичної мембрани лімфоїдних клітин. Очевидно, протеїнкіназна активність рецептора CD4 може бути направлена як на регуляцію біологічної активності Т-гелперних лімфоцитів, так і на регуляцію взаємодії білків плазми крові і лімфи із Т-лімфоцитами і лімфоїдними клітини, які також продукують цей рецептор. Той факт, що присутність АТР є необхідною умовою активації Т-лімфоцитів (Filippini et al., 1990; Redegelt et al., 1991), може також слугувати на користь цього припущення.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі вперше проведено комплексне дослідження з метою виявлення, очистки та функціональної характеристики аутологічних антитіл сироватки крові та молока людини у нормі та при деяких аутоімунних захворюваннях. Отримані дані свідчать про те, що у сироватці крові і молоці людини присутні аутологічні антитіла із антигенною специфічністю щодо клітин ссавців, здатні каталізувати деякі біохімічні реакції. Встановлено, що ці антитіла впливають на ріст і виживання клітин in vitro, причому деякі з них можуть зв'язуватися з клітинами та інтерналізуватися ними. У молозиві деяких клінічно здорових жінок-породіль присутні аутоантитіла, які за антигенною специфічністю, каталітичною активністю і за впливом на клітини ссавців подібні до аутоантитіл сироватки крові хворих на розсіяний склероз і системний червоний вовчак. Це робить їх привабливими для подальшого дослідження з огляду на можливість їхнього використання як діагностичних та прогностичних маркерів аутоімунних порушень у породіль.
1. Імуноглобуліни сироватки крові хворих на розсіяний склероз і молозива здорових жінок-породіль здатні індукувати апоптоз T-клітин лінії Jurkat або стимулювати проліферацію цих клітин in vitro. Значну цитотоксичну активність імуноглобулінів виявлено у 36% обстежених хворих на розсіяний склероз і 44% клінічно здорових породіль, тоді як промітогенну активність антитіл виявлено у 13,6% хворих на розсіяний склероз і 8% здорових породіль.
2. У молозиві 8% обстежених жінок-породіль встановлено підвищений рівень антитіл, які володіють спорідненістю до дволанцюгової ДНК (анти-ДНК АТ), а у 48% породіль, виявлено антитіла зі спорідненістю до гістонів ссавців (анти-гістонові АТ).
3. Розроблено комплексний підхід для виділення та аналізу антигенної специфічності та каталітичної активності аутологічних антитіл сироватки крові і молока людини. Він полягає у використанні афінної та іонообмінної хроматографії, а також гель-фільтрації за умов дисоціації імунних комплексів, і дозволяє отримати високоочищені препарати аутоантитіл певної каталітичної активності.
4. Анти-ДНК sIgA молока людини володіють рибонуклеазою активністю щодо рибосомної РНК, топоізомеразною та ендонуклеазною активністю щодо надспіралізованої і лінійної форм ДНК плазміди, а також протеїнкіназною активністю щодо власних поліпептидів і казеїну молока людини. АТР і dАТР інгібують нуклеазну активність цих sIgA-абзимів, а синтетичні дезоксирибоолігонуклеотиди стимулють протеїнкіназну активність цих антитіл.
5. Анти-ДНК sIgA молозива породіль із різною ефективністю індукують загибель імунокомпетентних клітин (лінії Namalwa, Jurkat і L1210), а також трансформованих фібробластів миші (лінія L929). За чутливістю до цитотоксичної дії цих антитіл, досліджувані лінії клітин розподіляються наступним чином: L929 > Jurkat > L1210 > Namalwa.
6. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і сироватці крові хворих на системний червоний вовчак уперше виявлено антитіла класів sIgA і IgG, які володіють ліпідкіназною і протеїнкіназною активністю. Ліпіди співвиділяються з цими антитілами під час їхньої очистки на протеїн А-сефарозі, ДЕАЕ-фрактогелі, АТР-сефарозі і фосфорилюються у складі імунних комплексів у присутності [-32P] ATP. Гель-фільтрація даних антитіл у буфері, який містить 5% діоксан, призводить до дисоціації імунних комплексів і стимуляції протеїнкіназної активності антитіл.
7. У молоці клінічно здорових жінок-породіль і у сироватці крові хворих на розсіяний склероз вперше виявлено анти-гістонові sIgA - і IgG-антитіла, які каталізують гідроліз гістону Н1. Анти-гістонові антитіла обох ізотипів гідролізують корові гістони із значно нижчою ефективністю, ніж лінкерний гістон Н1, і не гідролізують альбумін сироватки крові бика і лізоцим курячого яйця.
8. Анти-гістонові IgG-антитіла сироватки крові хворих на розсіяний склероз стимулюють проліферацію Т-лімфоцитів лінії Jurkat. Приріст кількості цих клітин порівняно з контролем складав 37% при дії 70 мкг/мл антитіл упродовж 72 год. У той же час, анти-гістонові sIgA-антитіла молозива породіль не впливають на проліферацію Т-клітин лінії Jurkat.
9. Анти-гістонові IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз зв'язуються з Т-клітинами ліній Jurkat і L929, які здатні їх інтерналізувати. Взаємодія цих аутоантитіл із Т-клітинами лінії Jurkat упродовж 2 год або з клітинами лінії L929 упродовж 6 і 24 год призводить до значного їх накопичення у цитоплазмі клітин-мішеней. За таких умов анти-гістонові sIgA-антитіл молозива жінок-породіль не інтерналізуються клітинами вказаних ліній.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Кит Ю.Я. Фосфорилирование рецептора rsCD4 в присутствии клеток и плазмы крови человека / Ю.Я. Кит, В.А. Якубов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1995. - Т.340, № 3. - С.412-415. (Автором визначено завдання досліджень, проведено фосфорилювання rsCD4 за участю протеїнкіназ і підготовлено статтю до друку)
Kit Y. Y. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobylin A / Y. Y. Kit, D. V. Semenov, G. A. Nevinsky // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1996. - V.36, No 3. - P.521-527. (Автором проведено виділення й аналіз протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).
Кит Ю.Я. В препаратах человеческого б-лактальбумина, индуцирующих апоптоз трансформированных клеток, присутствуют рибоолигонуклеотиды / Ю.Я. Кит, Е.В. Кулигина., И.В. Романникова, Д.В. Семенов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1998. - Т.360, № 3. - С.406-408. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз досліджень і підготовлено статтю до друку).
Кит Ю.Я. Фосфорилирование липидов, прочно связанных с иммуноглобулином А, в препаратах антител из молока человека, обладающих протеинкиназной активностью / Ю.Я. Кит, М.В. Шипицин, Д.В. Семенов, В.А. Рихтер, Г.А. Невинский // Биохимия. - 1998. - Т.63, № 6. - С.852-858. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз ліпідкіназної активності sIgA молозива породіль).
Yakubov L. A. The extracellular domain of CD4 receptor possesses a protein kinase activity / L. A. Yakubov, Y. Y. Kit, V. A. Richter, A. Y. Andreeva, V. N. Karamyshev, C. A. Stein, V. V. Vlassov // FEBS Lett. - 1998. - V.431, No 1. - P.45-48. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності rsCD4).
Семенов Д.В. Иммуноглобулин G молока человека гидролизует нуклеотиды / Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Ю.Я. Кит, Д.Ю. Хлиманков, А.М. Акимжанов, Д.А. Горбунов, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. - 1998. - Т.63, № 8. - С.1097-1106. (За участю автора сплановано мету досліджень і проаналізовано отримані результати).
Nevinsky G. A. Secretory Immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein рhosphorylation / G. A. Nevinsky, Y. Ya. Kit, D. V. Semenov, D. Y. Khlimankov, V. N. Buneva // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1998. - V.75, No 1. - P.77-91. (За участю автора сплановано завдання досліджень, проведено аналіз субстратної специфічності протеїнкіназної активності sIgA-абзимів).
Кит Ю.Я. Секреторные иммуноглобулины А молока человека обладают сродством к олигонуклеотидам и нуклеиновым кислотам / Ю.Я. Кит, Д.В. Семенов, Т.Г. Канышкова, Е.В. Кулигина, И.В. Романникова, О.В. Морозова, В.А. Рихтер // Биохимия. - 1999. - Т.64, № 1. - С.52-59. (Автором сформульовано завдання досліджень, проведено виділення АТ, підготовлено статтю до друку).
Кит Ю.Я. Эндогенные олигонуклеотиды молока человека и их возможная биологическая активность / Ю.Я. Кит, Е. В Кулигина, А.М. Онищенко, Л.В. Юрченко, И.В. Романникова, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Биохимия. - 1999. - Т.64, № 8. - С.59-64. (Автором визначено завдання досліджень, проведено аналіз протеїнкіназної активності білків молозива породіль, підготовлено статтю до друку).
Кулигина Е.В. Олигонуклеотиды и олигонуклеотидсвязывающие белки спинномозговой жидкости человека / Е.В. Кулигина, А.Ю. Андреева, А.С. Могельницкий, Ю.Я. Кит, Л.А. Якубов, В.А. Рихтер, В.В. Власов // Доклады Академии Наук. - 1999. - Т.364, № 6. - С.832-834. (Автором розроблено схему виділення олігонуклеотидів із спинномозкової рідини людини, проведено аналіз олігонуклеотид-звязувальних білків, підготовлено статтю до друку).
Кит Ю.Я. Влияние нуклеиновых кислот и полисахаридов на фосфотрансферазную активность препаратов sIgA, выделенных из молока человека / Ю.Я. Кит, Д.В. Семенов, Е.В. Кулигина., В.А. Рихтер // Биохимия. - 2000. - Т.65, № 1. - С.59-64. (Автором визначено завдання досліджень, проаналізовано вплив чинникив на фосфотрансферазну активності sIgA молозива породіль, підготовлено статтю до друку).
Kit Y. Y. Human anti-DNA secretory immunglobulins A possess endonuclease activity and they are able to cause the destruction of nuclear chromatin in vitro / Y. Y. Kit, E. E. Mitrofanova, O. E. Shestova, E. V. Kuligina, I. V. Romannikova, V. A. Richter // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т.72, № 3. - С.73-76. (Автором сформульовано завдання досліджень, очищені анти-ДНК sIgA і досліджено іх ДНКазну активність, підготовлено статтю до друку).
Gorbunov D. V. Phosphorylation of Minor Lipids of Human Milk Tightly Bound to Secretory Immunoglobulin A / D. V. Gorbunov, D. V. Semenov, M. V. Shipitsin, Yu. Yu. Kit, T. G. Kanyshkova, V. N. Buneva, G. A. Nevinsky // Rus. J. Immunol. - 2000. - V.5, No 3. - С.267-278. (За участю автора сформульована мета роботи і проведено аналіз результатів досліджень).
Kit Y. Oligodeoxyadenylate stimulates the protein kinase activity of anti-DNA sIgA from human milk / Y. Kit, E. Kuligina, D. Semenov, V. Richter // Acta Biochim. Pol. - 2002. - V.5, No 1. - С.291-294. (Автором сформульована мета роботи, проведено дослідження впливу олігонуклеотидів на протеїнкіназну активність sIgA-абзимів, підготовлено статтю до друку).
Філяк Є.З. Дослідження впливу оксиду азоту на нуклеазну активність імуноглобулінів крові здорових людей / Є.З. Філяк, В.М. Коробов, Ю.Я. Кіт // Біологія тварин. - 2002. - Т.4, № 1-2. - С.157-162. (Автором визначено завдання досліджень, проаналізовано отримані дані і підготовлено статтю до друку).
Кит Ю.Я. Фосфотрансферазная активность препаратов IgG из сыворотки крови больных системной красной волчанкой / Ю.Я. Кит, В.А. Ковалева, В.А. Рихтер // Біополімери і клітина. - 2003. - Т. 19, № 2. - С.185-189. (Автором отримані IgG із спорідненістю до АТР і досліджено іх фосфотрансферазну активність, підготовлено статю до друку).
Кит Ю.Я. Взаимодействие олигонуклеотидов и АТР с препаратами sIgA, обладающими протеинкиназной активностью / Ю.Я. Кит, В.А. Якубов, Е.В. Кулигина, В.А. Рихтер // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т.75, № 2. - С.63-66. (Автором отримано препарати sIgA і досліджена їх спорідненість до олігонуклеотидів і АТР, підготовлена стаття до друку).
Кіт Ю.Я. Метод визначення протеїнкіназної активності в поліакриламідному гелі з використанням системи двомірного розділення білків / Ю.Я. Кіт, В.А. Ковальова, Я.П. Бобак, Л.Б. Дробот // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т.74, № 4. - С.129-132. (Автором розроблено метод визначення протеїнкіназної активності білків у сиворотці крові і лізатах клітин після їхнього розділення ізоелектричним фокусуванням, підготовлено статтю до друку).
Кит Ю.Я. Протеинкиназная активность иммуноглобулинов плазмы крови человека / Ю.Я. Кит, А.А. Ким, Н.Р. Гут, В.А. Рихтер // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т.77, № 3. - С.49-55. (Автором досліджено протеїнкіназну активність різних ізотипів імуноглобулінів сироватки крові людини).
Кіт Ю.Я. Виділення з молока людини секреторних імуноглобулінів класу А з різною спорідненістю до ДНК та дослідження їх ДНК-гідролізуючої активності / Ю.Я. Кiт, Р.С. Стойка // Імунологія та алергологія. - 2005. - № 1. - С.53-55. (Автором сплановано завдання досліджень, проведено аналіз спорідненості sIgA молозива породіль до ДНК і полісахаридів, підготовлено статтю до друку).
Kit Yu. Ya. Comparative analysis of the similarity between primary sequenses of receptor CD4 and protein kinases / Yu. Ya. Kit // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - No 1. - P. 20-24. (Автором проведено аналіз рівня гомології між амінокислотними послідовностями рецептора CD4 і протеїнкіназ).
Старикович М.А., Цитотоксическая активность иммуноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом / М.А. Старикович, Ю.Я. Кит, М.Я. Хавунка, Т.И. Негрич, Р.С. Стойка // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т.5, № 4. - С.26-31. (За участю автора сплановано завдання дослідження, проведена очистка антитіл, підготовлено статтю до друку).
Кіт Ю.Я. Каталітично активні антитіла (абзими) молока людини / Ю.Я. Кіт, Р.С. Стойка // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т.79, № 2. - С.5-16. (Автором проведено збір та аналіз літератури, підготовлено статтю до друку).
Kit Yu. Ya. Secretory IgAs from human milk with affinity to mammalian DNA are capable of hydrolyzing ribosomal RNA / Yu. Ya. Kit, E. V. Kuligina, V. A. Richter. Укр. біохім. журн. - 2007. - Т.79, № 3. - С.8-13. (Автором проведено дослідження впливу нуклеотидів на нуклеазну активність анти-ДНК sIgA).
Козак М.Р. Зниження життєздатності клітин селезінки та цитотоксичної активності імуноглобулінів сироватки крові мишей за умов тривалого згодовування їм мозку великої рогатої худоби / М.Р. Козак, Д.Д. Остапів, Ю.Я. Кіт, В.В. Влізло, Р.С. Стойка // Експ. клін. фізіол. і біохім. - 2007. - № 1. - С.11-15. (За участю автора визначено мету дослідження, проаналізовано отримані результати).
Козак М.Р. Індукція апоптозу та некрозу лейкемічних клітин очищеними препаратами IgG сироватки крові мишей, яким тривалий час згодовували мозок великої рогатої худоби / М.Р. Козак, В.В. Влізло, Ю.Я. Кіт, Р.С. Стойка // Біополімери і клітина. - 2008. - Т.24, № 1. - С.1-5. (За участю автора встановлено завдання досліджень, проаналізовано отримані дані, підготовлено статтю до друку).
Kit Yu. Oligodeoxynucleotides stimulate protein kinase activivity of the anti-DNA sIgA from human milk / Kit Yu., D. Semenov, E. Kuligina, V. Richter // Mechanisms of cellular signal transduction and communication: 3rd Parnas Conf., October 14 - 18, 2000.: Abstract Book. - Lviv, 2000. - P.101.
Kuligina E. Oligonucleotides and oligonucletotide-binding proteins of human extracellular fluids / E. Kuligina, Y. Kit, I. Romannikova, D. Semenov, V Richter // RNA as Terapeutic and Genomic Target: Internat. Conf., 30th August - 2nd September 2001.: Abstract Book. - Nоvosibirsk, 2001. - P.17.
Kit Yu. Study of phosphotranspherase activity of IgG fraction possessing affinity to ATP from blood serum of humans with lupus erytromatosis / Yu. Kit, V. Kovaleva, L. Drobot // Frontiers in autoimmunity: fundamental aspects and clinical perspectives: Internat. Conf., September 8 - 18, 2002.: Abstract Book. - Keszthly, (Hungary), 2002. - P.39.
Kit Yu. Ya. Comparattive analysis of primary sequence similarity between receptor CD4 and protein kinases / Yu. Ya. Kit // Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології, 25-28 квіт. 2004 р.: тези доп. - Львів, 2004. - C.34.
Kit Yu. Ya. ATP inhibits endonuclease activity of anti-DNA sIgA from human milk / Yu. Ya. Kit, M. O. Starykovych, V. A. Richter, R. S. Stoika // Molecular mechanisms of cellular signaling: 5th Parnas Conf., April 26-29 2005.: Український біохімічний журнал. - 2005. - T.77, № 2 (спец. вип) - С.186-187.
Starykovych M. O. Cytotoxic activity of immunoglobulins isolated from blood serum of multiple sclerosis / M. O. Starykovych, M. A. Khavunka, T.I. Nehrych, Yu. Ya. Kit, R. S. Stoika // Molecular mechanisms of cellular signaling: 5th Parnas Conf., April 26-29 2005.: Український біохімічний журнал. - 2005. - T.77, № 2 (спец. вип) - C.238-239.
Кіт Ю.Я. Каталітично активні антитіла (абзими) молока людини і деякі механізми регуляції їх активності / Ю.Я. Кіт, Р. С Стойка // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р.: тези доп. - Х., 2006 - Т.1. - С. 20.
Кіт Ю.Я. Цитотоксична активність sIgA-абзимів молока людини / Ю.Я. Кіт, М.О. Старикович // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовт. 2006 р.: тези доп. - Х., 2006 - Т.1. - С.45.
Kit Yu. Ya. Colostrum antibodies as potential markers of autoimmune disoders in parturient women / Yu. Ya. Kit, M. O. Starykovych, R. O. Bilyy, N. R. Skorohyd, V. A. Richter,. L. B. Yanyv, R. S. Stoika // Basic Science for Medicine: 3rd Internat. Conf., September 2 - 8, 2007. - Novosibirsk, 2007. - С.129.
Кіт Ю.Я. Функціональна активність автологічних антитіл в нормі та при деяких автоімунних захворюваннях / Ю.Я. Кіт // ІІ з'їзд Українського товариства клітинної біології, 23 - 26 жовт. 2007 р.: тези доп. - К., 2007. - С. 196.
Старикович М.О. // Антигенна специфічність і каталітично активність антитіл молозива породіль та їх вплив на ріст і виживання лейкемічних клітин in vitro / М.О. Старикович, Ю.Я. Кіт, Р.О. Білий, Н.Р. Скорохід, Л.Б. Гнатюк, Р.С. Стойка // ІІ з'їзд Українського товариства клітинної біології, 23 - 26 жовт. 2007 р.: тези доп. - К., 2007. - С. 208.
Недовіз В. Імуноглобуліни сироватки крові хворих на множинну мієлому здатні гідролізувати гістон Н1 / В. Недовіз, Ю. Кіт, Н.Р. Гут, О. Шалай, В. Логінський, Р. Стойка // ІІ з'їзд Українського товариства клітинної біології, 23 - 26 жовт. 2007 р.: тези доп. - К., 2007. - С.277.
АНОТАЦІЯ
Кіт Ю.Я. Антитіла молока і сироватки крові людини: характеристика каталітичної активності та вплив на ріст і виживання клітин. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут біології клітина НАН України, Львів, 2008.
Дисертація присвячена вивченню антигенної специфічності і каталітичної активності антитіл сироватки крові і молозива людини в нормі та за деяких аутоімунних захворювань, а також встановленню впливу антитіл на ріст і виживання клітин ссавців.
Встановлено, що препарати імуноглобулінів сироватки крові частини хворих на розсіяний склероз і молозива здорових жінок-породіль можуть індукувати апоптоз або стимулювати проліферацію різних клітин-мішеней in vitro.
Функціональна активність антитіл щодо клітин може бути зумовлена їхньою антигенною специфічністю і каталітичною активністю.
Із молозива породіль очищено анти-ДНК sIgA, які володіють топоізомеразною, ендонуклеазною, РНКазною і протеїнкіназною активністю. При цьому АТР, dATP інгібують нуклеазну активність анти-ДНК sIgA, а олигодезоксирибонуклеотиди стимулюють протеїнкіназну активність цих антитіл. Анти-ДНК sIgA молозива породіль із різною ефективністю індукують загибель клітин ліній Namalwa, Jurkat, L1210 і L929.
У молоці клінічно здорових жінок-породіль і у сироватці крові хворих на розсіяний склероз виявлено антигістонові sIgA - і IgG-антитіла, які каталізують гідроліз лінкерного гістону Н1. Антигістонові IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз можуть інтерналізуватися у клітини ліній Jurkat і L929, а також стимулювати проліферацію Т-лімфоцитів лінії Jurkat.
У молоці клінічно здорових жінок-породіль і сироватці крові хворих на системний червоний вовчак виявлено sIgA - і IgG-антитіла, які володіють ліпідкіназною і протеїнкіназною активністю. Ліпіди співвиділяються із антитілами під час їх очистки, і фосфорилюются у складі імунних комплексів у присутності [-32P] ATP. Гель-фільтрація у буфері, який містить 5% діоксан, призводить до дисоціації комплексів ліпідів із антитілами і стимуляції протеїнкіназної активності імуноглобулінів.
Ключові слова: антитіла, каталітична активність, цитотоксичність, проліферація, молозиво, сироватка крові, розсіяний склероз.
АННОТАЦИЯ
Кит Ю.Я. Антитела молока и сыворотки крови человека: характеристика каталитической активности и влияние на рост и выживание клеток. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - Інститут биологии клетки НАН Украины, Львов, 2008.
Диссертация посвящена исследованию антигенной специфичности, каталитической активности антител сыворотки крови и молозива человека в норме и при некоторых аутоимунных заболеваниях, а также изучению влияния антител на рост и выживание клеток млекопитающих.
Установлено, что препараты иммуноглобулинов сыворотки крови некоторых больных рассеяным склерозом и молозива здоровых рожениц могут индуцировать гибель или стимулировать пролиферацию различных клеток-мишеней in vitro. Анализом нуклеосомной фрагментации ядерной ДНК и ДНК-комет индивидуальных клеток показано, что гибель клеток под действием иммуноглобулинов происходит путем апоптоза. Функциональная активность препаратов иммуноглобулинов относительно клеток млекопитающих могла быть следствием действия аутоантител определеной антигенной специфичности и каталитической активности. Иммуноферментным анализом установлено, что препараты антител двух из 25-ти обследованных рожениц содержат повышенный уровень анти-ДНК антител, а у 12-ти рожениц обнаружено повышенный уровень антигистоновых антител.
Используя афинную и ионообменную хроматографии, из сыворотки крови и молока человека очищены аутоантитела разных изотипов и проведен анализ их каталитической активности, а также влияния на рост и выживание клеток in vitro.
Установлено, что анти-ДНК sIgA молозива обладают РНКазной, ДНКазной и протеинкиназной активностью. АТР и dАТР ингибируют нуклеазную активность sIgA-абзимов, а дезоксирибоолигонуклеотиды стимулируют протеинкиназную активность этих антител.
Обнаружено, что анти-ДНК sIgA с разной эффективностью индуцируют гибель иммунокомпетентных клеток линий Namalwa, Jurkat и L1210 и фибробластов мыши линии L929.
На основании полученных результатов и анализа литературных данных предложена модель участия sIgA-абзимов во внутриклеточной нейтрализации вирусов в инфицированных эпителиоцитах слизистых оболочек.
Из молока клинически здоровых рожениц и из сыворотки крови больных рассеянным склерозом очищены антигистоновые sIgA - и IgG-антитела, обладающие способностью гидролизовать линкерный гистон Н1. Антигистоновые АТ обоих изотипов с более низкой эффективностью, чем гистон Н1, гидролизовали коровые гистоны, но были неактивны по отношению к лизоциму куриного яйца и сывороточного альбумина быка.
Установлено, что анти-гистоновые IgG сыворотки крови больных рассеянным склерозом могут стимулировать пролиферацию Т-клеток линии Jurkat. Прирост количества клеток составлял 37% при действии 70 мкг/мл антител на протяжении 72 ч. В то же время, анти-гистоновые sIgA молозива не влияли на пролиферацию Т-клеток линии Jurkat.
Обнаружено, что анти-гистоновые IgG сыворотки крови больных рассеянным склерозом могут проникать в клетки линий Jurkat и L929. Инкубация антител в течении 2 ч с клетками линии Jurkat и в течении 6 и 24 ч с клетками линии L929 приводила к значительному их накапливанию в цитоплазме клеток-мишеней. При таких же условиях инкубации не обнаружено интернализации анти-гистоновых sIgA-антител в клетки-мишени.
На основании полученных результатов предложен механизм промитогенной активности анти-гистоновых IgG-антител.
Из молока рожениц и сыворотки крови больных системной красной волчанкой очищены sIgA - и IgG-антитела со сродством к АТР-сефарозе, обладающих липидкиназной и протеинкиназной активностью. Субстраты липидкиназной активности выделяются совместно с антителами в процессе их очистки на протеин А-сефарозе, ДЕАЕ-фрактогеле, АТР-сефарозе и фосфорилируются в составе комплексов в присутствии [-32P] ATP. Наличие 32Р-меченных липидов в препаратах антител подтверджено хлороформ-метанольной экстракцией и ТСХ. Гель-фильтрация в присутствии 5% диоксана приводит к дисоциации комплексов липидов с антителами и стимуляции фосфорилирования их полипептидов.
Установлено, что протеинкиназной активностью помимо иммуноглобулинов может обладать также другой белок этого семейства - рецептор Т-хелперных клеток CD4. Инкубация рекомбинантного рецептора rsCD4 («Genintech», США) с [-32P] ATP в присутствии ионов Са2+ приводит к его фосфорилированию. В присутствии ионов Mg2+ rsCD4 обладает способностью к фосфорилированию казеина коровьего молока и некоторых белков плазмы крови человека.
Ключевые слова: антитела, каталитическая активность, цитотоксичность, пролиферация, молозиво, сыворотка крови, рассеянный склероз.
SUMMARY
Kit Yu. Ya. Antibodies of human milk and serum: characteristics of catalytic activity and action towards cell growth and survival. - Manuscript.
Thesis for the Doctor of Biological Sciences scientific degree in biology, speciality 03.00.11 - cytology, cell biology, histology. - Institute of Cell Biology of NAS of Ukraine, Lviv, 79005.
The Doctoral thesis is focused on the study of antigen specificity and catalytic activity of human serum and milk antibodies in healthy people and during some autoimmune pathologies, and also towards estimation of the antibodies' influence on growth and survival of the mammalian cells.
It has been shown that different preparations of immunoglobulins, obtained from collostrum of healthy woman and blood serum of some patients with multiple sclerosis can induce cells death in vitro or, in contrary, stimulate proliferation of the studied target cells. Functional activity of antibodies against cells could be linked with their antigen specificity and catalytic activity.
Anti-DNA sIgA, isolated from human colostrum possesses topoisomerase, ribonuclease, endonuclease and proteinkinase activities. ATP and dATP inhibit nuclease activities of anti-DNA sIgA, while oligodeoxinucleotides stimulate their activity. Anti-DNA sIgA isolated from human colostrum possessed different extent of cytotoxic activity towards Namalwa, Jurkat, L1210 and L929 cell lines.
We found anti-histone sIgA - and IgG-antibodies capable of catalyzing hydrolysis of linker histone H1 in the colostrums of healthy woman and blood serum of some patients with multiple sclerosis. Anti-histone IgG from blood serum of patients with multiple sclerosis were able to internalize into Jurkat and L929 cells and also to stimulate proliferation of Jurkat human T-cell line.
We also detected sIgA - and IgG-antibodies possessing lipid kinase and protein kinase activity in the collostrum of healthy woman and blood serum of some patients with system lupus erythrematosis. Lipids were co-purified with antibodies during their purification and were phosphorylated in those complexes in the presence of [-32P] ATP. Gel-filtration in dioxan containing buffer (5%) lead to dissociation of lipid-antibodies complexes and stimulation of protein kinase activity of immunoglobulins.
Keywords: antibodies, catalytic activity, cytotoxicity, proliferation, colostrum, blood serum, multiple sclerosis.
Подобные документы
Кореляційний аналіз показників лейкограми крові жінок з фізіологічним перебігом вагітності. Лабораторні показники вмісту еритроцитів та гемоглобіну, кількості формених елементів у сечі жінок при ускладненні вагітності різних строків пієлонефритом.
дипломная работа [1,1 M], добавлен 13.10.2015Дослідження ролі естрогенів і гестагенів у регуляції функції серцево-судинної системи. Проблеми особливостей гормонального статусу у жінок та його вплив на організм в цілому. Оцінка взаємозв’язку між станом регуляції серця та фазами менструального циклу.
статья [25,9 K], добавлен 31.08.2017Причини демографічної проблеми: зниження народжуваності, висока смертність, скорочення життя. Рекомендації щодо розробки моделей рекреаційної діяльності вагітних жінок. Суб'єкти курортної, лікувально-оздоровчої та культурно-дозвіллєвої діяльності.
курсовая работа [230,7 K], добавлен 15.10.2014Порівняльні аспекти клінічних і сидеропенічних симптомів при розвитку анемії вагітності у жінок з різним паритетом. Методика лікувально-профілактичних заходів у вагітних з гестаційною анемією на основі додаткового використання антигомотоксичної терапії.
автореферат [34,1 K], добавлен 10.04.2009Робота серця як головного органу серцево-cудинної системи. Система судин організму. Прояви порушень діяльності серця у кривій електроенцефалограми. Практичне дослідження електричної активності серця у юнаків, дівчат, жінок та чоловіків м. Сімферополь.
курсовая работа [117,4 K], добавлен 24.01.2013Зниження частоти і ступеню важкості анемії вагітних у жінок, які багато народжують, на основі вивчення клініко-функціональних особливостей, стану гемопоезу й обміну заліза залежно від числа пологів. Удосконалення лікувально-профілактичних заходів.
автореферат [37,0 K], добавлен 09.04.2009Клінічне, мікробіологічне та імунологічне обстеження хворих. Кандидоз жінок, сукупна роль особливостей мікробіоценозу різних біотопів організму, порушення загального і місцевого імунітету. Стоматологічний статус жінок у розвитку рецидивів захворювання.
автореферат [40,3 K], добавлен 29.03.2009Вивчення стану питання впливу вірусів на перебіг вагітності жінок у роботах вітчизняних та зарубіжних учених. Токсоплазмоз та краснуха як результат впливу Torch-інфекцій на організм вагітних жінок. Аналіз способів лікування та попередження захворювань.
курсовая работа [64,9 K], добавлен 21.03.2014Польза и необходимость грудного вскармливания младенца. Сравнительный состав женского молока и молока животного происхождения. Особенности молозива. Содержание витаминов. Сцеживание грудного молока. Принципы грудного вскармливания. Молокогонные средства.
презентация [203,3 K], добавлен 01.02.2017Види спиртних напоїв, ступені сп'яніння в залежності від ужитої дози алкоголю. Особливості алкогольного ураження травної, серцево-судинної, видільної і нервової системи, органів дихання, імунного захисту організму. Вплив етанолу на ембріогенез людини.
курсовая работа [47,0 K], добавлен 08.11.2010
