Фармакогностическое изучение дудника обыкновенного (Angelica archangelica L.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПЯТИГОРСКИЙ ФИЛИАЛ

ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

«ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДУДНИКА ОБЫКНОВЕННОГО (ANGELICA ARCHANGELICA L.)»

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

На правах рукописи

Григорян Элина Рудольфовна

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

доцент Т.В. Орловская

Пятигорск - 2012г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения почти 80 % населения нашей планеты предпочитают использовать для лечения препараты растительного происхождения [89], поэтому по-прежнему актуальным является исследование и разработка на их основе лекарственных средств.

Наряду с высоким и оправданным интересом исследователей к поиску принципиально новых источников фитопрепаратов заслуживают не меньшего внимания лекарственные растения, уже давно применяемые в медицине, но вместе с тем, имеющие не полностью раскрытый фармакотерапевтический потенциал. Научные сведения о многих из них, в частности, об их химическом составе, фармакологических свойствах были получены десятки лет назад в рамках, имевшихся в то время возможностей науки, и с тех пор практически не пополнялись.

По данным мировой статистики, около 70 % населения Земли страдает патологиями желчевыводящих путей и заболеваниями мочеполовой системы. Большинство препаратов, использующихся в России при данной патологии, имеют синтетическое происхождение. Препараты на основе растительного сырья в большинстве своем выпускаются зарубежными производителями и представлены на отечественном фармацевтическом рынке биологически активными добавками (БАД). Однако такой путь на наш взгляд является нерациональным, так как в этом случае приходиться применять БАДы практически постоянно. Кроме того, использование БАД не всегда эффективно при уже возникшей патологии. В то время как лекарственные препараты такого типа стандартизированы по биологически активным веществам, что повышает их качество и чем они выгодно отличаются от БАДов.

Особо актуальным представляется поиск лекарственных средств с направленным фармакологическим действием, например, диуретической и антимикробной активностями в сочетании с антиоксидантным эффектом, которые связаны с содержанием полифенольного комплекса.

В этой связи наше внимание привлек интерес дудник обыкновенный (Angelica archangelica L.) из сем. сельдерейные (Apiaceae). Сырье дудника обыкновенного включено в ряд зарубежных фармакопей. Несмотря на широкую популярность за рубежом, в нашей стране это растение известно лишь в народной медицине как эффективное средство для лечения кашля.

Ограниченность производимой из данного сырья продукции объясняется не только недостаточностью химических исследований, но и отсутствием современной нормативной документации.

А в связи с тем, что в целях рационального использования природного сырья основной акцент делается на разработку и внедрение новых конкурентоспособных, малоотходных и безопасных технологий, актуальным является изучение различных комплексов биологически активных соединений (БАС).

Особенно актуальна на сегодняшний день проблема преодоления зависимости отечественной фармацевтической промышленности от импортного сырья и лекарственных препаратов. Правительством России поставлена задача развития собственных возможностей для создания эффективных отечественных лекарственных средств.

Таким образом, комплексное исследование фитохимического состава, совершенствование нормирования качества, в зависимости от пути использования сырья и группы БАС, определяющих фармакологическую активность, является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось фармакогностическое изучение дудника обыкновенного корневищ и корней, разработка нормативной документации (НД) на сырье, как потенциального источника получения БАС, обладающих желчегонной и мочегонной активностью.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучение возможности культивирования дикорастущего и сортового дудника обыкновенного в условиях Кавказских Минеральных Вод.

2. Провести фитохимический анализ подземной части дудника обыкновенного (полифенольных соединений, углеводов, эфирного масла, аминокислот, макро- и микроэлементов).

3. Установить морфолого-анатомические диагностические признаки и товароведческие показатели сырья.

4. Определить острую токсичность и провести предварительное изучение специфической биологической активности различных фитосубстанций.

5. Разработать фармакопейную статью (проект ФС) «Дудника обыкновенного корневища и корни» и инструкцию по сбору и сушке.

Научная новизна работы. Проведенные интродукционные исследования в условиях ботанического сада Пятигорской ГФА (КМВ), позволили прогнозировать выращивание этого вида и особенности интродукции в условиях культуры на КМВ.

Изучен химический состав эфирного масла подземных органов дудника обыкновенного, произрастающего на Северном Кавказе. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров идентифицирован 21 компонент, из них 3 ранее не описанных для этого вида:

Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) идентифицированы 24 соединения, из них 7 впервые для данного вида:

v коричные кислоты: цикориевая, феруловая;

v фенолокислоты: галловая, эллаговая;

v кумарины: дикумарин;

v дубильные вещества: эпикатехин, танин.

Впервые изучен полисахаридный комплекс. Обнаружены: водорастворимые полисахариды - 3,48 %; пектиновые вещества - 6,42 %; и гемицеллюлозы - 10,25 %. Установлено, что моносахаридный состав углеводов представлен глюкозой, рамнозой, ксилозой, арабинозой, маннозой, галактозой. Содержание углеводов в сырье в пересчете на галактуроновую кислоту составляет 6,49 %.

Установлен аминокислотный состав, которые представлен 15 аминокислотами, из которых 9 являются незаменимыми, основной по содержанию является аспарагиновая.

Изучен макро- и микроэлементный состав, представленный 28 элементами, из которых доминирующими являются: калиий, кальций, магний, марганец, натрий, железо.

Проведена стандартизация сырья дудника обыкновенного с учетом современных требований предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Впервые предложены методика оценки качества корневищ и корней дудника обыкновенного, достоверно устанавливающая содержание ангелицина и хлорогеновой кислоты спектрофотометрическим методом.

Проведены фармакологические скрининговые исследования стандартизированных фитосубстанций на основе исследуемого сырья.

Практическая значимость. Предложен новый вид ЛРС для включения в Государственную фармакопею России XII издания.

Разработан унифицированный подход к стандартизации корневищ и корней дудника обыкновенного в соответствии с современными требованиями и группой действующих БАС, которые включены в нормативную документацию (НД).

Разработана методика количественного определения суммы кумаринов (дифференциальная спектрофотометрия), а также ТСХ-методики качественного определения ангелицина в сырье дудника обыкновенного.

Показана возможность использования исследуемого вида растительного сырья в комплексных малоотходных технологиях получения современных лекарственных фитопрепаратов.

Выявлена возможность использования отечественного сырья дудника обыкновенного для получения фитопрепаратов обладающих желчегонной, диуретической, спазмолитической, антибактериальной и антиоксидантной активностью.

Внедрение результатов исследования. На основании проведенных исследований разработаны НД:

1. Проект ФС «Дудника обыкновенного корневища и корни».

2. Инструкция по сбору и сушке дудника обыкновенного корневища и корни.

По материалам исследований составлены информационные письма: «Морфолого-анатомическое изучение дудника обыкновенного» и «Методика количественного определения суммы кумаринов в пересчете на ангелицин в корневищах и корнях дудника обыкновенного (акты внедрения……….в учебный процесс кафедры фармакогнозии с курсом ботаники ГБОУ ВПО Курского государственного медицинского университета).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты интродукционных исследований дудника обыкновенного на территории КМВ.

2. Результаты изучения химического состава подземных органов дудника обыкновенного физико-химическими методами.

3. Показатели подлинности и нормы качества дудника обыкновенного корневища и корни, необходимые для разработки проекта нормативной документации.

4. Результаты изучения фармакологической активности сырья дудника обыкновенного.

Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы доложены на 65 и 66-ой региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2010, 2011). Работа по изучению дудника обыкновенного была представлена и прошла в финал Конкурса исследовательских проектов и научно-технических разработок молодых изобретателей в рамках реализации социально значимого Проекта «Золотой век инноваций» (Ставрополь, 2012).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцразвития России (номер государственной регистрации 01200112164) и соответствует проблеме «Фармация» секция № 38 Ученого совета МЗСР РФ.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДУДНИКА ОБЫКНОВЕННОГО (ANGELICA ARCHANGELICA L.)

Головой качнул седой

Дядя Дягиль над водой

Над веселым тростником,

Над зеленым лозняком.

Голова - как белый шар.

Дядя Дягиль наш не стар!

Он еще позеленеет,

Пожелтеет, потемнеет,

Станет тощим и сухим

И под ветерком лихим

Склонит голову... Тогда

Будет он не дядя, А дуда!

1.1 Ботаническая характеристика рода Angelica

Согласно системе А.Л. Тахтаджяна род Дудник (Angelica) принадлежит к отделу Magnoliophyta, классу Magnoliopsida, подклассу Rosidae, надпорядку Cornanae, порядку Apiales, подпорядку Apiineae, семейству Apiaceae, подсемейству Apioideae, трибе Peucedaneae [125].

В настоящее время существуют различные точки зрения относительно систематического положения вида Angelica archangelica. Некоторые авторы этот и некоторые другие виды выделяют в род Archangelica Wolf., поэтому существует ряд синонимов Archangelica officinalis (Moench) Hoffm. (1814), Angelica officinalis Moench (1794) [58, 108, 129]. Однако в подавляющем большинстве современных изданий, а также в международных базах данных этот вид рассматривается согласно Линнею - в составе рода Angelica - и его правильным названием считается Angelica archangelica L. [16, 76, 84, 20, 125]. Название происходит от латинского angelicus - ангельский, от греческого archaios - ранний, старший [150].

Род Дудник включает 50 видов, распространенных в прохладных областях Северного полушария [16]. Во флоре России и странах СНГ насчитывается 31 вид, из них 16 на Дальнем Востоке, 8 в Восточной Сибири, 6 на Кавказе, 4 в Западной Сибири; 2 в Восточной Европе, 5 в Средней Азии.

В трибу Peucedaneae кроме рода Angelica входят еще 18 родов, виды многих из которых хорошо известны как пищевые, лекарственные и ядовитые растения: Levisticum (любисток), Ferula (ферула), Peucedanum (горичник), Anethum (укроп) и др. [125].

В мировой медицинской практике кроме дудника обыкновенного находят применение и другие виды: в Америке - д. темно-пурпурный (A. atropurpurea L.), в китайской медицине используют д. даурский (A. dahurica (Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. ex Franch. et Savat) и д. китайский (A. sinensis Diels.) [101], в Японии д. остроплодный (A. acutiloba (S. et Z.) Kitagawa) [22], д. китайский разрешен для применения также в Америке.

Дудник обыкновенный (рис. 1) - двулетнее или многолетнее травянистое растение высотой до 2,5 м. является самым высоким ароматическим травянистым растением в сем. сельдерейных.

Листья с большими вздутыми влагалищами, дважды-, трижды перистые, доли крупные, яйцевидные или продолговатые, крупно-пильчатые. Соцветие - шаровидный сложный зонтик.

Цветки зеленовато-желтого или зеленовато-белого цвета. Плод - широкоэллиптический вислоплодник с двумя крыловидно-расширенными краевыми ребрами.

Ареал д. обыкновенного обширен и простирается от Скандинавии, Средней Европы, Балкан до Западной Сибири. Распространен в Европейской части России, на Северном Кавказе, в Западной Сибири, в Беларуси, Украине.

Экологически и фитоценотически д. обыкновенный приурочен к луговым и лесным сообществам, часто встречается в негустых лиственных (березово-ольховых, ольховых, осиновых) и елово-лиственных приручейных лесах, среди кустарников, на заливных лугах, старицах, возле речек и озер, а также по берегам низинных болот, в заболоченных лощинах и тальниках, где подолгу держатся талые воды, оставляющие плотный слой ила (до 2 см) или на песчаных почвах […..].

По внешнему виду дудник обыкновенный чрезвычайно похож на очень распространенное дикорастущее растение дудник лесной (Angelica silvestris L.), который не применяется в научной медицине.

Дудник лесной (рис. 2) - двулетнее травянистое растение с толстым, коротким, крепким корневищем и прямым, толстым, голым стеблем, вверху гранистым, зеленовато-сизым с красными перехватами на сочленениях листьев. Прикорневые листья сложные, дважды-, триждыперистые, верхние со стеблеобъемлющим влагалищем. Цветки белые, мелкие, иногда бледно-розовые, собраны в сложные, щитковидные зонтики, диаметром 10-16 см, с 18-30 лучами. Плод - широкоовальная двусемянка, сжатая со спинки, с выдающимися срединными ребрами, краевые ребра крыловидные. Стебли и корневища обладают своеобразным запахом. Цветет в июне-июле. Плоды созревают в августе-сентябре.

От д. обыкновенного его можно отличить по круглым, с верхней стороны слегка желобчатым черешкам листьев, ребристым с сизоватым налетом стеблям и деревянистым со слабым неприятным запахом корнями и корневищами [152].

Дудник лесной распространен в Европейской части России (все районы, кроме Причерноморского), в Западной Сибири (все районы), в Восточной Сибири (все районы, Даурский, запад), в Украине, Беларуси, в Молдове. Растет в долинах рек широколиственных, мелколиственных, смешанных лесах, на влажных лугах, одиночно.

Дудник даурский (рис. 3) - многолетнее травянистое растение высотой до 3 м с утолщенным корневищем и разветвленными корнями. Стебель часто окрашен в фиолетовый цвет внутри полый, тонко-ребристый, внизу голый, над соцветием коротко опушенный. Зонтиков в соцветии 20-40. Цветки мелкие, белые.

Д. даурский произрастает в Северном Китае, Корее, Японии, Вьетнаме, а также в России - в Приморском крае и Восточной Сибири. Растет по берегам рек и ручьев.

Дудник китайский (рис. 4) - однолетнее, травянистое растение с приятным запахом, до 1 м высотой. Стебель гладкий, красноватый со светлыми бороздками. Нижние листья перистые, средние тоже перистые, сегменты листа овальные с зубчатым краем. Черешок 3-11 с длины. Соцветий - зонтиков образуется 10-14 на верхушке растения. Цветки белые, 5-лепестковые, гладкие. Плод приплюснутый, квадратно-эллипитический, основание сердцевидное, верхушка округлая.

Д. китайский произрастает и культивируется в Северном Китае.

Дудник темно-пурпурный (рис. 5) - растение до 180 см высотой, с прямостоячим темно-фиолетовым, гладким, полым стеблем. Листья разделены на три части, каждая из которых снова делится на три или пять сегментов. Зеленоватые цветки собраны в сложные зонтики. Общая ширина нижнего листа может быть до 60 см. Все листья имеют плоский, изогнутый внутрь черешок, который удерживает воду. Свежий корень считается ядовитым.

Произрастает в Северной Америке.

Дудник остроплодный (рис. 6) - многолетник 30-100 см высотой с желто-коричневым корнем, очень ароматным. Прикорневые и нижние листья длинночерешковые. Листовые пластинки треугольно-овальные и 1-2-тройчато-перистые, голые, перья короткочерешковые, 3-дольчатые, сегменты ланцетные, по краям несимметрично остропильчатые, заостренные или острые на конце. Зонтики 3-цветковые. Цветки белые.

Плоды сужено-продолговатые, до 0,5 см длиной.

Распространен в Японии, Китае. Культивируется в Японии (пров. Ямаширо и др.) [108].

Таким образом, из всех видов, которые применяются в научной медицине и имеют наибольший ареал распространения, в том числе и на территории России является дудник обыкновенный.

1.2 Химический состав дудника обыкновенного

Химический состав вегетативных органов дудника обыкновенного представлен разнообразными веществами (табл. 1). Из литературных данных видно, что наиболее богатыми по содержанию различных групп соединений являются корни и плоды.

Таблица 1 - Химические соединения, выделенные из разных органов дудника обыкновенного

Орган	Группа соединений [182,245].
Корни	Моно- и сесквитерпеноиды Стероиды Фенолкарбоновые кислоты Фталиды Кумарины Органические кислоты Макроциклические лактоны Азотсодержащие соединения Жирные кислоты и их производные Эфирное масло до 1,5 %
Стебли	Эфирное масло 0,33-0,4%
Листья	Кумарины
Плоды	Моно- и сесквитерпеноиды Бензол и его производные Кумарины Органические кислоты Жирные кислоты и их производные Жирное масло

К наиболее изученным группам в химическом отношении относятся эфирные масла, кумарины, жирные кислоты и их производные. Однако большинство исследований проводилось в период с 1842 по 1996 г. Исследования, проводимые в последние десятилетия, касались в большинстве только эфирного масла и кумаринов [108].

Сведения, полученные в ходе изучения эфирного масла образцов сырья, заготовленных в различных регионах, характеризуются большой вариабельностью, как по количеству компонентов, так и по доминирующим соединениям (табл. 2).

Таблица 2 - Сравнительная оценка компонентов эфирного масла различных образцов сырья дудника обыкновенного [147, 148]

Регион заготовки сырья	Кемеровская область	Латвия	Италия	Европейская часть РФ
Количество компонентов	26	10	11	3
Доминирующие компоненты	лимонен (30,47 %) a-пинен (23,6%)	лимонен (11,53 %) a-пинен (25,25%) ?-фелландрен (9,58 %)	a-пинен (23,90%) карен (3,40 %)	a-пинен (31,00%) ?-фелландрен (28,00 %) a-фелландрен (14,00 %)

Содержание эфирного масла также неравномерно распределено в растении, так в подземных органах накапливается от 0,25 до 1,5 %, стебли содержат 0,33- 0,4 %, в черешках листьев - 0,16-0,48 %, в пластинках листьев от 0,01 до 0,2 % [229 ].

Всего в эфирном масле идентифицировано 118 компонентов [197, …..]. В большинстве доминирующей фракцией эфирного масла, являются монотерпеновые соединения (80-90 %). Основными компонентами являются: a и ?-фелландрен, лимонен, мирцен, камфен, цимол, линалоол и т.д. Сесквитерпены представлены ?-бисаболеном, бисабололом, ?-кариофилленом; бициклические терпеновые спирты - борнеолом, цинеолом, пиненом.

Из эфирного масла корней дудника обыкновенного выделены производные фталевой кислоты - лигустилид (0,8-1,0 %), (Z)-6,7,-эпоксилигус-тилид, ангелицид, бутилфталид [272].

В последнее десятилетие появились сведения об изучении макроциклических лактонов [255, 256], обнаруженные в эфирном масле и обуславливающие специфический аромат растения - 0,58-0,81 % тридеканолида, 0,87 % пентадеканолида (тибетолида) [272, 237].

Во всех частях дудника обыкновенного содержатся кумарины: умбеллиферон, умбеллипренин, острутол, остол, остенол, кантотоксин, ксантотоксол, бергаптен, императорин, изоимператорин, оксипейцеданин, оксипейцеданингидрат, изопимпинеллин, феллоптерин, ангелат, изобиаангелицина. В корнях также идентифицированы: ангелицин, псорален, архицин, архангелицин, феллоптерин, колумбианадин, архангелин, аптерин, оросенол, 5-метоксигеракленол, сенеционат геракленона, изоварерат геракленола, 2'-ангелоил-3'-изовалерилвагинат и др. [108, 194, 217, 177, 199].

Из фенолкарбоновых кислот в корнях найдены кофейная, хлорогеновая и протокатеховая кислоты [171, 208].

Представляют интерес в корнях и органические кислоты: яблочная, ангеликовая, валериановая, уксусная, винная, аконитовая, лимонная, щавелевая и хинная [169].

Из жирных кислот в корнях идентифицированы: бегеновая, пальмитиновая, пальмитолеиновая, лауриновая, миристиновая, петрозелиновая, гидроксимиристиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, лауриновая, арахиновая, эйкозеновая, тридекановая, пентадекановая [255].

Фитостеролы представлены ?-ситостеролом (?-ситостерин, 22, 23-дигидростигмастерол, a-дигидрофукостерол) [108, 199].

1.3 Использование в народной медицине и быту

Лечебные свойства дудника обыкновенного были известны очень давно. В народной медицине разных стран его части (корень, листья) употреблялись по-разному. Первое упоминание об использовании дудника обыкновенного как пряного растения относится к XV столетию.

Еще в средние века было известно тонизирующее свойство дудника обыкновенного то, что побудило монахов Картезианского и Бенедиктинского орденов включить его в составленную ими секретную рецептуру приготовления знаменитых ликеров «Шартрез» и «Бенедиктин». И по сей день приготовление этих старинных французских ликеров невозможно без настойки корней дудника.

В Норвегии, Швеции, Финляндии, Исландии, Гренландии надземная часть дудника считается одним из лучших овощей; в Бельгии, Франции, Румынии выращивается в культуре для получения эфирного масла; в Швейцарии из него получают оригинальный напиток, добавляя в воду после брожения сахар и порошок из корней [22].

Дудник обыкновенный известен также как кормовое и медоносное растение [17].

Корни, высушенные и измельченные в порошок, добавляют в тесто при выпечке хлебобулочных изделий и пряников [69].

Измельченные корни, свежие побеги и листья можно использовать как приправу для ароматизации вин, супов, салатов, мясных соусов, рыбных и горячих овощных блюд [22].

Семенами ароматизируют водку, соусы и рыбные консервы [116]. Дудник введен в состав пяти отечественных рецептур для производства рыбных консервов [140].

Эфирное масло из плодов и семян, свежие и сухие цветущие побеги - для ароматизации вин и ликеров и в качестве антибактериального и фунгицидного компонента [169].

В Англии цукаты из дудника предлагают в аптеках: как лакомство и как лекарство от кашля [45].

В Швейцарии сухой порошок корня дудника заваривают как чай [104].

Эфирное масло из корневищ и корней, имеющее запах мускуса и амбры используется в парфюмерно-косметическом производстве.

В русских медицинских рукописях XVII века имеются указания, что корень дудника обыкновенного использовался при лечении рака молочной железы [22].

На Украине и в России дудник применяли в народной медицине для улучшения пищеварения, секреторной и моторной функции кишечника в виде настойки.

Дудник обыкновенный обладает отхаркивающим, мочегонным, противовоспалительным, потогонным, спазмолитическим и антимикробным действием, а также усиливает секреторную и моторную функцию кишечника, снижает бродильные процессы. Кроме того, отвар и настой корней и корневищ дудника применяют при истощении нервной системы, острой и хронической невралгии, ревматизме, подагре, люмбаго, при остром и хроническом ларингите, бронхите, бронхиальной астме, хроническом гастрите с секреторной недостаточностью, хроническом колите, гепатите.

Свежим соком дудника можно лечить воспаление среднего уха, он также устраняет зубную боль.

В китайской медицине дудник используют для борьбы с бесплодием, для профилактики женских заболеваний, укрепления духа. В Китае считают, что по своим лекарственным качествам дудник уступает только женьшеню.

Трава используется как противоглистное средство, а плоды - для приготовления «ангеликовой воды», применяющейся как противосудорожное и желудочное средство [7].

1.4 Использование в экспериментальной и официнальной медицине

Представители рода Angelica применяются в медицине многих стран.

Наиболее часто применяют галеновые лекарственные формы дудника, оказывающие разностороннее фармакологическое действие. В эксперименте экстракт корней обладает гепатопротективным [218], противовоспалительным [54], и успокаивающим эффектом, аналогичном действию препаратов валерианы [40], экстракт травы - противоязвенным.

Водно-спиртовой экстракт этого растения обладает антибактериальными свойствами [151].

Экстракты дудника обыкновенного являются основой средств для лечения заболеваний половой сферы [155], невралгии, артрита [153], грибковых заболеваний [154].

Благодаря способности накапливать железо, витамин В12 и родственные ему кобаламины дудник используют для лечения анемии [162].

На сердечнососудистую и нервную системы растение оказывает тонизирующее действие, обладает Р-витаминной активностью [226].

Вначале бесцветное, а затем приобретающее зеленый оттенок эфирное масло дудника (Oleum Angelcae) используют для наружных втираний, так же как и сложный спирт дудника (Spiritus Angelicae compositus) состоящий из ангеликового эфирного масла, камфoры и спирта. Оба эти препарата считаются противоревматическими средствами [19]. Показано также, что эфирное масло снижает спазмы различных органов [151].

Бициклические терпеновые спирты, представленные в корнях и плодах дудника обыкновенного, оказывают противоаритмическое, болеутоляющее, противовоспалительное, жаропонижающее [160], отхаркивающее [199], дезинфицирующее, болеутоляющее, антисептическое действие [177].

Бициклические сесквитерпеноиды (a- и ?-пинены) обладают местно-раздражающей, антисептической, отхаркивающей и диуретической активностью [141 ]. Пинены эфирного масла дудника обыкновенного оказывают также мягкий седативный эффект [143.].

Бисаболол обладает противовоспалительным, противоопухолевым, бактерицидным, фунгицидным свойствами [198, 208].

Установлены антибактериальные и антифунгальные свойства эфирного масла [175].

Валериановая кислота оказывает спазмолитическое и сильное транквилизирующее действие, в то время как ангеликовая кислота обладает седативным эффектом [292].

Содержащиеся в эфирном масле полиацетиленовые соединения - фалькаринол, фалькариндиол, обладают высокой антибиотической, противоопухолевой, противовоспалительной, антиагрегатной и антитуберкулезной активностью [288, 297, 258, 269].

Экстракт надземной части проявляет противоопухолевую активность [278], экстракт корней - цитотоксическую в отношении лимфобластоидных клеток [121], эфирное масло - в отношении клеток линии PANC-1 (рак поджелудочной железы) и Crl - рак груди [278], спиртовой экстракт плодов - в отношении клеток лейкемии [178].

Изучено действие некоторых кумаринов, спектр которых чрезвычайно разнообразен. Так императорин и ксантотоксин ингибируют активность ацетилхолинэстеразы [278] и наряду с экстрактом из листьев проявляют антипролиферативную активность [276], императорин дозозависимо обладает антиконвульсивным действием [242], императорин и изобергаптен - антифунгальным [159]. Исследованы свойства содержащегося в корнях архангелицина: в экспериментах на животных это вещество при пероральном или внутрибрюшинном введении оказывает противосудорожное, расслабляющее мышцы и успокаивающее действие [151].

Бергаптен, оксипеуцеданин и ксантоксол используют для лечения лейкодермии [52, 96], и псориаза [199].

Спазмолитической активностью обладают бергаптен, ксантоксин, остол [199], изопимпинеллин, императорин [96], изоимператорин [177], ксантоксол, умбеллиферон [1], пимпинеллин, оксипеудцеданин [108] и др.

У остола выявлена антипролиферативная активность [166], ороселона - гипотензивная [108], умбеллиферона - фунгицидная, бактрицидная и противовоспалительная [1].

Фурокумарины проявляют фототоксическую [157], а водный и спиртовый экстракты корней - антимутагенную [111].

Кроме того, среди прочих соединений в тканях растения обнаружен гормон мелатонин, оказывающий значительный эффект на функции мозга человека [133].

В литературе имеются сведения о регуляции жирового обмена [225], и ингибирования меланиногенеза, что позволяет использовать их в косметике.

Желчегонная и антиоксидантная активности по-видимому связаны с присутствием фенольных кислот [208,156].

Фитостеролы, содержащиеся в корнях дудника оказывают эстрогенное, антисклеротическое, противоопухолевое, фунгицидное, бактериостатическое действие [199].

Полисахариды различных видов рода Дудник обладают иммуностимулирующей активностью [222, 189].

Сырье дудника обыкновенного включено в фармакопеи Европейскую [204], Великобритании [184], Германии и Австрии [201], Британскую травяную [183], также было включено в отечественные фармакопеи I-VI изданий.

Согласно Европейской и Британской фармакопее содержание эфирного масла должно быть не менее 0,2 % [204], в Германии не менее 0,25 %, в Австрии не менее 0,30 %. Однако, как показано выше, как компонентный состав эфирного масла, так и его количество сильно варьируют в зависимости от места произрастания дудника обыкновенного, поэтому можно предположить, что определение подлинности данного сырья только по показателю «эфирное масло» не имеет объективности.

Европейская и Британская Фармакопеи регламентируют качество сырья методом ТСХ-анализа метанольного извлечения. Требования фармакопей сводятся к обнаружению на хроматограмме зон абсорбции проявляющихся в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 и 365 нм, в качестве стандартных образцов используют кумарин и эвгенол.

Британская травяная фармакопея и Германский кодекс регламентируют содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 30 %.

Опираясь на литературные данные, можно констатировать тот факт, что наиболее активнодействующими соединениями в подземных органах дудника обыкновенного, является сумма кумаринов. Поэтому будет целесообразнее наряду с количественным содержанием эфирного масла ввести в НД показатель идентификации и содержания именно этой группы веществ. В связи с этим считаем, что показатели качества, приведенные в зарубежных фармакопеях, нуждаются в критическом пересмотре.

Ряд других зарубежных фармакопей регламентирует качество других видов дудника, в частности, фармакопея Японии - дудника остроплодного по содержанию экстрактивных веществ, фармакопея Китая - д. даурского и д. китайского методом ВЭЖХ по содержанию императорина и остола соответственно.

В России в настоящее время сырье стандартизируется в соответствии с ГОСТ 21569-76 для использования в пищевой промышленности и поставки на экспорт по параметрам: внешний вид, размеры, общие числовые показатели и наличия примесей. По всей видимости, для унификации химической стандартизации сырья необходимо выяснить и четкие пути его использования [ГОСТ].

Дудник обыкновенный составляет основу таких препаратов и БАД как «Болюсы Хуато», «Гастритол», «КарвоминR», «ВетримаринR», «Антиоксифит», «Ламинарина», «Артемида», «Топ» [95].

1.5 Ареал распространения, биологические особенности и состояние агрокультуры дудника обыкновенного

Дудник обыкновенный распространен в Европейской части России - главным образом, в северных и средних районах (северная граница проходит по побережью Баренцева моря, южная - по линии Саратов-Кишинев, на Кавказе, в Западной Сибири) [61].

Предпочитает богатые почвы со слабокислой или нейтральной реакцией, но заходит также на слабо- и среднезасоленные [149].

Дудник обыкновенный светолюбивое растение, но теневынослив.

Хорошо изучены природные ареалы дудника обыкновенного в Башкортостане [78, 77]. Установлены биологический и эксплуатационные запасы данного растения, последний составляет около 2 т в год. C одного же растения дудника можно заготовить от 57,5 до 248,4 г сырых корневищ и корней [73]. В Украине урожайность подземной части дикорастущих растений составляет 0,15-1,29 кг/м2, надземной - 0,26-2,34 кг/м2 [75]. У дудника высокая семенная продуктивность - 2982-5218 шт/м2 [75].

Онтогенез представителей рода Дудник детально проанализирован в работах Т.А. Лысенко и Н.В. Масловой [75, 77, 78]. Ими было показано, что в природе ювенильное состояние длится до наступления следующего года, в культуре 1,5 месяца. В природе имматурное состояние длится от 2-3 месяцев до 1 года, в культуре от конца лета (середина августа) первого года жизни до весны следующего года. Виргинильное состояние в природе может растянуться до 10-20 лет, в культуре до 2-3 лет. Поэтому дудник обыкновенный экономически целесообразнее вводить в культуру.

Учитывая, что растения рода Angelica официнальны во многих странах дудник обыкновенный широко культивируется в странах Западной Европы (Германия, Венгрия, Польша, Нидерланды, Чехия, Словакия и др.), США, а также в России для нужд фармацевтической, парфюмерной и ликероводочной промышленности [101].

В настоящее время ведется активная селекционная работа с культурой. В Германии проводят отбор форм с повышенным содержанием эфирного масла [181, 179, 260], в Южной Корее получают 6,5 т дудника с площади 2688 га из которых 3,4 т/га Angelica gigas сорта «Manhoodanggui» [238, 264].

В России проведены интродукционные исследования по введению дудника обыкновенного в культуру в Башкортостане [61]. В результате выявлено, что наиболее оптимальной является холодовая стратификация в течение 9 месяцев с посевом в июле-августе, непосредственно после созревания семян. При этом всхожесть составляет 83 %. Более поздние сроки посева вызывают снижение всхожести семян до 25-27 %. Приведенные данные показали, что культуру дудника можно выращивать в лесостепной и степной зонах Предуралья., масса подземных органов одного растения составляет 784-852 г. Продуктивность семян 217 г или 48311 шт. Сравнительное изучение биохимического состава корневищ и корней дикорастущих и культивируемых растений дудника обыкновенного показало, что при интродукции содержание биологически активных соединений существенно не изменяется [62, 63, 60].

Размножают дудник обыкновенный вегетативно: делением куста, отростками, корневищами, отводками. Делают это ранней весной или в августе-сентябре, оставляя расстояние между рядами не менее 40 см. После появления всходов проводят прополку, а через 3-4 недели - прореживание.

Дудник очень легко вырастить из семян, но только свежесобранными зрелыми семенами (их можно высевать сразу после сбора - в июле-августе). Семена высевают на глубину 2-3 см и укрывают слоем земли. Необходимо учесть, что семена быстро теряют всхожесть (8 месяцев) [107].

Неиспользованные семена необходимо хранить в морозильной камере, чтобы предотвратить на время прорастание.

В течение первого года жизни у растения развивается лишь небольшая приземистая листовая розетка, на второй год растение зацветает. Цветет в июне - августе, плоды созревают в июле - сентябре.

Корни дудника в году заготавливают два раза: ранней весной и осенью. Выкопанные корни отряхивают от земли, моют в холодной воде, разрезают поперек. Перерабатывая корень, надо помнить, что у некоторых людей с чувствительной кожей в результате соприкосновения с растительной тканью могут на руках возникать волдыри, особенно в летнее время, при солнечном свете (появляются фотодерматозы) [128].

Сырье сушат под навесом, на чердаке или в сушилке при температуре 35- 400 С, раскладывая тонким слоем. Высушенные корни имеют красновато-сероватый цвет и пряный, специфический аромат. Их следует сохранять с большой предосторожностью, ввиду их способности сильно впитывать влагу из воздуха и подвергаться порче вредителями жучками и их личинками. Помещения для хранения корневищ должно быть вполне сухое, хорошо проветриваемое, причем вблизи штабелей следует разложить для поглощения избыточной влаги негашеную известь.

Дудник чаще всего является двулетником, но зачастую начинает цвести только на третье лето. После цветения и осеменения он погибает. Если дудник выращивать ради корней, то для того, чтобы добиться их более крупного роста необходимо по мере появления головок цветка обрезать их. На второй год дудник пускает боковые ростки, которые продолжают жить даже после гибели материнского растения. Если позволить дуднику нормально цвести, то, опав, семена произведут осеменение самостоятельно.

ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Среди лекарственных видов на территории России наибольший ареал распространения имеет дудник обыкновенный.

2. Очень широко распространен близкородственный вид - дудник лесной, не используемый в научной медицине, который может являться органической примесью д. обыкновенного.

3. Химический состав вегетативных органов дудника обыкновенного представлен разнообразными веществами, наиболее богатыми по содержанию различных групп соединений являются корни и плоды.

4. В химическом отношении наиболее изученной группой являются кумарины и эфирное масло. Другие группы БАС изучены недостаточно.

5. Содержание эфирного масла в сырье дудника обыкновенного зависит от многих факторов: места произрастания, фазы развития растения, источника растительного материала (культивированный или дикорастущий), органа растения взятого на анализ и т.п.

6. Дудник обыкновенный издавна известен в народной медицине как отхаркивающее, противовоспалительное, желчегонное, мочегонное и жаропонижающее средство.

7. Установленная фармакологическая активность позволяет использовать д. обыкновенный для лечения актуальных нозологических форм заболеваний, в том числе, социально значимых, таких как злокачественные новообразования, инфекционные заболевания и др.

8. Корни дудника обыкновенного включены в ряд зарубежных фармакопей в частности в Европейскую, Фармакопею Китая и Британскую травяную фармакопею.

9. Существующая нормативная документация не предусматривает оценку по содержанию действующих веществ. Поэтому возникает необходимость в разработке новых подходов к стандартизации сырья и созданию современной нормативной документации.

10. Хорошо изучены приемы возделывания, интродукции, агротехники дудника обыкновенного, что позволяет сделать вывод о достаточной сырьевой базе данного растительного объекта.

11. Применение представителей рода Angelica и ассортимент завозимых из-за рубежа препаратов свидетельствует о необходимости восстановления A. archangelica в статусе официнального растения.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

В качестве объектов исследования были использованы высушенные (в соответствии с требованиями НД, предъявляемыми к сушке эфирномасличных растений) и измельченные образцы растительного сырья - корневища с корнями дудника обыкновенного (Rhizomata cum radicibus Angelicae arghangelicae) сем. сельдерейных - Apiaceae, заготовленные осенью в период конца вегетации и весной до начала вегетации (2009-2012 гг.) от дикорастущих растений на территории различных районов Северного Кавказа (окрестности города Кисловодска) и Алтая, выращенных на опытно-исследовательских участках ботанического сада ПГФА и экспериментальных (пос. Иноземцево, Ставропольский край) (площадь посева 20 м2) и культивируемых растений в Башкортостане (Ботанический сад - институт Уфинского научного центра РАН).

2.2 Методы исследования углеводов

2.2.1 Свободные моносахариды

Наличие свободных сахаров определяли с помощью реакции Бертрана при нагревании смеси равных объемов водных экстрактов исследуемого сырья и реактива Фелинга [124].

Моносахариды идентифицировали по стандартным образцам с помощью хроматографии на бумаге («Filtrak FN-15», «FN-12», «FN-7», «FN-1») нисходящим способом в системах: н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) и н-бутанол-кислота уксусная-вода (2:7:1) в течение 17-18 ч. Детектирование зон адсорбции на хроматограммах проводили раствором анилингидрофталата и нагревания при 100-1050 С в течение 10-15 мин [141].

2.2.2 Олиго- и полисахариды

Качественное определение сахаров после гидролиза проводили реакциями с реактивом Фелинга и 20 % раствором ?-нафтола [31], с пикриновой кислотой в щелочной среде [92], с карбазолом в сернокислой среде [47].

Количественное содержание полисахаридов определяли методом осаждения путем прибавления к концентрированным водным извлечениям трехкратных объемов спирта этилового 96 % [123].

2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья

После обезжиривания сырья хлороформом (1:15, 610 С), 14 час в аппарате Сокслета и удаления хлороформного извлечения, были последовательно выделены различные фракции углеводов:

Ш растворимые в спирте этиловом 96 % (1:15, 780 С, 30 мин, дважды);

Ш растворимые в холодной воде (последовательно 1:30, 1:15, 250 С, по 2 часа);

Ш растворимые в горячей воде (1:15, 800 С, 2 часа, дважды);

Ш растворимые в 0,5 % растворе аммония оксалата (1:15, 700 С, 2 часа, дважды);

Ш растворимые в 10 % растворе натрия гидроксида (1:15, 250 С, 24 часа, дважды) [69].

В случае каждой фракции полученные извлечения фильтровали, объединяли, концентрировали под вакуумом до 1/10 первоначального объема, обрабатывали спиртом этиловым 96 % (1:3), выделенные осадки фильтровали, высушивали при 700 С до постоянной массы и взвешивали. Спиртовую фракцию не обрабатывали спиртом. Щелочную фракцию до спиртовой обработки нейтрализовали 0,1 моль/л раствором уксусной кислоты до рН 7.

2.2.4 Кислотный гидролиз

Для определения мономерного состава полисахаридов проводили кислотный гидролиз (10 % H2SO4; 1:4,9; 1000 C; 10 часов - для ВРПС; 24 ч - ПВ; 72 ч - для ГЦ) в запаянных ампулах [123, 124]. Содержимое ампул переносили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной среды. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой до объема фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объема спирта этилового 96 %, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 1-2 часа. Фильтраты упаривали на кипящей водяной бане до получения объема около 1 мл (раствор А). Осадки бариевых солей уроновых кислот деионизировали катионитом КУ-2 (Н+) до рН 3-4. Растворы фильтровали, упаривали до получения около 1 мл раствора (раствор Б).

2.2.5 Хроматографический анализ углеводов

Анализ проводили в соответствии с ОФС «Хроматография на бумаге» ГФ XII издания [30], нисходящим способом в системе: н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) в течение 17-18 часов со стандартными образцами нейтральных моносахаридов, и восходящим способом в системе: этилацетат-кислота уксусная-кислота муравьиная-вода (18:3:1:4) в течение 5-6 ч с образцами гексуроновых кислот на бумаге «FN-1». Хроматограммы высушивали на воздухе 1 ч, обрабатывали раствором анилингидрофталата (для гексоз) и 5 % спиртовым раствором мочевины (для кетоз), затем нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-1050 С [123, 124]. Идентификацию углеводов проводили в сравнении со стандартными образцами и по величине Rf.

2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

Анализ проводили в соответствии с ОФС «Газовая хроматография» ГФ XII издания [30].

Моносахаридный состав определяли методом ГЖХ в виде альдонитрилов ацетатов [69]. Исследование проводили на хроматографе Chrom-5 с пламенно-ионизационным детектором, колонка стеклянная (150х0,3 см), 5 % Silicone XE-60 на хроматоне NAW-0,200-0,250 мм, температура термостата - 2100 С, температура детектора - 2800 С газ-носитель - азот. Скорость газа 60 мл/мин. Проба 1 мкл.

2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области

Анализ проводили в соответствии с требованиями ОФС «Спектрометрия в инфракрасной области» [29] на ИК- спектрофотометре фирмы «Perkim-Elmer model 2000» в интервале волновых чисел 4000-500 см-1 в таблетках с калия бромидом (или суспензии с вазелиновым маслом) [48].

2.2.8 Количественное определение галактуронидов

Количественное определение галактуронидов методом спектрофото-метрии по реакции взаимодействия с карбазолом при 530 нм проведено в сравнении с ГСО галактуроновой кислоты [47].

Галактурониды из фракций, извлеченных аммония оксалатом и горячей водой, выделяли путем обработки 1% водных растворов фракций спиртом этиловым 20 % [235]. Использование осадителя в указанной концентрации позволило предотвратить соосаждение сопутствующих низкомолекулярных нейтральных углеводов.

2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов

Значение рН 1 % водных растворов анализируемых углеводных образцов при температуре 200 С определено методом потенциометрии с помощью рН-метра марки «рН-340» при использовании стеклянного в качестве индикаторного электрода и электрода сравнения - хлоридсеребряного [30].

Количественное определение свободных (Кс) и этерифицированных (Кэ) карбоксильных групп пектиновых веществ проводили титриметричес-ким методом с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности на рН-метре марки «рН-340» [18] с последующим вычислением степени этерификации. Объем титранта в точке эквивалентности определяли графически дифференциальным способом.

2.3 Методы исследования эфирных масел

2.3.1 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС)

Химический состав компонентов эфирных масел изучали методом хромато-масс-спектрометрии на газовом хроматографе Agilent Technologist 5975 SMART с квадрупольным масс-спектрометром в качестве детектора. Пробу эфирного масла разбавляли в хлористом метилене до концентрации 500 нг/мкл. Использовали хроматографическую колонку HP-5MS (кварцевый капилляр, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 25 мкм). Режим анализа - программированный, скорость нагрева термостата колонки - 5 град/мин в диапазоне 80-2200 С. Температура испарителя 1800 С, а детектора - 2200 С.

Идентификацию эфирных масел проводили по масс-спектрам с использованием базы данных [126] и программ NIST ГХ-МС и Wiley 275 системы.

Состав компонентов эфирного масла (%) вычисляли по площадям газохроматографических пиков без использования корректирующих коэффициентов. Анализ каждой пробы проводили 3 раза.

2.4 Методы исследования фенольных соединений

2.4.1 Выделение и качественное обнаружение фенольных соединений

Для изучения фенольных соединений готовили спиртоводные извлечения с последующим фракционированием органическими растворителями различной полярности, что позволило сконцентрировать группы компонентов, различающихся по классам органических соединений.

Для получения спиртового экстракта использовали спирт этиловый различной концентрации: 40, 70 и 96 %. Кратность экстракции равна 3, время экстракции - по 60 мин, соотношение сырье - экстрагент» - 1:10. Температура экстракции - 60-650 С. Выход составил - 29,56.

Затем экстрагент отгоняли под вакуумом до водного остатка, охлаждали при +40 С в течении 48 час, фильтровали (отделяли хлорофилл и смолистые вещества) и сгущали, затем использовали для последовательной жидкостной экстракции органическим растворителями: диэтиловым эфиром, хлороформом и этилацетатом (порциями по 30 мл, 6-7 раз в делительной воронке). Полученные с помощью органических растворителей извлечения упаривали в вакууме до смолообразного остатка и использовали для проведения общепринятых качественных реакций и хроматографического анализа для каждой группы [25, 141].

Хлороформные фракции использовали для обнаружения кумаринов методом ТСХ на пластинках «Silufol» с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей: бензол - этилацетат (2:1). Хроматограммы просматривали в УФ свете до и после обработки их специфическими реактивами (пары аммиака, 10 % раствор калия гидроксида в спирте этиловом, раствор диазотированной сульфаниловой кислоты) [65].

Наличие флавоноидов в этилацетатных фракциях и водном остатке извлечения определяли с помощью характерных качественных реакций (цианидиновой пробы и цианидиновой пробы по Брианту, с 2 % раствором алюминия хлорида, с 10 % раствором натрия гидроксида). Также была использована хроматография на бумаге в системах растворителей: 15 % уксусная кислота; бензол-этилацетат-уксусная кислота (50:50:1) [141], с использованием для проявления специфических реактивов (пары аммиака, спиртовой раствор щелочи) [9]. Хроматограммы просматривали в УФ свете до и после обработки хромогенными реактивами.

Для обнаружения фенолкарбоновых кислот использовали этилацетатную фракцию. Определение проводили путем хроматографирования на бумаге восходящим способом в 2 % растворе кислоты уксусной и БУВ (4:1:2). Хроматограммы обрабатывали специфическими реактивами: парами аммиака, 3 % спиртовым раствором железа хлорида (III).

Растворители для приготовления хроматографических систем использовали квалификации ч.д.а. или х.ч. Соотношения растворителей, обозначенных цифрами, взяты в объемных единицах [8, 10].

2.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ

Анализ проводили в соответствии с ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (ВЭЖХ) ГФ XII изд. [30] на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Gilston» (модель 305, Франция), инжектор ручной модель «Rheodyne» 7125 (США). Содержание рассчитывали методом абсолютной калибровки с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows».

В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка Platinum EPS C 18 100 A (или Kromasil) 4,6х250 мм с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: метанол-вода -кислота фосфорная конц. (400:600:5). Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,5-0,8 мл/мин при продолжительности подачи от 70 до 180 мин. Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора «Gilston» UV/VIS, модель 151, при длине волны 254 нм.

Анализу подвергали спиртовое извлечение из сырья (70 % C2H5OH; 1:5; t кип., 2 часа). Параллельно с исследуемым извлечением готовили серию 0,05 % растворов стандартных образцов в 70 % спирте этиловом: изосалипурпозида, рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, коричной кислоты, гиперозида, гесперидина, апигенина, арбутина, феруловой кислоты, изоферуловой, виценина, витексина, 4-оксикумарина, скополетина, салициловой кислоты, неохлороеновой кислоты, эллаговой кислоты, робинина, дикумарина, кумарина, умбеллиферона, дигидрокверцетина, катехина, ориентина.

Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, с временами удерживания растворов стандартных образцов. Оценку количественного соотношения идентифицированных веществ в исследуемых образцах проводили по площади пиков, используя метод внутренней нормализации […., 67].

2.4.3 Физические методы анализа фенольных соединений

УФ-спектры поглощения снимали на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с толщиной слоя 10 мм в области от 200 до 600 нм.

ИК-спектры записывали на спектрофотометре UR-20 «Specord» (с призмами NaCl и NaF, концентрация вещества 0,5 %) в таблетках калия бромида высотой 1 мм в области 700-4000 см-1.