Обґрунтування складу фармацевтичної композиції для лікування нейродегенеративних захворювань

Оксидативний стрес – процес деструкції клітинних систем під дією вільних радикалів. Механізми лікування нейродегенеративних хвороб. Антиоксидантні властивості флороглюцинолу та його здатність обумовлювати інгібуючий вплив на холінестеразу людини.

Рубрика Медицина
Вид дипломная работа
Язык украинский
Дата добавления 18.01.2018
Размер файла 987,5 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми:

Активний науковий та технічний прогрес за останні сто років обумовив збільшення тривалості життя людини. Внаслідок цього, з кожним роком помножується кількість людей похилого віку, а разом з цим частота захворювань, які є специфічними для даної вікової груп. Однією з найбільш серйозних та глобальних груп таких хвороб є нейродегенеративні захворювання, які характеризуються порушенням функціонування нервової системи організму, внаслідок деструкції нервових клітин та зв'язків. Патології роботи нервової системи викликають поступове зниження рівня життя та в результаті, як правило, призводять до смерті.

Незважаючи на практично епідеміологічний стан даних хвороб [1], до сих пір не існує ефективного лікування, яке було б направлене на причини та основні механізми їх розвитку. Сьогодні існує лише симптоматичне лікування з застосуванням препаратів, які направлені на збільшення рівню медіаторів у нервовій тканині, синтез яких порушується в процесі розвитку даних хвороб. В якості основного лікування хвороби Альцгеймера та міастенії застосовуються препарати, що інгібують фермент ацетилхолінестеразу, який відповідає за утилізацію медіатору ацетилхоліну в організмі [6]. Окрім цього, багато інших хвороб супроводжується зменшенням рівню ацетилхоліну в нервовій тканині.

Згідно сучасним дослідженням [5] велику роль в процесі формування нейродегенеративних хвороб грає оксидативний стрес - процес деструкції клітин та клітинних систем під дією вільних радикалів. Згідно теорії оксидативного стресу, основною причиною порушення функціонування нервових клітин є окислювальна модифікація білків та перекисне окиснення ліпідів.

Внаслідок цього є актуальною розробка лікарського засобу який міг би контролювати рівень оксидативного стресу в організмі, а також обумовлювати інгібуючу дію на ферменти групи холінестераз.

Дослідження потенційних плейотропних фармакологічних ефектів флороглюцинолу, які направлені на мінімізацію рівню оксидативного стресу в організмі та на інгібування холінестерази, дозволить розробити оптимальний дизайн нового лікарського засобу для лікування нейродегенеративних захворювань.

Мета дослідження: розробкагеріатричного лікарського засобу для лікування нейродегенеративних хвороб з урахуванням вимог GMP.

Завдання дослідження:

1. Дослідити сучасні теорії розвитку та механізми лікування нейродегенеративних хвороб.

2. Дослідити потенційні плейотропні фармакологічні ефекти флороглюцинолу, а саме його антиоксидантні властивості та здатність обумовлювати інгібуючий вплив на холінестеразу людини.

3. Розробити склад модельного лікарського засобу на основі флороглюцинолу.

4. Провести аналіз технологій виробництва та вибір оптимального технологічного процесу виробництва запропонованого модельного препарату.

Об'єкт дослідження плейотропні фармакологічні ефекти флороглюцинолу.

Предмет дослідження: Вивчення invitro антиоксидантних властивостей флороглюцинолу, вивчення insilico та exvivoінгібуючих властивостей флороглюцинолу.

Наукова новизна роботи: вперше проведене визначення інгібуючих властивостей флороглюцинолу на холінестеразу людини.

Вперше запропоновано склад ЛЗ для лікування нейродегенеративних хвороб на основі флороглюцинолу.

Практична значущість роботи: Отримані результати дослідження щодо антиоксидантних та інгібуючих властивостей флороглюцинолу можуть бути використані при розробці нових препаратів для лікування нейродегенеративних захворювань.

Дизайн розробленого препарату може бути застосований для подальших фармако-терапевтичних та біофармацевтичних досліджень.

Запропонована технологія виробництва може бути використана в умовах реального фармацевтичного виробництва.

Методи дослідження: аналіз антиоксидантних властивостей флороглюцинолу invitro та exvivo, аналіз плейторпних властивостей сполуки методами комп'ютерного прогнозування, аналіз інгібуючої властивості флороглюцинолу на холінестеразу людини методами молекулярного докінгу та кінетичного дослідження exvivo.

1. Вплив флороглюцинолу на механізми розвитку нейродегенеративних захворювань

1.1 Проблематика нейродегенеративнх захворювань у сучасному суспільстві

На даний час, не дивлячись на серйозний розвиток науки та медицини зокрема, існує групазахворювань лікування яких значно ускладнено, внаслідок незрозумілої етіології. Нейродегенеративні захворювання, як відомо, відносяться саме до цієї групи.

Загальносвітова захворюваність Хворобою Альцгеймера (ХА), яка викликає дегенерацію клітин головного мозку, на 2010 рік оцінювалась в35,6 млн чоловік, до 2030 року збільшиться до 65,7 млн, а до 2050 року -до 115,4 млн [1]. Згідно статистичним даним за 2000 - 2004 рік смертність від більшості серйозних захворювань, таких як інсульт, хвороби серця, рак молочної та передміхурової залози знизилась на 5-10%, тоді як смертність від ХА за вказаний період підвищилась на 33 % [2].

При цьому існує багато інших нейродегенеративних захворювань, таких як хвороба Гантінгтона, деменція з тільцями Леві, хвороба Паркінсона та ін., які в більшості випадків не піддаються лікуванню та призводять до інвалідності, а потім - до летального наслідку. Тому пошук адекватного лікування нейродегенеративних захворювань є на сьогодні однією з найбільш перспективних напрямів у медицині та фармації.

Сучасній медицині невідомі остаточні причини розвитку більшості нейродегенеративних захворювань. Існують три основні теорії щодо виникнення цих хвороб: генетична, інтоксикаційна, та теорія окислювального стресу.

Згідно генетичній теорії більшість нейродегенеративних хвороб передається спадково чи виникає в результаті патологічної мутації відповідних генів на протязі життя [3]. Хвороба Гантінгтона, наприклад, виникає внаслідок помноження триплету CAG у гені HTT. Якщо кількість триплетів перевищує 36, то ген починає кодувати мутантний білок гантінгтін, який викликає нейродегенерацію [42].Також відомо, що наявність у людини поліморфної алелі гену аполіпротеїну Е (APOE) підвищує ризик розвитку ХА, порівняно з більш розповсюдженою ?3, в той час як ?2 алель знижує ризик захворювання [41, 69, 70].

Згідно інтоксикаційній теорії, захворювання які супроводжуються нейродегенерацією можуть бути викликані деякими специфічними речовинами, наприклад пестицидами та металами[4].

Але найбільш цікавою та перспективною, з точки зору лікування є теорія окислювального стресу, за якою причиною більшості нейродегенеративних захворювань виступає надмірна кількість вільних радикалів в організмі. Вільні радикали - це молекули чи атоми, зовнішня електронна оболонка яких має один чи декілька неспарених електронів, таякі внаслідок цього володіють високою реакційною здатністю. При нормальному рівні вільні радикали в організмі нейтралізуються антиоксидантною системою, але при надмірній кількості починають активно взаємодіяти з клітинами організму, руйнуючи їх, та визиваючи незворотні зміни в функціонуванні тієї чи іншої системи. Відомо, що існує прямий зв'язок між рівнем реактивних форм кисню в клітинах нервової системи та гіперфосфорильованого тау-протеїна [48].

1.2 Механізми розвитку нейродегенеративних захворювань на прикладі Хвороби Альцгеймера

Наявність ненормально згорнутих білків бета-амілоїду та тау-протеїна у вигляді синільних бляшек та нейрофібрилярних клубків у великих кількостях спостерігається у мозку паціентів які страждають на ХА. Бляшки утворені головним чином бета-амілоїдним пептидом (Aв), який має молекулярну масу4 кДа і довжину близько 40 амінокислотних залишків. Aв - фрагмент трансмембранного білка попередника бета-амілоїду АРР (amyloid precursor protein) виявленого в багатьох тканинах, включаючи синапси нейронів. АРР залучений в процеси нейропластичності, утворення синапсів і необхідний для виживання нервових клітин [44].Aв представлений в тканинах мозку поліпептидними ланцюгами різної довжини, найбільш чисельними з яких є Aв1-42 та Aв1-40, причому саме Aв1-42 відводять важливішу роль в патогенезі ХА. Окремі молекули Aв можуть об'єднуватися в різні за розмірами агрегати нефібріллярной природи і фібрили, а також залишатися в низкомолекулярной формі[45]. Олігомери бета-амілоїду дуже токсичні для нервових клітин, взаємодіючи з клітинами, вони призводять до дегенерації та смерті останніх [43]. Нейротоксичність Ав проявляється порушенням Ca2+- гомеостазу, запальними процесами, індукцією окисного стресу, ексайто токсічністю, інтенсифікацією апоптозу. Останній ефект може бути реалізований шляхом індукції відкриття мітохондріальних пор. В останньому випадку загибель клітин може відбуватися також і за механізмом некрозу.

Іншою характерною морфологічною ознакою ХА є порушення цитоскелету нервових клітин і накопичення всередині них нейрофібрилярних клубків (NFT), що складаються головним чином з нерозчинних агрегатів гіперфосфорильованого Тау-білка [48,47].Тау-білок, агрегуючись, утворює щільно упаковані філаменти, але на відміну від амілоїдних бляшок, вони накопичуються внутрішньоклітинно в уражених нейронах, формуючи нейрофібрилярних клубки (NFT). Термін «парні спіральні філаменти»(pairedhelicalfilaments, PHF) нерідко використовується для позначення окремих філаментів Тау-білка в складі NFT. Тау-білок був відкритий близько 40 років тому як білок, асоційований з мікротрубочками (microtubule associated protein tauи - MAPT), який стимулює полімеризацію тубуліну [50], але його присутність в NFT було показано тільки через десятиліття [51-53]. Допускається, що в ході нейродегенеративного процесу спочатку утворюються амілоїдні фібрили, що порушують функціонування нервових клітин, а пізніше в них відбувається формування нейрофібрилярних клубків [49]. Ці процеси призводять до дегенерації і загибелі нейронів, головним чином, в таких структурах мозку, як кора і гіпокамп. Спостерігаються порушення синаптичної передачі, зокрема, в холінергічних терміналах.

Окрім вищезазначених маркерів, патогенез багатьох нейродегенеративних захворювань, включає в себе порушеннясинаптичної передачі у нервовій тканині, у випадку ХА - в холінергічних терміналах, медіатором в яких виступає ацетилхолін. Порушення синтезу ацетилхоліну на периферії є патогенетичною особливістю такого захворювання як Міастенія Гравіс, яке супроводжується м'язовою слабкістю.

Згідно «холінергічній теорїї» патогенезу ХА вважається, що основа порушення декларативної пам'яті - холінергічна дисфункція [54, 55],тобто зниження забезпечення ацетилхоліном нової кори та гіпокампу з боку базальної холінергічної системи. Дана гіпотеза заснована на тому, що порушення холінергічної передачі зазначених структур мозку корелює з глибиною порушення пам'яті у хворих на ХА та у експериментальних тварин [56, 57].Так застосування антагоністів мускаринових холінорецепторів викликає порушення декларативної пам'яті у людини[59, 60] та просторової пам'яті у тварин [61]. З іншого боку, речовини, які посилюють центральну холінергічну іннервацію, потенціюють декларативну пам'ять у людини [62] та тварин [63]. Підкреслюючи все вищесказане, можна виділити три основних патогенетичних шляхи розвитку ХА, а саме, скупчення ненормально згорнутого бета - амілоїду у вигляді синільних бляшек та гіперфосфорильованого тау - протеїна у формі нейрофібрилярних клубків у нервовій тканині гіпокампу та нової кори, а також порушення межсинаптичної передачі у холінергічних терміналах.

1.3 Сучасні підходи то терапії нейродегенеративних захворювань на прикладі ХА

Збільшення внутрішньоклітинного рівня нейромедіаторів у нервовій тканині - основний напрямок у сучасному лікуванні нейродегенеративних захворювань. Хоча дане лікування не дозволяє вилікувати хворобу остаточно, воно дає змогу тимчасово зняти основні симптоми та уповільнити її прогрес. Препарати, які при цьому використовуються умовно можливо поділити на дві групи, у випадку ХА це: препарати центральної холіноміметичної дії та інгібітори ацетілхолінестерази (АХЕ).

Найбільш успішним препаратом центральної холіноміметичної дії є гліатилін (холін альфосцерат). Гліатилін є частиною медіатора ЦНС - ацетилхоліну - спільно з речовиною для його транспортування в тканини головного мозку, де безпосередньо розщеплюється на холін і гліцерофосфат. Холін бере участь в біосинтезі ацетилхоліну надаючи збуджуючу та активізуючу дію. Гліцерофосфат є попередником фосфатиділхоліну, необхідного структурного компонента мембрани нейрона, за допомогою якого здійснюється протекторна дія даного препарату. Таким чином гліатилін зменшує вираженість когнітивних розладів, якими супровождуються нейродегенеративні захворювання, інсульти а також судинні ураження головного мозку. Призначення гліатиліну рекомендується відразу ж при виявленні порушення когнітивних функцій різного походження. Прийом препарату починається з внутрішньом'язового введення в дозі 1000 мг/добу протягом 10-15 днів; далі йде прийом капсул: вранці 400-800 мг (1-2 капсули), після обіду - 400 мг (1 капсула). Рекомендований курс 3 місяці[6].

Друга група препаратів - інгібітори АХЕ - діють на механізм руйнування ацетилхоліну, уповільнюючи його гідроліз, внаслідок чого концентрація медіатору в міжсинаптичному просторі збільшується.

Такий результат досягається через інгібування ферменту АХЕ. АХЕ - фермент класу гідролаз, основною функцією якого є каталіз гідролізу медіатора ацетилхоліну, який проходить з утворенням холіна та оцтової кислоти. Окрім АХЕ, основне місцезнаходження якої - нервова тканина, до групи холінестераз входить фермент бути рілхолінестераза, який переважно знаходиться в крові та має схожу функцію відносно АХЕ, а саме, відповідає за каталіз руйнування ефірних зв'язків, специфічними субстратами є бутирілхолін, пропіонілхолін, також має велику спорідненість до ацетилхоліну. В нормі, ферменти групи холінестераз виконують дуже важливу біологічну роль в організмі, наприклад, при отруєнні фосфорорганічними сполуками, фермент АХЕ незворотньо інгібується за рахунок утворення стійкого ковалентного зв'язку, внаслідок цього фермент повністю втрачає свою активність, а надлишок негідролізованого ацетилхоліну викликає значні порушення функціонування нервової системи та іноді призводить до смерті. Тому препарати групи інгібіторів АХЕ, хоча і зв'язують фермент зворотно, викликають ряд небажаних побічних ефектів [64].

На сьогоднішній день серед інгібіторів АХЕ найбільше використання знайшли три препарати: донепезіл, рівастігмін та галантамін. Вибір призначення одного з цих препаратів виконується на основі індивідуальних особливостей пацієнта. Донепезіл рекомендується приймати перорально у дозуванні 5 мг перед сном від 4 до 6 тижнів, потім 10 мг перорально перед сном, в разі необхідності дозування може бути підвищене до 23 мг після трьохтижневого прийома у дозуванні 10 мг. Прийом донепезілу, як і інших активних інгібіторів АХЕ може супроводжуватися деякими побічними ефектами, які включають в себе, брадикардію, зниження апетиту, діарею, головну біль, підвищення тиску, втрату ваги та блювоту. Галантамін рекомендується приймати перорально у дозуванні 4 мг два рази на добу протягом 4 тижнів, після підвищуючи дозу до 8 мг 2 рази на добу протягом 4 тижнів, після 12 мг два рази на добу. Рівастігмін при ХА приймається перорально у дозуванні 1,5 мг два рази на добу протягом 2 тижнів, потім кожне дозування збільшується на 1,5 мг кожні 2 тижня до максимальної дози 12 мг на добу.

В останній час у комплексі з інгібіторами АХЕ використовується селективний блокатор NMDA - рецепторів мемантін, який в наслідок модулювання глутаматергічної передачі стабілізує когнітивні функції хворого, а також зменшує поведінкові порушення у хворих на ХА. Приймається мемантін перорально у дозуванні 5 мг на добу протягом тижня, далі 5 мг два рази на добу протягом тижня, потім 10 мг кожен ранок та 5 мг кожну ніч протягом тижня, після 10 мг два рази на добу[7].

Також комплексна терапія нейродегенеративних захворювань включає в себе препарати, які покращують мозковий кровообіг та антидепресанти, для стабілізації психоемоційного стану хворого.

Проте на сьогоднішній день зрозуміло, що підходи до терапії нейродегенеративних захворювань потребують подальшого розвитку та пошуку лікарських засобів, які будуть впливати на етіогенез хвороби та здійснювати адекватне симптоматичне лікування з мінімізацією побічних ефектів.

1.4 Можливі шляхи розвитку сучасної терапії нейродегенеративних захворювань

На цей час у світі відомо близько 60 млн сполук, повний спектр властивостей багатьох з них не вивчений і досі. Тому пошук, ще невідомих (плейотропних) властивостей існуючих хімічних речовин, сьогодні, є найбільш перспективним та доступним способом вирішення проблем у терапії багатьох серйозних захворювань, включаючи нейродегенеративні. Доступність способу обумовлюється тим, що попередній аналіз відповідності сполук певним властивостям проводиться за допомогою методу комп'ютерного моделювання (insilico) [65]. Моделювання включає в себе віртуальний скринінг - відбір речовин у межах віртуальних бібліотек з використанням різних дескрипторів, фільтрів, теорій, алгоритмів та як правило, відповідного програмного забезпечення для прогнозування біологічної активності віртуальних сполук. Перед початком скринінгу потрібно ідентифікувати мішень, на яку буде скерована дія майбутнього лікарського засобу. Цей принцип - основа мішень-орієнтованого (target-baseddesign) віртуального скринінгу [8].

Найбільш ефективні сполуки у лікуванні нейродегенеративних захворювань, як видно з аналізу сучасної літератури, повинні володіти антиоксидантною активністю, мінімальною токсичністю і при цьому реалізувати інгібуючий ефект по відношенню до АХЕ. Ці ефекти виступають основним критерієм відбору потрібної сполуки, для лікування нейродегенеративних захворювань[7].

1.5 Флороглюцинол - як потенційний активний фармацевтичний інгрідієнт для лікування нейродегенеративних захворювань

Загальна інформація. Фізичні та хімічні властивості. Промислове застосування.

Однією з таких потенційно ефективних сполук є флороглюцинол. Флороглюцинол (1,3,5-бензетріол) - органічна, природня сполука, яка представляє собою похідне фенолу.В1855 році австрійській хімік HeinrichHlasiwetz відкрив флороглюцинол в продуктах гідролізу флоретину, котрий отримували із кори фруктових дерев. Назва флороглюцинол з грецької означає «солодка кора». Його похідні (кстантини, антоціаніди і флавони) широко росповсюджені в рослинному світі. Флороглюціноли є вторинними метаболітами, які природно виникають у деяких видах рослин. Він також виробляється організмами, які не є рослинами, такими як коричневі водорості або бактерії. Ацильні похідні флороглюцинолу присутні в гілках прибережного дріоптерісу. Форміліруванні з'єднання флороглюцину присутні у складі деяких видів евкаліпту. Гіперфорин і адгіперфорін - це два похідних флороглюцінола, що містяться в звіробої. Гумолон - похідне флороглюцину з трьома ізопреноїдними бічними ланцюгами, що міститься в смолі зрілого хмелю. Бурі водорості, такі як Eiseniabicyclis, Eckloniastolonifera, або види роду Zonaria, виробляють флороглюцин і похідні флороглюцину. Бактерія Pseudomonasfluorescens виробляє флороглюцинол, флороглюцин карбонову кислоту і діацетілфлороглюцінол [9].

Флороглюцинол (1,3,5-бензетріол) - це бензетріол, який має два ізомери пірогалол (1,2,3-бензетріол) і гідроксіквіінол (1,2,4-бензетріолом).

Флороглюцинол і його ізомери визначаються як «феноли», згідно з офіційними правилами номенклатури хімічних сполук ІЮПАК. Багато з таких монофенолів часто ненауково називають «поліфенолами», однак таке визначення невірно. Флорглюцинол існує в двох формах (таутомерах), 1,3,5-ціклогексантріон (флороглюцин), який має кетоноподобний характер та 1,3,5-трігідроксібензол, який має фенолоподібний характер. Ці два таутомера знаходяться в рівновазі. Флороглюцинол є корисною проміжною речовиною, оскільки він є поліфункціональним.

Сполука веде себе як кетон в реакції з гідроксиламіном з утворенням трис (оксима). Але він веде себе також як бензетріол (Ka1 = 3,56 Ч 10-9;Ka2 = 1,32 Ч 10-9), а три гідроксильні групи можуть бути метиловані,створюючи 1,3,5-тріметоксібензол [11]. В реакції Хеша здійснюється синтез 1-(2,4,6-трігідроксіфеніл) етанона з флороглюцину. Лептоспермон може бути синтезований з флороглюцину в результаті реакції з ізовалероїлнітрілом в присутності каталізатора хлориду цинку. Пентакарбоніл діоксид, описаний в 1988 році Гюнтером Майєром і ін., Може бути отриманий шляхом піролізу 1,3,5-ціклогексанетріона (флороглюцину)[12].

Флороглюцинол являє собою безбарвні кристали, солодкі на смак. Розчинний в органічних розчинниках, у воді розчинний слабо (10.6 mg/mLat 20 °C), температура плавлення = 218,5 °C, LogP= 0,16, LD50=5 г/кг [10]. Флороглюцин кристалізується з води у вигляді дигідрату з температурою плавлення 116-117 °С. Безводна форма плавиться при більш високій температурі 218-220 °С. Речовина не кипить в незмінному вигляді, але випаровується.

Флороглюцинол в промисловості використовують в якості з'єднуючої речовини у друку. Він пов'язує діазо-барвники, створюючи відтінок «міцний чорний». Речовину застосовують для промислового синтезу вибухових речовин (трінітрофлороглюцінол, 1,3,5-тринітробензол). В аналітичній хімії флороглюцинол знайшов використання у вивченні конденсованих дубильних речовин. В хімічних реакціях флороглюцин використовується в якості нуклеофіла. Формування флобафенов (конденсація і осад танинов) може бути мінімізовано за допомогою сильних нуклеофілів, таких як флороглюцин, під час вилучення соснових дубильних речовин [14].

Флороглюцин використовується в якості реагента в тесті Толленса для пентоз. Цей тест заснований на реакції фурфуролу з флороглюцинолом в результаті якої отримується пофарбоване з'єднання з високим молярним коефіцієнтом поглинання [13]. Розчинфлороглюцину і соляної кислоти також використовується для ідентифікації лігніну (тест Уіснера). Яскраво-червоний колір з'являється завдяки наявності груп коніферілових альдегідів в лігніну [15]. Флороглюцин також є частиною реагенту Гінцбурга, спиртового розчину флороглюцину і ваніліну, для якісного визначення вільної соляної кислоти в шлунковому соку.

Використання флороглюцинолу в якості АФІ у сучасній терапії.

Проте найбільш перспективним є використання флороглюцинола в якості активного фармацевтичного інгредієнта (АФІ). Завдяки своїй малотоксичності (LD50 =5 г/кг) флороглюцинол все частіше знаходить використання у медицині. Дослідження підтвердили високу біодоступність флорглюцинолу та підкреслили його біотрансформацію в глюкуро- та сульфокон'юговані метаболіти [33]. Внутрішньовенне введення маркованого 3Н-флороглюцинолу щурам продемонструвало, що сполука в найвищих концентраціях локалізується в нирках, печінці та кишечнику [19]. Крім того було виявлено, що пероральний прийнятий флороглюцинол може бути згодом повернений в кровоток в некон'югованому вигляді [34]. Це свідчить про те, що флороглюцинол здатний проникати через мембрани та перерозподілятись. Попередні дослідження демонструють, що флороглюцинол не володіє цитотоксичним ефектом в межах 1-100 мкМ [35].

На сьогодні флороглюцинол активно застосовується для лікування різноманітних патологій шлунково-кишкового тракту (ШКТ), внаслідок своєї спазмолітичної активності. Флороглюцинол є блокатором потенціалзалежних кальцієвих каналів в гладком'язових клітинах. В результаті чого в клітинах зменшується концентрація кальцію, що гальмує взаємодію актину з міозином. При цьому спазмолітичний ефект речовини не обумовлює розвиток гіпотонії гладкої мускулатури. Клітини гладкої мускулатури у стінці ШКТ мають a1-адренорецептори, асоційовані з депо Ca2+, котре постійно поповняється з позаклітинної середи. Стимуляція рецепторів призводить до переміщення Ca2+з депо до внутрішньоклітинного середовища, що призводить до відкриття каналів K+. Наступний відтік K+ з клітини обумовлює гіперполяризацію мембрани та зниження м'язового тонусу. Флороглюцинол блокує наповнення депо позаклітинним Ca2+. Таким чином, якщо a1-адренорецептори активуються в присутності речовини, депо спустошується але заповнитись знову не може. Це означає що канали K+ відкриті короткочасно та постійної гіпотонії не виникає [16].

Для лікування патологічного спазмування флороглюцинол використовують в якості дигідрату в комбінації з симетиконом, під комерційною назвою Ентероспазміл.

Окрім спазмолітичної активності згідно дослідженням флороглюцинол володіє знеболювальним ефектом по відношенню до болей викликаних синдромом подразненого кишечника (СПК), який характеризується дискомфортом в животі або болем пов'язаним з дефекацією або змінами у роботі ШКТ, причиною якої згідно сучасним теорія патогенезу СПК є вісцеральна гіперчутливість [17].

Флороглюцинол зменшує вісцеральну больову чутливість ШКТ, здійснюючи вплив на передачу нервових імпульсів переферичним і центральним нервовим центрам через аферентні нервові волокна. Згідно рандомізованому подвійно-сліпому плацебо-контрольованому дослідженню було виявлено що прийом флороглюцинолу (ФГ) у дозуванні 62,2 мг у комплексі з 80мг метильованого похідного (МПФ) протягом тижня зменшував інтенсивність больового синдрому вже з першого дня. Видима різниця наступала на 4 день (p=0,007). Зменшення інтенсивності болю спостерігалось у групи ФГ/МПФ 57,8 % ± 31,7 % проти групи плацебо 46,3% ± 34,7% з різницею 11,5% [18].

Плейотропні ефекти флороглюцинолу. Можливість використання сполуки в якості АФІ для лікування нейродегенеративних захворювань.

Окрім використання флороглюцинолу для лікування патологій ШКТ, активно вивчається дія сполуки та її похідних на інші системи організму. Дослідження демонструють, що флороглюцинол володіє протизапальними та антиоксидантними властивостями. Як відомо, можливість мономерних фенольних сполук виступати в якості антиоксидантів залежить від ступеня гідроксилювання та кон'югації, оскільки гідроксильні групи виступають в якості водородних донорів [28]. Флороглюцинол виявляє підвищений ступінь гідроксилювання з ароматичним ядром, оточеним трьома гідроксильними групами.

Однак опублікована інформація про антиоксидантну здатність флороглюцинолу досить незначна. Хоча KangK.A.etal. (2006) описав антиоксидантні властивості флороглюцинолу відносно його внутрішньої стабільності [31]. Він описує флороглюцинол як сполуку з поліфенольною структурою, яка багата електронами, та здатна до реакції з наданням електронів окисним сполукам з утворенням проміжного феноксил-радикалів як проміжних сполук. Феноксильні радикали стабілізуються резонансною делокалізацією неспарених електронів до орто- та парапозицій ароматичного кільця. Це в свою чергу може свідчити про наявність високого антиоксидантного ефекту у флороглюцинола. Також феноксильні радикали можуть бути стабілізовані водневими зв'язками з сусідньою гідроксильною групою. Згідно Kang K.A. etal. флороглюцинол значно знижує рівень внутрішньоклітинних РФК, який був обумовлений впливом гамма-променів. Окрім зниження рівня радіаційно-індукованих РФК, флороглюцинол також зменшував пошкодження клітинних компонентів (білків, ліпідів та ДНК). Флороглюцинол покращив життєздатність клітин, яка зменшилась після впливу гамма-променів, а також зменшив рівень радіаційно-індукованого апоптозу шляхом інгібування каспаз, ферментів з групи цистеїнових протеаз, опосередкованих мітохондріями. Спостерігалось зниження радіаційно-індукованої втрати потенціалу дії мітохондріальної мембрани та рівня активних форм каспази 9 та 3. У дослідженнях invivo було показано що застосування флороглюцинолу у мишей забезпечувало захист від окисного пошкодження та смерті після повного опромінення [24].

Інші дослідження також демонструють позитивний вплив флороглюцинола на систему з оксидативним стресом, на прикладі індукованої підкисленим етанолом травми слизової оболонки шлунка [25]. Як відомо, вплив етанолу на слизову оболонку викликає підвищення активності ферменту мієлопероксидази (МПО), який каталізує окиснення хлорид-аніону пероксидом водню (H2O2) до гіпохлоритної кислоти (HOCL), яка в свою чергу володіє сильним оксидантним ефектом [26]. Окрім цього відбувається різке зниження активності каталази, одного із основних ферментів антиоксидантної системи організму, яка каталізує розклад H2O2 до води та молекулярного кисню.

Зрозуміло, що H2O2є субстратом як для МПО так і для каталази, тому співвідношення цих ферментів є дуже критичним для окисного-відновлювального статусу у шлунку. Значна активізація МПО та зменшення активності каталази викликає збільшення кількості РФК (таких як O2• та OH•), які напряму викликають оксидативні пошкодження тканин та індукують клітинний апоптоз. Як виявилось, передчасний прийом флороглюцинолу в високих дозах (10мг/кг), навпаки, підвищував активність каталази та зменшував активність МПО. До того ж прийом флороглюцинолу (10мг/кг) перед етанолом, зменшував рівень етанол-індукованого перекисного окиснення ліпідів, яке визначається за допомогою вимірювання активності анти-O2• чи OH• формацій та кількості малонового диальдегіду (МДА). Флороглюцинол підвищував рівень активності анти-O2• чи OH• формацій, в свою чергу кількість МДА значно зменшувалась відносно досліду без передчасного прийому флороглюцинолу.

Також було виявлено, що активність глутатіонпероксидази, іншого важливого ферменту антиоксидантної системи організму, який відновлює H2O2до води, не змінюється в незалежності від наявності флороглюцинолу в малих чи великих дозах [25].

Більш сучасні дослідження підтверджують, що флороглюцинол може гальмувати процеси руйнування тканин через комплексний вплив на механізми оксидативного стресу. Одним із проявів оксидативного стресу є перекисне окиснення ліпідів.

ПОЛ (перекисне окиснення ліпідів) - складний біохімічний процес, який протікає в рослинних та тваринних тканинах. Він включає в себе активацію та деградацію ліпідних радикалів, вбудовування в ліпіди активованого молекулярного кисню, зміну конфігурації подвійних зв'язків в полінасичених ацилах ліпідів та, як наслідок, деструкцію мембранних ліпідів та самих мембран. Деструкція мембран, в свою чергу, призводить до смерті клітин та порушенню роботи тих чи інших органів та їх систем. Ферменти антиоксидантної системи організму та хімічні речовини, які володіють антиоксидантними властивостями, зменшують інтенсивність ПОЛ. Таким чином, інгібування ПОЛ хімічними речовинами дозволяє судити про наявність у них антиоксидантних властивостей.

Benoоt Quйguineur etal. вивчали вплив флороглюцинолу на оксидативну систему печінки, а саме на колонію клітин HepG2 людини [30]. Як відомо печінка найбільш відкрита для впливу вільних радикалів, внаслідок метаболізму основної частини хімічних речовин, які потрапляють в організм, метаболіти яких включають в себе РФК.

При взаємодії гідроксильного радикалу з ненасиченими жирними кислотами фосфоліпідів мембрани виникає ланцюгова реакція ПОЛ, і в результаті пошкодження мембран гепатоцитів. OH•-радикал може пошкоджувати структуру ДНК, що в свою чергу може призвести до гепатоканцерогенезу [29]. Тому підтримання нормального функціонування антиоксидантної системи печінки є дуже важливим для роботи усіх систем організму в цілому.

Попередні дослідження виявили, що клітинна група печінки людини HepG2 є чутливою моделлю для виявлення біомаркерів антиоксидантних сполук, таких як феноли [32]. Для початку, в дослідженнях Benoоt Quйguineur etal. (2012) була вивчена здатність флороглюцинола виступати в якості стандартного відновника порівняно з Тролоксом (штучним аналогом вітаміну Е) за допомогою Theferricreducing/antioxidantpower (FRAP) тесту, який допомагає напряму визначити «загальну потужність антиоксидантів». Як виявилось, здатність флороглюцинолу відновлювати залізо залежить від часу. Через 4 хв. після початку досліду відновлення заліза було неповним, на відміну від досліду зі стандартом-Тролоксом (98±2 µМ та 365±11 відповідно (в перерахунку на FeSO4 )). Однак, через 30 хв., різниця між відновлюючим потенціалом флороглюцинолу та тролоксу значно знизилась (365±11 та 557±8 відповідно). Ступінь антиоксидантного ефекту першого за даними [30] знаходився між ресвератролом та аскорбіновою кислотою.

В свою чергу флороглюцинол показав більшу здатність до розщеплювання ABTS+ (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid)) ніж Тролокс. Дослідження на клітинах печінки HepG2 людини виявили, що флороглюцинол пом'якшує реакцію клітин при взаємодії з окисниками, такими як РФК. Флороглюцинол зміг безпосередньо знешкодити вільні радикали, що призвело до опосередкованої модуляції активності антиоксидантного ферментного захисту. Також був відмічений значний протектуючий ефект флороглюцинолу відносно перекисного окиснення ліпідів в культивованих клітинах печінки.

Mi Jung So and Eun Ju Cho (2014) в свою чергу дослідили захисну роль флороглюцинолу проти оксидативного стресу та стрес-індукованому передчасному старінню invitroта invivo на культурі клітин нирок LLC-PK1[36]. Окрім звичних РФК таких як супероксид-аніон, гідроксил радикал, пероксид водню вивчався вплив на нітроксильний радикал NO.

Як відомо NO - це вільний радикал, який має один неспарений електрон. Надлишок NO викликає пошкодження тканин та призводить до патологічних станів [38]. До того ж взаємодія NO з O2• призводить до утворення ONOO-, ще більш реактивного та токсичного радикалу [37]. Ця реакція надзвичайно швидка та може генерувати найбільш токсичний радикал OH•, який призводить до перекисного окиснення ліпідів мембран клітин, внаслідок чого виникає швидке руйнування структури клітини та смерть.

У цьому дослідженні показано, що флороглюцинол мав високу здатність до знешкодження NO,O2• та OH• радикадів. Використання клітин LLC-PK1, які є дуже чутливими до оксидативного стресу, індукованого вільними радикалами, в якості клітинної моделі оксидативного стресу, добре зарекомендувала себе при пошуку агентів, які можуть забезпечити ефективний захист від вільних радикалів [39,40], а тому була вибрана за модель даними дослідниками. В якості генератору вільних радикалів використовувалися 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), sodiumnitroprusside (SNP), 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), pyrogallol. Вільні радикали, які генерувались за допомогою AAPH швидко вступають в реакцію з киснем та утворюють пероксильні радикали, які ініціюють перекисне окиснення ліпідів. Як виявилось лікування флороглюцинолом надає захисний ефект відносно AAPH - індукованих оксидатвних пошкоджень LLC-PK1 клітин, яке проявлялось в дозозалежному збільшенні життєздатності клітин та зменшенні перекисного окиснення ліпідів.

Також флороглюцинол мав значний захисний ефект проти оксидативного стресу, викликаного ONOO-(пероксінітритом), який є продуктом взаємодїї NO з O2•, які генерувались за допомогою SIN-1 та пірогалолу. Дослідження показали, що лікування флороглюцинолом, значно зменшувало генерацію пероксінітриту, та внаслідок цього підвищувало життєздатність клітин.

Згідно Ya Qiang He et al. флороглюцинол може використовуватися при лікуванні інтерстиціального циститу (ІЦ), хвороби яка супроводжується хронічним запаленням сечового міхура [23]. Однією з причин ІЦ є оксидативний стрес при якому в тканинах сечового міхура присутня надмірна кількість РФК (гідроксильний радикал, супероксид-аніон, пероксид водню та ін.). А, як відомо, надмірна продукція РФК результує пошкодження клітин та тканин [27]. Згідно дослідженням Ya Qiang He et al, флорглюцинол пригнічує запалення в сечовому міхурі, відновлює баланс між утворенням РФК та їх руйнуванням, активізує антиоксидантний фермент каталазу та пригнічує активність МПО. Флороглюцинол зменшує проліферацію клітин в запалених тканинах та гальмує виробництво прозапальних речовин, фактору некрозу пухлини-a (ФНП-а) та інтерлейкіну-6 (ІЛ-6). Таким чином, при випробуваних концентраціях (15 чи 30 мг/кг) флороглюцінол пом'якшував симптоми запалення сечового міхура та зменшував гістологічні зміни пов'язані з CYP-індукованим циститом, завдяки пригнічуванню активності МПО при підвищенні активності САТ та зменшенні виробництва TNF-б та IL-6. З огляду на ці результати, флорглюцинол може бути використаний в якості терапевтичного агента для лікування інтерстиціального циститу.

Інші дослідження демонструють, що флороглюцинол, здатний значно зменшувати рівень кінцевих продуктів гліколізування (КПГ). Гліколізування - це процес взаємодії між відновлюючими вуглеводами та вільними аміногрупами білків, ліпідів та нуклеїнових кислот в живому організмі, який протікає без участі ферментів. Гліколізуючись, молекулярні формації втрачають свою функціональність, внаслідок чого наступає порушення роботи молекулярних систем організму, що в свою чергу призводить до смерті клітин та деградації тканин. Кількість гліколізованних білків організму пропорційна кількості глюкози у крові. Тому, неферментативне гліколізування - основна причина пошкодження тканин при цукровому діабеті [66]. Окрім цукрового діабету КПГ можуть бути супутніми факторами старіння та розвитку чи ускладнення багатьох дегенеративних захворювань, включаючи Хвороба Альцгеймера, атеросклероз та хронічна хвороба нирок [67]. Флороглюцинол (50 мг/кг п.о.), в свою чергу, значно зменшував рівень глюкози у крові, та гальмував утворення КПГ. Також було виявлено здатність нивілювати радикальну оксидантну активність 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразилу (DPPH) та оксиду азоту (NO), що знову підтверджує наявність виражених антиоксидантних властивостей у флороглюцинола [68].

З аналізу сучасної літератури зрозуміло, що флороглюцинол володіє широким спектром терапевтичних властивостей, серед яких як найбільш перспективною виступає здатність флороглюцинолу обумовлювати антиоксидантний та протизапальний ефект, внаслідок реалізації ряду молекулярних механізмів, включаючи пригнічення активності МПО, активування КАТ, утилізацію надлишку вільних радикалів (ONOO-, NO, O2•, OH•та ін.),а також зниження утворення КПГ за рахунок зменшення рівню глюкози у крові. Також флороглюцинол пригнічує проліферацію клітин в запалених тканинах та гальмує виробництво прозапальних речовин ФНП-а та ІЛ-6.

Усе вищезазначене свідчить про те, що флороглюцинол потенційно може бути використаний для лікування деяких нейродегенеративних захворювань та Хвороби Альцгеймера зокрема, якщо ми беремо до уваги теорію окислювального стресу, як одну із головних причин розвитку нейродегенеративних захворювань.

Похідні флороглюцинолу, також представляють значний інтерес для сучасних досліджень. Серед них виділяються гіперфорин та адгіперфорин. Наприклад, згідно дослідженням, гіперфорин - похідне флороглюцинолу, який є одним із трьох основних компонентів звіробою (Hypericumperforatum), володіє антидепресивними властивостями [20]. Цей ефект, можливо, реазлізується через інгібування зворотного захоплення серотоніну, дофаміну та норадреналіну. Вважається, що гіперфорин впливає на глутаматергічні та ГАМКергічні системи мозку [21]. Існують експериментальні підтвердження того, що гіперфорин у малих дозах може стимулювати синтез медіатора ацетилхоліна, а в великих дозах може інгібувати його зворотній захват. Після встановлення системного введення чистого гіперфорину щурам у дозах від 1 до 10 мг/кг, рівень ацетилхоліну у гіпокампі збільшувався на 50-100%. Вважається, що ефект реалізується через непрямі механізми, які залежать від рівню Ca2+, та потребують інтактної нейрональної комунікації [22].

Аналіз сучасної літератури демонструє, що на даному етапі розвитку медицини та фармації зокрема, проблема лікування нейродегенеративних захворювань залишається невирішеною.Невідомими залишаються основні причини та деталі механізму розвитку нейродегенеративних захворювань.

Однак великий об'єм накопичених теоретичних та практичних даних створює сприятливі умови для подальшого, більш детального вивчення даної проблеми, а в перспективі і для її вирішення. Водночас, хоча етіогенез більшості нейродегенеративних захворювань невідомий, а сучасна терапія нездатна безпосередньо впливати на причину виникнення та прогресування хвороб, ми маємо можливість впливати на їх патогенетичні механізми та за допомогою набору маркерів визначати наявність захворювань на ранніх стадіях або тоді, коли ще не існує ніяких патологічних процесів зв'язаних з цим захворюваням (визначення наявності хвороби Гантінгтона за допомогою виявлення кількості триплетів ЦАГ в HTT - алелі). Але сучасній терапії, як і будь якій іншій терапії, яка не обумовлює максимально потрібного ефекту, необхідний подальший розвиток.

Такий розвиток можливий за допомогою пошуку нових терапевтичних агентів та їх комбінацій з уже існуючими, які б максимально ефективно впливали на найбільшу кількість патогенетичних та потенційних етіогенетичних механізмів, при цьому володіючи якнайменшою кількістю побічних ефектів.

Серед усіх можливих хімічних речовин, які б могли б відповідати необхідними характеристиками, був проаналізований флороглюцинол (1,3,5-бензетріол), монофенол, який використовується в медицині в якості спазмолітичного засобу для ШКТ. Однак, окрім основного використання в сучасній літературі була описана здатність флороглюцинолу обумовлювати протизапальний та антиоксидантний ефект, останній з яких може бути необхідним для комплексного лікування нейродегенеративних захворювань, так як відомо, що оксидативний стрес грає одну з головних ролей в процесі виникнення та розвитку цих хвороб. Збільшення кількості фундаментальних досліджень плейотропних властивостей флороглюцинолу в останні роки демонструє актуальність даної теми.

Підкреслюючи вищезазначене, вважається доцільним проведення подальших досліджень, щодо можливого використання флороглюцинолу в якості потенційного терапевтичного агенту захворювань, викликаних хронічним та періодичним оксидативним стресом, в об'єм яких, в свою чергу, входять деякі нейродегенеративні захворювання, включаючи ХА. Особливої уваги заслуговують також похідні флороглюцинолу, наприклад гіперфорин та адгіперфорин.

2. Модель лікарського засобу для лікування нейродегенеративних захворювань

2.1 Дослідження антиоксидантних властивостей флороглюцинолу в хімічних окисно-відновних системах

Дослідження антиоксидантних властивостей флороглюцинолу проводились базуючись на методиці представленій в патенті [71]. В якості стандарту порівняння використовувалась аскорбінова кислота. Згідно методиці, антиоксидантна активність сполуки визначається за її здатністю інгібувати реакцію аутоокиснення адреналіну в лужному середовищі.

Оцінка антиоксидантних властивостей хімічних сполук проводиться за накопиченням проміжного продукту окиснення адреналіну, який реєструється при довжині хвилі 347 нм. Накопичення цього продукту проходить протягом 3-5 хв. від моменту додавання в лужний розчин низьких концентрацій адреналіну (230 мкМ), що дозволяє використовувати готову аптечну форму 0,18 % розчину адреналіну гідротартрату чи 0,1 % адреналіну гідрохлориду. Для створення лужного середовища використовується 0,2 М розчин карбонатного буферу, pH=10,65. Інтенсивність реакції залежить від значення pH, при більш низьких значеннях реакція аутоокиснення адреналіну значно уповільнюється.

Реактиви.

Для проведення дослідження антиоксидантних властивостей флороглюцинолу в реакції аутоокиснення адреналіну використовувались наступні реактиви: 0,18 % р-ну адреналіну гідротартрату (готова аптечна форма) - 230 мкМ; 0,2 M карбонатний буфер, pH=10,65-10,7;флороглюцинолу дигідрат (0,067 г в 10 мл води) - 50, 100, 200 мкМ;аскорбінова кислота (0,07392 г в 10 мл води) - 50, 100, 200 мкМ.

Обладнання та допоміжні матеріали.

Для проведення дослідження використовували наступне обладнання та допоміжні матеріали: УФ-спектрофотометр Optizen POP (Meсasys, Південна Корея); кювета кварцова з товщиною оптичного шару 1 см; водяний термостат; електрод скляний комбінований ЕСК-10603 разом з електронним перетворювачем (pH-метр); одноканальні автоматичні дозатори 50, 200, 1000 мкл; розчин перекису водню - 6%, спирт ізопропіловий; таймер.

Визначення антиоксидантної активності флороглюцинолу в реакції аутоокиснення адреналіну.

Проведення досліду.

Вносимо в кювету 2 мл 0,2 М карбонатного буферу, pH=10,7; додаємо 10 мкл р-ну флороглюцинолу дигідрату; додаємо 100 мкл 0,18 % р-ну адреналіну гідратартрату; вимірюємо зміну оптичної густини р-ну проти 0,2 М карбонатного буферу при довжині хвилі 347 нм протягом 5 хв.; вимір повторюємо три рази; попередньо термостатуємо реагенти при температурі 25 °С; необхідно провести три виміри для кожного розчину флороглюцинолу з концентраціями 50, 100 та 200 мкМ; паралельно проводимо дослід з додаванням 10 мкл аскорбінової к-ти як стандарту порівняння з концентрацією 50, 100 та 200мкМ у пробі.

Параметри досліду: довжина хвилі - 347 нм; час - 5 хвилин; інтервал -15 секунд.

В результаті проведеного досліду було порівняно швидкість реакції утворення проміжного продукту аутоокиснення адреналіну в умовах відсутності ймовірного антиоксиданту та його присутності в концентрації 50, 100 та 200 мкМ в системі. Для оцінки антиоксидантної активності було використано стандарт порівняння - аскорбінова кислота, яка додавалась в систему в концентраціях 50, 100 та 200 мкМ.

Кількісне вираження швидкостей реакції здійснювалось через розрахунок спостережуваної константи швидкості першого порядку (Кн1) за формулою (2.1):

, (2.1)

де t - час реакції;

D? - значення оптичної густини після закінчення реакції;

Dt- значення оптичної густини в певний момент часу;

D0 - значення оптичної густини на початку реакції.

Результати розрахунків представлені у таблицях 2.1 та 2.2.

Залежність величин констант першого порядку аутоокиснення адреналіну від концентрацій флороглюцинолу та аскорбінової кислоти наведено на рис 2.1.

Таблиця 2.1. Значення констант швидкості першого порядкуаутоокиснення адреналіну в залежності від концентрації флороглюцинолу в системі

Концентрація флороглюцинолу, мкМ

Kн1, с-1

0

(2,73 ± 0,23) х 10-3

50

(1,99±0,11) х 10-3

100

(1,39±0,1) х 10-3

200

(1,27±0,07) х 10-3

Таблиця 2.2. Значення констант швидкості першого порядкуаутоокиснення адреналіну в залежності від концентрації аскорбінової кислоти в системі

Концентрація аскорбінової к-ти, мкМ

Kн1, с-1

0

(2,73 ± 0,23) х 10-3

50

(0,149 ± 0,002) х 10-3

100

(0,148 ± 0,015) х 10-3

200

(0,148 ± 0,019) х 10-3

Рисунок 2.1 - Залежність величин константи швидкості першого порядку аутоокиснення адреналіну від концентрацій флорглюцинолу та аскорбінової кислоти, мкМ

Обговорення результатів.

Результати проведеного дослідження демонструють, що додавання флороглюцинолу в концентрації 100 мкМ до хімічної redoxсистеми зменшує швидкість реакції окиснення адреналіну вдвічі (Kн1(0)=0(2,73 ± 0,23) х 10-3с-1до Kн1(100)=(1,39±0,1) х 10-3с-1). При цьому збільшення концентрації флороглюцинолу до 200 мкМ не викликає суттєвих змін в протіканні окисно-відновного процесу. ( Kн1(100)=(1,39±0,1) х 10-3с-1 до Kн1(200)=(1,27±0,07) х 10-3с-1). В той же час додавання аскорбінової к-ти до системи в концентрації 100 мкМ ініціювало зменшення швидкості реакції окиснення відносно флороглюцинолу майже в десять разів (Kн1(АК)=(0,148 ± 0,015)х10-3 с-1до Kн1(ФГ)=(1,39±0,1)х10-3с-1).

Виходячи з отриманих експериментальних даних можна зробити висновок, що флороглюцинол володіє помірними антиоксидантними властивостями в хімічних redoxсистемах, які реалізуються через здатність сполуки виступати в якості донора електронів для окисників. Таким чином доцільно проведення подальшого дослідження антиоксидантних властивостей флороглюцинолу на біохімічних та біологічних моделях.

2.2 Визначення антиоксидантних властивостей флороглюцинолу за здатністю інгібувати перекисне окиснення ліпідів ex vivo

Матеріали та методи дослідження.

Дослідження рівню перекисного окиснення ліпідів проводилось, базуючись наметоді визначення кількості продуктів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [75]. Метод є непрямим та ґрунтується на здатності ТБК реагувати з малоновим діальдегідом (МДА), проміжним продуктом етапу ензиматичного окиснення арахідонової к-ти та кінцевим продуктом окисної деградації ліпідів. Принцип метода - визначення інтенсивності забарвлення, яке утворюється в ході реакції між МДА та ТБК, що протікає в кислому середовищі та при високій температурі. В результаті реакції утворюється триметиновий комплекс, який має характерний спектр поглинання з максимумом при л= 535 нм.

Реактиви.

Реактиви, необхідні для проведення визначення рівню перекисного окиснення ліпідів: контрольна сироватка ЛІОНОРМ ГУМ Н (Чехія, Erba Lachema s.r.o.), виготовлена з сироватки людини у вигляді ліофілізату; розчин ортофосфорної к-ти, 2%, pH 1,3; розчин ТБК 0,8%; н-бутанол; флороглюцинолу дигідрат (0,0172 г в 10 мл води).

Обладнання та допоміжні матеріали.

Для проведення дослідження використовувалось наступне обладнання та допоміжні матеріали: УФ-спектрофотометр OptizenPOP (Meсasys, Південна Корея); кювета з товщиною оптичного шару 1 см; водяний термостат; водяна баня; центрифуга лабораторна; одноканальні автоматичні дозатори 50, 200, 1000 мкл; розчин перекису водню - 6%, спирт ізопропіловий; електрод скляний комбінований ЕСК-10603 разом з електронним перетворювачем (pH-метр);таймер.

Визначення рівню перекисного окиснення ліпідів в сироватці.

Проведення досліду: в 50 мкл відновленої сироватки термостатуємо при 37 °С протягом 1 години; до 50 мкл попередньо відновленної сироватки додаємо 10 мкл р-ну флороглюцинолу дигідрату (що дорівнює концентрації 100 мкМ у пробі); в контрольну пробу вносимо 50 мкл води дистильованої; контрольну пробу до 50 мкл води дистильованої додаємо 10 мкл р-ну флороглюцинолу дигідрату; додаємо 0,75 мл 2% ортофосфорної к-ти (pH=1,3); вносимо 0,25 мл 0,8% ТБК; витримуємо пробу впродовж 45 хвилин при температурі 100 °С; охолоджуємо суміш; екстрагуємо продукт реакції 3 мл н-бутанолу; проводимо розділення водної та органічної суміші центрифугуванням при 1500 об./хв.протягом 10 хв.; вимірюємо оптичну густину бутанольних екстрактів проти н-бутанолу при л= 535 нм та л= 515 нм.

Результати досліджень.

Результати отриманих досліджень оцінювались за кількістю утворених продуктів взаємодії ТБК з МДА (продуктом перекисного окиснення ліпідів). Дані щодо зміни оптичної густини відносно додавання в систему флороглюцинолу наведені в таблиці 2.3. Залежність оптичної густини (при л= 535 нм та л= 515 нм) від присутності флороглюцинолу представлено на рис. 2.2 та 2.3.

Таблиця 2.3

Довжина хвилі, нм

К(100)

К

А(100)

А

515

0,005333

0,006667

0,044

0,066667

535

0,006667

0,006667

0,052

0,085333

Значення параметрів в таблиці 2.3:

K(100) - оптична густина контрольної проби (без сироватки) при додаванні флороглюцинолу в концентрації 100 мкМ, од. опт. густини;

К - оптична густина в контрольній пробі, од. опт. густини;


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.