Клинико-иммунологические особенности папилломавирусной инфекции гениталий женщин, протекающей на фоне урогенитального микоплазмоза

Экзофитная кондилома при гистологическом исследовании представляет собой опухолевидное образование древовидной формы, поверхность которого покрыта многослойным плоским эпителием с выраженным папилломатозом, акантозом и паракератозом.

Субклиническая форма ВПЧ-инфекции проявляется в виде различных морфологических изменений плоского эпителия без наружных разрастаний и может быть обнаружена при кольпоскопическом и микроскопическом исследовании ткани [68].

При гистологическом исследовании плоская кондилома представляет собой участок влагалищной части шейки матки, покрытый многослойным плоским или метапластическим эпителием, спаракератозом, дискератозом и погружением некоторых участков в подэпителиальную соединительную ткань (акантоз). В свою очередь соединительно-тканные сосочки с центрально расположенными капиллярами пронизывают толщу эпителия, периодически доходя почти до поверхности эпителиального пласта (именно эти взаимные прорастания и представляют кольпоскопическую картину «мозаика и пунктуация»). При этом в промежуточном слое эпителия встречаются скопления одноядерных и двуядерных клеток с койлоцитозом.

К латентной форме ВПЧ-инфекции относят бессимптомное, т.е. без каких-либо клинических проявлений ВПЧ-носительство, выявляемое с помощью молекулярно-биологических методов.

В настоящее время не вызывает сомнений наличие прямой связи между выявлением высоко онкогенных типов ВПЧ в тканях шейки матки и более высокой степенью тяжести CIN. Таким образом, выявление ДНК ВПЧ при CIN и раке шейки матки, обнаружение койлоцитов, специфичных для цитопатического действия ВПЧ, позволяет отнести это патологическое состояние к ВПЧ-ассоциированным заболеваниям.

Метод ы диагностики ВПЧ-инфекции

В лабораторной диагностике ВПЧ-инфекции применяют почти исключительно ДНК-методы.

Существуют три основные категории лабораторных методов определения ДНК ВПЧ:

* неамплификационные (дотблот, саузерн-блот гибридизация, гибридизация in situ на фильтре и в ткани);

* амплификационные (полимеразная цепная реакция - ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР);

* сигнальные амплификационные (система гибридной ловушки Digene Hybrid Capture System II) [69].

Среди амплификационных методов наибольшее распространение получила полимеразная цепная реакция. Метод имеет большую диагностическую значимость и позволяет идентифицировать отдельные типы ВПЧ.

В диагностике ВПЧ-ассоциированных заболеваний применяют различные методы, как-то:

* клинико-визуальный;

* кольпоскопический;

* цитологический;

* гистологический;

* иммуноцитохимические для обнаружения капсидного антигена ВПЧ;

* электронно-микроскопические для нахождения зрелых вирионов в клетках;

* компьютерная резонансная томография;

* ультразвуковое исследование (УЗИ); и др. [74].

Клинико-визуальный метод является наиболее простым в диагностике ВПЧ-инфекции гениталий. С помощью рутинного осмотра вульвы, промежности, прианальной области, шейки матки и влагалища с использованием теста с раствором Люголя и 3-5 % уксусной кислотой выявляется большинство клинических и субклинических форм инфекции. Однако визуальный метод не позволяет судить о характере и прогнозе течения патологического процесса [75].

Кольпоскопия представляет собой высокоинформативный и недорогой метод диагностики заболеваний шейки матки. Наиболее распространенной является расширенная кольпоскопия, которая включает осмотр и ревизию состояния слизистой оболочки шейки матки, влагалища и вульвы при увеличении микроскопа в 7-30 раз и применении некоторых эпителиальных тестов, при которых оценивается реакция тканей в ответ на их обработку различными медикаментозными средствами. Для более детального осмотра сосудистой сети применяются различные фильтры [76].

Диагностика типичных экзофитных кондилом не представляет особых трудностей. Кольпоскопически они имеют характерный вид с пальцеобразными выпячиваниями и наличием петли сосуда в каждом из них. Большие трудности вызывает диагностика субклинических форм папилломавирусной инфекции и выявление кольпоскопических признаков, характеризующих вирусные поражения слизистой оболочки шейки матки, влагалища и вульвы. Это сложно еще и потому, что участки ВПЧ-инфекции могут сочетаться с другими доброкачественными и злокачественными образованиями эпителия. В связи с большим разнообразием проявлений субклинической инфекции специфического комплекса кольпоскопических признаков нет. Точно диагностировать внутриэпителиальные кондиломы с помощью только кольпоскопического метода возможно только при выраженном ороговении или при сочетании плоских форм кондилом с экзофитными.

С помощью только кольпоскопии весьма трудно отличить зоны доброкачественной ВПЧ-инфекции и CIN.

Достоинством кольпоскопии, несмотря на ее неспецифичность, является возможность выявления различных типов эпителия, оценки размеров и качества патологических образований, состояния сосудистого рисунка, качества шеечных желез и возможность прицельно произвести биопсию ткани с наиболее атипически измененных участков [77].

Общепринятым и широко распространенным на сегодняшний день методом выявления цервикальной онкологической патологии является цитологический анализ мазка. Однако длительный опыт его использования в России, Беларуси и ряде других стран мира показал, что данный метод не лишен ряда существенных недостатков. К ним могут быть отнесены сложность исполнения, необъективность трактовки результатов, сложность стандартизации и высокие требования к квалификации врача-цитолога. Результатом этого становится низкая воспроизводимость (конкорданс результатов от 11 до 80 %) и низкая чувствительность метода (40-60 %), что не может соответствовать требованиям, предъявляемым к скрининговым тестам [78].

Гистологический метод диагностики ВПЧ-инфекции мог бы служить золотым стандартом диагностики вируса папилломы человека, однако высокая стоимость, невозможность частого проведения, не всегда точный прицельный забор материала ограничивают его использование. При этом четкие признаки ВПЧ-инфицирования не всегда понятны даже при гистологическом исследовании, особенно при дифференцировке картины CIN и ВПЧ-инфекции, которые часто сопровождаются воспалительным процессом [79,80].

Серологические тесты (определение антител в крови) пока не имеют клинического значения, поскольку антитела к ВПЧ появляются только у 7-70 % инфицированных.

Методы иммуноферментного анализа, направленные на определение онкобелка Е7 в цервикальном материале как маркера, свидетельствующего о начавшимся процессе малигнизации эпителиальных клеток, содержащих интегрированную копию генома ВПЧ, в настоящее время слишком трудоемки для клинических лабораторий [81].

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика больных

Работа выполнена на базе МУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер №1» г.Ульяновска, на кафедре инфекционных и кожно-венерических болезней ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» в период 2008-2012 г.г.

При организации исследования были учтены международные требования, предъявляемые к работам подобного рода: репрезентативность по возрастным и половым характеристикам и достаточный объем выборок.

Программа исследования состояла из нескольких этапов:

- отбор пациентов и включение их в исследование;

- оценка исходных клинико-лабораторных данных;

- выявление особенностей течения папилломавирусной инфекции в сочетании с микоплазмозом;

- характеристика иммунологического статуса пациентов;

- изучение микробного пейзажа репродуктивной системы и биологических свойств микоплазм, выделенных у больных папилломавирусной инфекции;

- статистическая обработка полученных данных.

В исследование были включены 347 женщин с папилломовирусной инфекцией, вызванной ВПЧ низкого онкогенного риска, которые находились на лечении в МУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер №1» г.Ульяновска.

Критериями включения больных в исследование являлись: женский пол, наличие генитальной папилломовирусной инфекции, вызванной ВПЧ низкого онкогенного риска, возрастные группы, информированное согласие пациента.

Среди обследованных ВПЧ 6 типа выявлен у 218 женщин (62,8%), 11 типа - у 121 (34,9% ) и 42 типа - у 8 пациенток (2,3%).

В исследование не включали пациенток с ВПЧ высокого онкогенного риска, с сочетанием ВПЧ высокого онкогенного и низкого онкогенного риска, с цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN) Ш степени многослойного плоского эпителия по данным цитологического исследования, а также женщин с положительными результатами исследований на сифилис, ВИЧ и гепатиты.

ПВИ наблюдалась в виде моноинфекции у 108 пациенток (31,1%), у остальных больных (239 женщин) она был ассоциирована с другими урогенитальными инфекциями: микоплазмозом - у 42,3%, хламидиозом - у 22,6%, уреаплазмозом - у 9,6%, герпесвирусной инфекцией - у 12,1% и кандидозом - 10,5% пациенток. Реже папилломавирусная инфекция сочеталась с гонореей (1,7%) и трихомониазом (1,2%) (табл.1).

Таблица 1

Сопутствующие урогенитальные инфекции у больных ПВИ (n=239)

№ п/п	Сопутствующие инфекции	Количество больных
		абс.	%
	Микоплазмоз	101	42,3
	Хламидиоз	54	22,6
	Уреаплазмоз	23	9,6
	Герпесвирусная инфекция	29	12,1
	Кандидоз	25	10,5
	Трихомониаз	4	1,7
	Гонорея	3	1,2
Всего:	239	100

Частое сочетание ПВИ с другими возбудителями урогенитальной патологии бактериальной и вирусной природы и их ассоциаций выявлены у 63,6% обследованных (133 женщины): с одной инфекцией - у 49,8%, двумя - 31,4%, тремя и более - у 18,8%.

Пациентки с сочетанием двух (кроме ПВИ+УМ) трех и более возбудителей ИППП были исключены из дизайна исследования.

В связи с тем, что наиболее часто у обследованных женщин папилломавирусная инфекция сочеталась с урогенитальным микоплазмозом, для дальнейшего исследования всех пациенток разделили на 3 группы: в первую группу входили больные ПВИ в сочетании с урогенитальным микоплазмозом (n=101), во вторую группу были включены пациентки с изолированным течением ПВИ (n=108). Группу сравнения составили 52 практически здоровых женщин, репрезентативных по возрасту (третья группа).

2.2 Методы исследований

Всем больным проводилось комплексное обследование, включавшее клиническое обследование больных; выявление урогенитальных инфекций; иммунологические тесты и изучение микроценоза половых органов. Лабораторное обследование включало общеклинические, серологические, бактериологические и вирусологические исследования. Общий анализ крови и мочи проводили по общепринятой методике с определением общепринятых показателей.

Для диагностике ВПИ применяли следующие методы:

· клинико-визуальный (наличие кондилом);

· кольпоскопию, при необходимости дополненную эпителиальными тестами;

· морфологические: цитологические исследования соскоба патологически измененного участка слизистой и гистологического исследования биопсийной ткани с использованием классификации Бетесда (The Bethesda system - TBS, 2001) и общепринятой классификации цитологических картин (Папаниколау, 1947);

· молекулярно-биологические (PCR real-time), позволяющие типировать ДНК ВПЧ и прогнозировать течение заболевания.

2.2.1 Методы клинического обследования

Клиническое обследование пациенток включало оценку анамнестических данных и объективного статуса, общеклинические лабораторные и инструментальные методы исследования, а также цитологическое и гистологическое исследования.

При сборе анамнеза большое значение придавали возрасту начала половой жизни, количеству половых партнеров, семейному положению, наличию воспалительных заболеваний урогенитального тракта.

Лабораторное обследование включало общеклинические, серологические, бактериологические и вирусологические исследования. Общий анализ крови и мочи проводили по общепринятой методике с определением общепринятых показателей.

Форму ПВИ (клиническая, субклиническая и латентная) определяли в соответствии с классификацией ВПЧ-ассоциированных поражений нижнего отдела гениталий (С.И. Роговская, 2005).

Для объективной оценки состояния слизистой оболочки влагалища, шейки матки и выявления субклинической формы ПВИ проводили кольпоскопию, которая позволяла оценить состояние эпителия шейки матки и влагалища, выявить очаг поражения, провести дифференциацию доброкачественных папиллом, осуществить прицельное взятие мазков и биопсии.

В процессе расширенного кольпоскопического исследования с помощью микроскопа проводили осмотр и ревизию состояния слизистой оболочки влагалища и шейки матки использовали эпителиальный тест - симптом жемчужины, позволяющих оценивать реакцию тканей в ответ на их 3-5% раствором уксусной кислоты. При положительном результате этой пробы кондиломы быстро становятся белыми, сосуды сокращаются равномерно, что свидетельствует о доброкачественности процесса. Поверхность доброкачественной папилломы микропапиллярная, а не гладкая как у злокачественной опухоли.

Кольпоскопию (расширенная кольпоскопия в условиях 15- и 30-кратного увеличения, кольпоскопия с цветными фильтрами) осуществляли при помощи кольпоскопа фирмы Olympus Optical CO.LTD, модель OCS-3 (Япония). Оценку результатов проводили на основании международной терминологии кольпоскопических терминов, принятой на 7 Всемирном конгрессе патологии шейки матки и кольпоскопии (Рим, 1990, пересмотр Барселона, 2003).

При кольпоскопии оценивали состояние эпителия, стыка различных его типов, состояние желез, рельефа поверхности, подлежащей соединительной ткани, общей архитектуры. Нормальная кольпоскопическая картина характеризовалась многослойным плоским и цилиндрическим эпителием, зоной трасформации. К аномальной картине относили ацетобелый эпителий, мозаику, пунктуацию, наличие атипических сосудов. При выявлении очагов атипичного эпителия оценивали его локализацию, площадь и края поражения, степень выраженности аномальных признаков, сосудистый рисунок, интенсивность и равномерность окраски эпителия после обработки растворами уксусной кислоты и Люголя. Участки с выявленными атипичными отклонениями подлежали прицельной биопсии.

Цитологическое исследование мазков проводили по Папаниколау (PAP - smear test) Цитологическое исследование мазков по Папаниколау позволило определять следующие результаты:

* 1-й класс - атипические клетки отсутствуют, нормальная цитологическая картина;

* 2-й класс - изменение клеточных элементов обусловлено воспалительным процессом на слизистой;

* 3-й класс - имеются единичные клетки с изменениями соотношения ядра и цитоплазмы, диагноз недостаточно ясен, требуется повторная цитология или необходимо гистологическое исследование биоптированной ткани для изучения состояния шейки матки;

* 4-й класс - обнаруживаются отдельные клетки с признаками злокачественности, а именно с увеличенными ядрами и базофильной цитоплазмой, неравномерным распределением хроматина;

* 5-й класс - в мазке имеются многочисленные атипические клетки.

Мазки для цитологического исследования брали с поверхности экзоцервикса и влагалища шпателем, а из эндоцервикса - щеткой-эндобрашем под контролем кольпоскопа. Материал наносили на специально обработанное, обезжиренное стекло, которое помещали для фиксации мазка в смесь Никифорова на 20 минут с последующей его окраской по Романовскому-Гимзе и гематоксилин-эозином. Оценку результата цитологического исследования проводили на основании классификации Папаниколау (модифицированной) и Терминологической системы Бетесда ТВС (the Terminology Bethesda system), предложенной в 1988 году и пересмотренной в 1992 и 2001 годах.

При исследовании выявляли наличие койлоцитов, образующихся в тканях в результате цитопатического эффекта ВПЧ и представляющих собой клетки плоского эпителия промежуточного типа с увеличенными в разной степени ядрами, неровной складчатой мембраной и гиперхроматозом. Цитоплазма в этих клетках сохранялась только в периферических отделах, с характерной обширной околоядерной зоной просветления за счет дегенеративных изменений и некроза разрушенных цитоплазматических органелл. Цитологически эти клетки окрашивались оксифильно. Вокруг ядра имелась зона просветления, в цитоплазме - множество вакуолей, содержащих вирусные частицы. По периферии койлоцитов в ряде случаев обнаруживались цитоплазматические фибриллы.

Гистологические методы диагностики ПВИ позволяют оценить морфологическую степень изменения тканей при наличии ПВИ, выполнялись под контролем кольпоскопа. Забор материала проводили путем биопсии. Показанием для проведения биопсии шейки матки являлись кольпоскопические изменения. Забор образца ткани производили из наиболее измененного участка при помощи специальных биопсийных щипцов - конхотомов и сравнивали с образцом неизмененной ткани. Полученный материал сразу фиксировали и проводили традиционное гистологическое исследование с последующей окраской гематоксилин-эозином в патологоанатомической лаборатории МУЗ «Областная клиническая больница» г. Ульяновска. Процедура выполнялась в амбулаторных условиях под внутривенным обезболиванием препаратом «диприван».

При учете результата гистологических исследований учитывали следующие категории ЦИН:

* ЦИН I (лёгкая дисплазия) определяется тогда, когда эпителий шейки матки поражён вглубь на одну треть его толщины,

* ЦИН II (умеренная дисплазия) - эпителий шейки матки поражён на глубину не более двух третей.

* ЦИН III (выраженная дисплазия или рак in situ) - эпителий шейки матки поражён на глубину более двух третей.

Молекулярно-биологические методы выявления ПВИ

Определение ДНК ВПЧ в вагинальном и цервикальном секрете проводили методом ПЦР в реальном времени с тест-системой «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип FRT» ЦНИИ эпидемиологии (Москва), позволившей выделить типы вируса (Роговская С. И., 2003 - афтореф докт.), а также произвести количественный подсчёт вирусной нагрузки (количество ДНК в препарате). В основе данной методики лежит амплификация хемилюминисцентного сигнала от молекулы зонда при его связывании с геномом вируса.

Материалом для исследования служил соскоб из цервикального канала, уретры, поверхности кожи и слизистой, а также с поверхности экзофитной кондиломы. Все пациентки были обследованы методом ПЦР real time с определением 6 низкоонкогенных типов ВПЧ (6, 11, 42, 43, 44) и количественным подсчётом вирусной нагрузки (количество ДНК в препарате).

Следует отметить, что ДНК ВПЧ удалось обнаружить не у всех женщин, несмотря на очевидные клинико-морфологические признаки инфекции. Поэтому в исследование были взяты пациентки только с положительными результатами выявления ДНК низко онкогенных ВПЧ при помощи ПЦР.

Лабораторные методы выявления урогенитальных инфекций

С целью лабораторной диагностики урогенитальных инфекций использовали комплекс методов, направленных на детекцию самого микроорганизма (прямые методы) или определение специфической реакции пациента, служащей маркером бессимптомного носительства или инфекции - непрямые методы (Макаров О.В. и соавт., 2007).

Выявление урогенитального микоплазмоза

Для выявления микоплазм использовали прямой вариант МФА с контрастированием фона, культуральный метод и ПЦР.

При выполнении МФА приготовленные из исследуемого материала мазки фиксировали в ацетоне 10 мин. и окрашивали 15-20 мин. при 37о С люминесцирующим иммуноглобулином к микоплазмам во влажной камере. Затем стекло промывали дважды по 10 мин. в фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4), ополаскивали дистиллированной водой, высушивали и изучали в люминесцентном микроскопе. Микоплазмы выявлялись в виде ярко-зеленого свечения на красноватом фоне препарата (Медицинская микробиология, 2002. Под ред. А.М.Королюка, В.Б.Сбойчакова).

При выделении микоплазм бактериологическим методом производили посев исследуемого материала в универсальную жидкую транспортную среду (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г. С.-Петербург) с последующим пересевом в среду «Микоплазма-50» (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера г., С.-Петербург) и среды, содержащие лошадиную сыворотку, дрожжевой экстракт и пенициллин из расчета 1000 ед./мл (BioMeriox, Франция). Положительным результатом после инкубирования в течение 14 суток считалось наличие микоплазм в количестве более 104 КОЕ/мл (Дмитриев Г.А., 2007). Идентификацию чистых культур микоплазм осуществляли по культурально-ферментативным и антигенным признакам.

Для обнаружения микоплазм помимо культурального метода использовали полимеразную цепную реакцию. Для этого применяли готовые наборы Полимик-МК (НПФ «Литех», г. Москва).

Выявление урогенитального уреаплазмоза

С целью диагностики урогенитального уреаплазмоза (А63.8) использовали вариант МФА с контрастированием фона. Приготовленные из исследуемого материала мазки после фиксации окрашивали люминесцирующим иммуноглобулином против Ureaplasma urealyticum и изучали в люминесцентном микроскопе. Возбудители выявлялись в виде ярко-зеленого гранулярного свечения на мембранах эпителиальных клеток и в межклеточном пространстве на красноватом фоне препарата (Кисина В.И., 2005; Кисина В.И., Забиров К.И., 2005).

Для индикации уреаплазм применяли также традиционный культуральный метод диагностики - культивирование уреаплазм на специальных питательных средах, содержащих сыворотку и дрожжевой экстракт (рН среды менее 7,0) при 370 С с последующей их идентификацией.

Наиболее эффективным методом диагностики уреаплазмоза является ПЦР (Макаров О.В. и соавт., 2007). Основными мишенями для амплификации при выявлении уреаплазм являлись гены уреазы. При положительной ПЦР фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос. Использовали комплект «АмплиСенс» вариант FER для ПЦР-амплификации ДНК.

Выявление урогенитального хламидиоза

Материалом для обнаружения урогенитального хламидиоза (А56.0) служили соскобы эпителия слизистой уретры, цервикального канала, из которых готовили мазки (Коршунов В.М. и соавт., 1999). Часть мазков окрашивали по Романовскому-Гимзе для выявления внутриклеточных включений, остальные использовали для прямого варианта МФА, при котором антитела, меченые флюорохромом образуют соединения со специфическим антигеном, наблюдаемые в люминесцентном микроскопе (Савченко Т.Н., Гиммельфарб Е.И., Дугиева М.З., 2004). В тест-системе прямого МФА использовали овечью хламидийную антисыворотку, меченую флюоресцином изотиоцинатом, и для контрастирования фона - бычий альбумин, меченый родамином (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АН РФ) (Приказ М3 РФ №936. 1995 г.).

С целью выявления в сыворотке крови больных специфических антител использовали ИФА, который проводили с использованием тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Беднова В.Н. и соавт., 1998).

Идентификация урогенитального герпеса

Идентификацию урогенитального герпеса (А76.0) проводили по характерным поражениям слизистой оболочки и кожи, подтвержденным выявлением антигенов и антител (Сметник В.П., Тумилович Л.Г., 2005). Материалом для исследований служили отделяемое уретры, влагалища, шейки матки (Сидорова И.С., 2003). Выявление антигенов ВПГ-2 проводили с помощью иммуноферментной моноклональной тест-системы «ВПГ-2-тест» - «сэндвич» - вариантом ИФА. Для этого исследуемые и контрольные образцы вносили в лунки планшета для ИФА, которые предварительно иммобилизировали моноклональными к ВПГ-2 антителами. Далее в лунки вносили конъюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена. На заключительном этапе вносили субстратный раствор. Окрашивание раствора в лунках свидетельствовало о наличии антигенов ВПГ-2 в исследуемом материале. В стадии ремиссии у больных проводили выявление антител к ВПГ-2 с помощью тест-системы «Герпес-скрин» с использованием перекиси водорода, приобретающего окраску от светло-желтого до оранжево-коричневой. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антител к ВПГ в образце.

Наиболее точным и современным методом диагностики герпетической инфекции является полимеразная цепная реакция (Краснопольский В.И. и соавт., 1999). Для определения ДНК ВПГ методом ПЦР из образцов крови пациентов ДНК исследовали в ПЦР с наружными праймерами, затем продукт амплификации изучали в повторной ПЦР с внутренними праймерами. Продукты реакции визуализировали электрофорезом в 6% полиакриламидном геле и окрашивали бромистым этидием.

Диагностика урогенитального кандидоза

Урогенитальный кандидоз (В37.4) диагностировали путем выделения культуры возбудителя из исследуемого материала (мазок из влагалища) на среде Сабуро с последующей идентификацией, микроскопии данного патологического материала и выявления специфических антител в сыворотке крови больных с помощью твердофазного варианта ИФА с использованием иммуноферментного анализатора (NIHON Konden). Учёт результатов ИФА проводили путём определения оптической плотности проб, соответствующих разведений сыворотки пациента в лунках титровального полистерольного планшета ТУ 62-2 375-86. Длина волны зондирующего излучения 490-492 нм.

Диагностика трихомониаза

Диагностику трихомониаза проводили путём микроскопии нативных и окрашенных метиленовым синим или по Романовскому-Гимзе препаратов (О.К. Поздеев, 1999; B.A. Paterson et al., 1998). Специфические антитела в сыворотке крови больных определяли ИФА, для чего использовали набор реактивов для ИФА-диагностики трихомоноза ЗАО “Вектор-Бест”.

Диагностика гонореи

Диагностику гонореи проводили бактериоскопическим (окраска метиленовым синим, по Граму), бактериологическим методами (П.О. Дэвис и др., 1999). Материалом для исследований служили отделяемое уретры, влагалища, шейки матки, осадок мочи, сперма, сок предстательной железы. При необходимости для выявления специфических антител в сыворотке крови больного ставили реакцию связывания комплемента (РСК) - реакцию Борде-Жангу (Приказ М3 РФ №936. 1995 г.).

Молекулярно-генетическое выявление маркеров патогенности микоплазм

У выделенных микоплазм выявляли нуклеотидные последовательности генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности методом полимеразной цепной реакции (МУ 1.3.2569-09). Для этого проводили выделение бактериальной ДНК.

Выделение бактериальной ДНК

Бактериальную ДНК выделяли из культур, выросших на питательных средах, методом аффинной сорбции, основанной на предварительном лизировании исследуемого образца с последующим сорбированием ДНК на нуклеосорбенте, в качестве которого использовали двуокись кремния. Отбор проб микоплазм проводили в одноразовые полипропиленовые пробирки «Эппендорф» объемом 1,6 мл.

Материал из колоний микоплазм помещали 500 мкл стерильного 0,9% NaCl, осаждали при 12000 об./мин на центрифуге «Эппендорф» (Cyclotemp-202, Россия). Осадок ресуспендировали и разводили в буфере, содержащем 2,5mM MgCl2 0,01% желатин, до конечной концентрации 104 КОЕ/мл. Культуры лизировали при помощи коммерческого набора «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Москва) для термического клеточного лизиса. Хранение образцов перед использованием осуществляли при 4оС.

Выделение ДНК микоплазм проводили с использованием оптимизированных коммерческих наборов: «Проба ГС» и «Проба НК» (ООО «ДНК-Технология», Москва), «Пробоподготовка универсальная для выделения ДНК» (ООО «ИзоГен», Москва), «ДНК-Экспресс», «Выделение ДНК из биопроб» (НПФ «Литех», Москва) и «ДНК-сорб-А-М - вариант 100» («ИнтеЛабСервис», Москва).

Таблица 2

Использованные в работе праймеры

Ген	Фактор патогенности	Пары праймеров (прямой и обратный)	Размер ампликона н.п.
Праймер M. hominis
4	P-120-адгезия	5' TGCGGTTCTTCCTTTGATTGCTAGTT 3' 5' GGGTTTTGCTGFFGGATGCTACCAG 3'	527

Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ в Gene Runner Version 3.05 и Primer Blast (ресурсы GeneBank) (США). Праймеры микоплазм были синтезированы в «ЗАО Симтол» (Москва) (табл.2).

Амплификация ДНК

Синтез ДНК осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» (ДНК Технология, Москва). Для проведения амплификации была использована коммерческая стандартная лиофилизованная реакционная смесь с оптимизированной для классической схемы ПЦР буферной системой (ООО «ИзоГен», Москва), «Набор реагентов для проведения ПЦР-РВ с Taq-ДНК-полимеразой и ингибирующими активность фермента антителами в присутствии красителя SYBR Green I» (Компания «Синтол», Москва). Проведение амплификации состояло из трех этапов: денатурации ДНК при 94єС, отжига праймеров на денатурированной ДНК и элонгации - синтеза новой цепи с помощью фермента Taq-ДНК-полимеразы, наибольшая активность которого проявляется при 72єС.

Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК применяли классический тип протокола ПЦР (табл. 3).

Таблица 3

Использованные режимы амплификации

Гены	Температурный режим, Сє	Время	Количество циклов
Предварительный нагрев	94	2 мин	1
P-120	72	20 сек	1
Окончательный результат	72	1 мин	1

1- пауза (предварительный нагрев амплификатора для «горячего старта» (общая денатурация ДНК))

инфекция папилломавирусный хламидиоз патология

Детекция результатов ПЦР

Для проведения электрофоретической детекции продуктов амплификации ПЦР были использованы готовые 2,3% агарозные гели с навеской буферной смеси (Трис-боратной).

Регистрацию результатов ПЦР осуществляли путем электрофоретического разделения продуктов амплификации на окрашенном бромистом этидием агарозном геле. Определение длины амплификонов производили учитывая зависимость между длиной фрагмента и величиной, обратной его подвижности. Основное соотношение между длиной фрагмента (L) и величиной, обратной его подвижности (m) выражается как m x L = c или (mj-mo) = c, что можно представить следующим образом:

где Lj - размер неизвестного фрагмента, Lo - размер стандартного фрагиента, mj - подвижность неизвестного фрагмента, mo - подвижность известного фрагмента, С - константа. Lна этапе детекции продукты амплификации ПЦР (20мкл) анализировали электрофоретически, для чего были использованы готовые агарозные гели, содержащие 2,3 % агарозы и бромистого этидия.

Анализ электрофореграмм проводили с помощью видеосистемы Gel Imager и программного обеспечения Gel Analyzer. Эта система позволяла документировать и обрабатывать видеоизображение фореграмм в УФ-излучении 254 нм.

Иммунологические методы

Содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови

Количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови определяли с помощью автоматического гематологического анализатора (Cell-Dyn 3700), который оценивает размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики клеток. В анализаторах серии Cell-Dyn для дифференцировки лейкоцитов применяется технология MAPSS - Multi Angle Polarized Scatter Separation (мультипараметрическая система лазерного светорассеивания) регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами (Луговская С.А. и соавт., 2006). Принцип этого метода заключается в компьютерном анализе дисперсии лазерного счета клетками крови. Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах, как: размер клеток, структура и степень сложности клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, оценка формы клеточного ядра.

Анализ клеток происходит в проточной кювете при пересечении луча лазера длиной 633 нм. После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеивание последнего под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Данные сигналы улавливаются фотоумножителями. На основании полученных сигналов все клетки распределяются по соответствующим кластерам в соответствии с их размером, структурой и количеством ДНК. Таким образом, происходит дифференцировка лейкоцитов на популяции.

Определение субпопуляций лимфоцитов и их функциональной активности

У больных исследовали мембранные маркеры субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+ лимфоциты) с помощью моноклональных антилимфоцитарных антител к дифференцировочным антигенам поверхности клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции (Козинец Г.И. и соавт., 2002). С этой целью использовали диагностикумы ООО «Сорбент» для проточного цитометра (фитц-меченные моноклональные а/т).

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ)

Изучение функциональной активности иммуноцитов проводили в реакции торможения миграции лейкоцитов in vitro по А.Г. Артемовой (1973), т.к. происходит выделение белкового биологически активного продукта - МИФ (миграцию ингибирующим фактором). По степени торможения миграции лейкоцитов судили о лимфокинпродуцирующей способности лимфоцитов.

Учет миграции лейкоцитов проводили с помощью шкалы окуляра-микрометра, считая от их исходного положения до границы миграции основной массы клеток. Величину индекса миграции (ИМ) определяли по формуле:

,

где процент миграции составил ИМ•100%

Среднюю величину определяли при постановке опыта в 5 капиллярах системы Перфильева-Габбе. Степень угнетения Т-системы при усилении миграции лейкоцитов определяли исходя из величины процента миграции лейкоцитов здоровых людей.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ)

Функциональную активность всего пула Т-лимфоцитов оценивали по способности лимфоцитов переходить в лимфобласты под влиянием неспецифической стимуляции митогеном (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978). Степень функциональной активности лимфоцитов, их готовность к стимуляции определяли по проценту лимфоцитов, претерпевших бласттрансформацию при трехдневном культивировании в присутствии митогена. Для этого готовили мазки (окраска по Романовскому-Гимзе) и производили подсчет отдельно количество малых лимфоцитов (диаметр клеток 7-7,5 мкм), бластоподобных переходных форм (диаметр клеток 8-14 мкм) и бластов (диаметр клеток более 14 мкм).

Определение количества Т-лимфоцитов методом спонтанного

розеткообразования с эритроцитами барана (Еа-РОК) (Jondal M., 1997)

Феномен розеткообразования заключается в способности Т-лимфоцитов человека спонтанно адсорбировать эритроциты барана. Клетки, образующие розетки с эритроцитами барана, в литературе обычно называют сокращенно Еа-РОК (Еа - эритроцит, РОК - розеткообразующая клетка). За РОК принимают лимфоцит, присоединивший 3 и более эритроцита. Количество Еа-РОК соответствует количеству зрелых Т-лимфоцитов.

Определение проводили, смешивая 1% смесь отмытых эритроцитов барана, 0,6% раствор глютарового альдегида, краску Романовского, 0,01 М раствор теофиллина, среду 199 Хенкса, 1% раствор бычьего альбумина, раствор фиколла-400, раствор уротраста, 3% раствор уксусной кислоты и 0,2% раствор трипанового синего.

Далее готовили стандартную взвесь лимфоцитов 2?109 клеток в 1 мл, в центрифужную пробирку вносили 0,1 мл взвеси лимфоцитов и 0,1 мл 1% взвеси эритроцитов барана, полученную смесь перемешивали. Смесь инкубировали 10 мин. при температуре 370 С, затем центрифугировали 5 мин. при 1000 об./мин. После этого клетки помещали на 2 часа в холодильник при температуре 40 С. Затем клетки аккуратно ресуспендировали и в камере Горяева определяли процент РОК.

Сывороточные иммуноглобулины

Количественное определение иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле агарозы (Галицкий Я.Д., 1987).

Вероналовый буфер (1,84 г веронала и 0,34 г едкого натра и 200 мл дистиллированной воды) смешивали с гелем агарозы (агароза 3,6 г), после чего кипятили в течение 10-15 мин. на водяной бане до полного расплавления агара и получения прозрачного геля. Расплавленный агар разливали по 21 мл в подогретые стеклянные цилиндры, которые закрывали пробками и помещали на водяную баню с температурой 56-580 С. Ампулу моноспецифичной сыворотки с рабочим титром 1:20-1:30 разводили в 1 мл вероналового буфера, выливали в соответствующий цилиндр, перемешивали и 10-15 мин. выдерживали в водяной бане.

Стеклянные пластины размером 9x12 см протирали эфиром, помещали на строго горизонтальную поверхность и подогревали. На середину пластины из цилиндра выливали расплавленный агар, содержащий моноспецифическую сыворотку. С помощью круглого штампа по трафарету в геле вырезали лунки.

Исследуемую сыворотку вносили в лунки до исчезновения вогнутого мениска. Каждую сыворотку вносят в лунки агаровых пластин, содержащих моноспецифическую сыворотку. В 4 лунки агаровой пластины вносили цельную и разведенную в 2, 4, 8 раз стандартную (эталонную) сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов всех классов.

После внесения исследуемых сывороток пластины помещали во влажную камеру и инкубировали в течение 24 часов (для определения Ig A и Ig G) или 48 часов (для определения Ig M). После инкубации пластины извлекали из влажной камеры и окрашивали красителем бромфеноловым синим.

Для оценки результатов реакции измеряли диаметр образовавшихся вокруг лунок колец преципитации. Затем на полулогарифмической бумаге наносили на оси абсцисс диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат - известную концентрацию каждого класса иммуноглобулинов в (г/л) и строили калибровочный график, с помощью которого вычисляли содержание иммуноглобулинов в каждой исследуемой сыворотке.

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)

Определение производили с помощью метода, основанного на способности полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 в низких концентрациях (3,5%) растворять свободные иммуноглобулины и преципитировать иммунные комплексы (Гриневич Ю.А., Алферов А.Н., 1981). Исследуемую сыворотку инкубировали в течение 18 часов с 7% раствором ПЭГ, затем центрифугировали при 20000g на рефрижераторной центрифуге УРВ-1. Осадок растворяли в 5 мл 0,1% раствора NaOH. Оптическую плотность определяли на СФ-26 при длине волны 280 нм в кюветах 10 мм против 0,1 Н NaOH, оптическая плотность принималась за 100% шкалы пропускания. Позитивным считали тест, если оптическая плотность исследуемого образца составляла 0,12 и более. Для определения концентрации белка строили калибровочную кривую, где на оси ординат отмечали оптическую плотность раствора, а на оси абсцисс - содержание белка в мг. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Концентрацию иммунных комплексов рассчитывали на 1 мл цельной сыворотки.

Метод определения фагоцитарной реакции лейкоцитов крови

Оценку функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводили в тесте с микробной тест-культурой (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Фагоцитарная активность лейкоцитов определялась при помощи процентного отношения активных, участвовавших в фагоцитозе лейкоцитов, к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

Фагоцитарный индекс определялся средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит. Фагоцитарный индекс характеризует интенсивность фагоцитоза. Для определения фагоцитарного индекса использовали те же мазки, по которым определялась фагоцитарная активность лейкоцитов. В препаратах, приготовленных описанным выше способом, подсчитывали не менее 100 лейкоцитов и количество поглощенных ими микробных тел. Вычислялся фагоцитарный индекс путем деления числа фагоцитированных бактерий на число активных лейкоцитов.

Фагоцитарное число является дополнительным показателем, характеризующим как агрессивность лейкоцитов, так и их активность. Вычислялось фагоцитарное число путем деления числа фагоцитированных бактерий на общее число подсчитанных лейкоцитов.

Для определения индекса завершенности фагоцитоза в мерную центрифужную пробирку с 5 мг щавелевокислого натрия вносили 0,5 мл исследуемой крови. После тщательного перемешивания в пробирку добавляли равное количество двухмиллиардной взвеси микроорганизмов. После перемешивания смесь помещали в термостат при 37о С на 30 мин. Затем, несколько капель исследуемой лейкоцитарно-микробной взвеси вносили в чашку Петри с застывшим хорошо подсушенным 2%-ным мясо-пептонным агаром. Засеянные чашки помещали в термостат, при 37о С для выращивания микробов и наступления третьей фазы фагоцитарной реакции, т.е. захватывания микробов фагоцитами. После окончания установленного срока инкубации приступали к изготовлению мазков-отпечатков. Приготовленные мазки-отпечатки высушивали и окрашивали способом Романовского-Гимза.

При микроскопировании препаратов, приготовленных из лейкоцитарно-микробной взвеси, инкубированной в термостате, отчетливо были видны различия между жизнеспособными и нежизнеспособными клетками. Первые характеризовались гигантскими размерами, вторые сохраняли исходную величину. В случаях, когда процесс фагоцитоза носил завершенный характер, внутри лейкоцитов отмечались фрагменты разрушенных клеток, имеющих разнообразную форму и отдельные микробные тела значительно меньших размеров, чем в лейкоцитах с незавершенным фагоцитозом.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Метод основан на цитохимическом выявлении темно-синих гранул диформазана, которые образуются в цитоплазме нейтрофила в результате восстановления нитросинего тетразолия. Эти химические реакции осуществляются благодаря активации кислородзависимой биоцидности фагоцита (Маянский А.Н. и соавт., 1999). Повышенный метаболизм лейкоцитов выступает как донатор электронов бесцветного раствора НСТ, трансформируя формазан в восстановленную форму в виде черных глыбок определяющихся в нейтрофилах крови (Герасимов И.Г., Калуцкая О.А., 2000).

Мазки крови окрашивали дважды: по Паппенгейму (комбинация методов Мая-Грюнвальда и Романовского-Гимзы) и второй раз тетразолиевым нитросиним. В готовом мазке подсчитывали общее число нейтрофильных гранулоцитов и число нейтрофилов, содержащих зерна формазана. Результат выражали в процентном отношении числа активированных нейтрофилов к 100 клеткам нейтрофилов в мазке. Подобная реакция обозначается как спонтанный тест НСТ. Он улавливает такие отклонения в организме, которые не регистрируются общепринятыми лабораторными тестами и другими маркерами. Нарушение кислородзависимых механизмов совпадает с увеличением числа активированных нейтрофилов (Карпищенко А.И., 1999).

Механизм данного теста основан на том, что фагоцитирующие клетки в присутствии фагоцитированного антигена активируют цитоплазматические пищеварительные энзимы, способные разрушить данный антиген. Доказано, что поглощение НСТ является эквивалентом поглощения микробных тел. Как микробные АГ, так и НСТ в присутствии ионов галоидов (йода, брома, хлора) активизирует клеточный метаболизм, вызывает «респираторный взрыв», который сопровождается увеличением потребления кислорода, активизацией гексозомонофосфатного шунта, образованием перекиси водорода и свободных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах. Это дало основание считать НСТ-тест показателем метаболической активности клеток, в частности нейтрофильных лейкоцитов и эквивалентом их фагоцитарной и бактерицидной активности (Зинкин В.Ю., Годков М.А., 2004).

Метод определения активности миелопероксидазы в

нейтрофильных гранулоцитах (Allen R.C., Stephens J.T. Jr., 2011)

Активность миелопероксидазы проявляется при наличии в среде перекиси водорода. Активность фермента определяется по появлению в цитоплазме нейтрофилов (n=100) окрашенного продукта пероксидазной реакции - оксибензидина. Оксибензидин окрашивает места локализации пероксидазы в желто - коричневый цвет, под микроскопами эти участки выглядят как желто-коричневые гранулы. Степень окрашивания цитоплазмы нейтрофилов пропорциональна активности миелопероксидазы.

С целью определения уровня активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах готовили мазки крови, наносили на них инкубационную среду, докрашивали ядра клеток 0,1% раствором нейтрального красного и производили сравнительную оценку результатов по определению средних цитохимических коэффициентов (СЦК) по формуле:

,

где a - количество нейтрофилов без гранул;

b,c,d - количество нейтрофилов с окрашенной цитоплазмой.

Цифры обозначают степень окрашивания цитоплазмы: 0 - цитоплазма не содержит гранул; 1 - слабое окрашивание цитоплазмы; 2 - окрашивание средней интенсивности; 3 - интенсивно окрашенная цитоплазма.

Снижение СЦК свидетельствует о дефектности кислородзависимых антимикробных систем нейтрофила.

Метод определения активности катионных белков нейтрофильных гранулоцитов

Катионные белки лизосом нейтрофилов в нейтральной среде способны связывать анионный краситель бромфеноловый синий. Степень гранулярного синего окрашивания цитоплазмы пропорционально содержанию катионных белков в клетках. Снижение данного показателя свидетельствует о дефектности кислороднезависимой системы нейтрофила (Карпищенко А.И., 1999).

Готовые тонкие мазки крови высушивали, фиксировали их и окрашивали 0,15-ый раствором бромфенолового синего. Затем производили докрашивание ядер 0,1%-ым раствором нейтрального красного. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК):

,

где a - количество нейтрофилов без гранул; b,c,d - количество нейтрофилов с окрашенной цитоплазмой. Цифры, указывающие на интенсивность окраски цитоплазмы: 0 - отсутствие окраски, 1 - наличие в цитоплазме единичных синих гранул; 2 - синие гранулы занимают до 1/3 площади цитоплазмы; 3 - синие гранулы занимают Ѕ площади цитоплазмы.

Методика выявления щелочной фосфатазы

Щелочная фосфатаза (ЩФ) или фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты локализуется в специфических, или вторичных гранулах нейтрофильных лейкоцитов. Отмечается повышение активности ЩФ в нейтрофилах при воспалении, облучении, интоксикации, острых повреждениях тканей, шоке.

Мазки крови фиксировали смесью формальдегид-метанола в течение 30 с. (формальдегид - 10 мл, абсолютный метанол - 90 мл). Затем помещали на 20 мин. при комнатной температуре в инкубационную среду следующего состава: б-нафтил-фосфат натрия - 35 мг, прочный синий RR - 35 мг, трис-буфер, рН 9,6 (вместо пропандиолового буфера) - 35 мг. В 50 мл дистиллированной воды растворяли 2,42 г трис-буфера, добавляли 18,9 мл соляной кислоты, приливали дистиллированную воду до общего объема 100 мл. Докрашивали ядра 0,01% водным раствором азура II и микроскопировали (Ч90, Ч10). Места локализации щелочной фосфатазы определялись в виде гранул коричневого цвета. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК).

При проведении цитохимических исследований применялась оценка результатов по М.Г. Шубич, Б.С. Нагоеву (1980), основанная на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов.

Картина распределения и количества осадка позволила разделить клетки на четыре типа по степени активности фермента: «0» - отсутствие фермента, цитоплазма не окрашена; «1» - слабое диффузное окрашивание, единичные гранулы в цитоплазме; «2» - диффузная окраска с умеренным количеством гранул; «3» - сильно положительная реакция с многочисленными гранулами.

Для определения СЦК количественное выражение результатов проводилось путем подсчета 100 нейтрофилов с их дифференцировкой по описанному выше принципу. Число клеток с одинаковой активностью окраски умножали на цифру, соответствующую данному типу степени активности фермента. Сумма этих произведений, деленная на 100, и представляет собой СЦК для одной клетки:

.

Методика выявления кислой фосфатазы

Кислая фосфатаза (КФ) или фосфогидролаза ортофосфорной кислоты постоянно локализуется в лизосомах или первичных, азурофильных гранулах нейтрофилов. Активность этого гидролитического фермента во многом определяет их функциональную способность. При фагоцитозе отмечается повышение содержания КФ в нейтрофильных лейкоцитах (Шубич М.Г., Нестерова И.В., 1980).

Мазки крови фиксировали при 40С в холодном 10% формалине на 960 спирте в течение 30 с. Переносили мазки на 2 ч. при 370С в инкубационную среду следующего состава: раствор «А»: нафтол-фосфат или (AS-BI) - 20 мг диметилформамид - 0,5 мл, холодный 0,1 н. раствор уксуснокислого натрия (1,36 г уксуснокислого натрия растворяли в 100 мл дистиллированной воды) - 40 мл; раствор «Б»: 2% фуксин для фуксинсернистой кислоты на 1 н. HCI (4,04 мл концентрированной соляной кислоты доводили дистиллированной водой до 50 мл) - 8 капель, 4% раствор азотистокислого натрия - 8 капель. Рабочий раствор: раствор «А» сливали с раствором «Б», перемешивали, отфильтровывали, устанавливали рН 5,2-5,4 (если pH больше 5,4, то подкисляли 1 н. соляной кислотой) и докрашивали ядра 2% раствором метилового зеленого.

В местах локализации кислой фосфатазы отмечалось окрашивание в коричневый цвет. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Определение уровня цитокинов

Количественное определение уровня цитокинов с помощью специфических антител является сегодня самым распространенным способом детекции этих белков (Сенников С.В., Силков А.Н., 2005). Нами применялся набор реактивов фирмы «Bender Medsystems» (Австрия) для определения цитокинов методом проточной цитометрии.

Изучали спонтанную и индуцированную способность лейкоцитов крови секретировать IL-1в, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, фактор некроза опухоли-б (FNO-б) и гамма интерферон (IFN-г). В качестве мутагена использовали ФГА. Для определения продукции про- и противовоспалительных цитокинов постановку ИФА проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя.

Изучение микробиоценоза влагалища

Состояние вагинального микроценоза, количественную и качественную оценку его состава производили в соответствии с Приказом МЗ СССР №535 от 22.04.85. «Об унификации микробиологических методов исследования, применяющихся в клинико-диагностических лабораториях». При диагностике ИППП использовали Приказ № 286 «Об улучшении выявления больных гонорей и трихомониазом в акушерских и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), женских консультациях и урологических кабинетах) и Приказ МЗ.РФ. №415 от 20.08.2003. «Гонокковая инфекция». Идентификацию стафилококков проводили согласно приказу Минздрава России от 28.12.1995 г. № 691 «О профилактике внутрибольничных инфекций в акушерских стационарах г. Москвы».

С целью определения видового состава и биологических свойств микрофлоры производили взятие материала из заднего свода влагалища и цервикального канала. Видовой состав определяли с помощью коммерческих тест-систем фирмы «Лахема (Чехия), набор СИБ для дифференциации коринебактерий, набор №2 СИБ для дифференции энтеробактерий и определителя бактерий Берджи.

Для выделения и идентификации микрофлоры влагалища у обследованных женщин применяли бактериологический метод, при выполнении которого использовали вышеуказанные специальные среды (табл. 2).

Видовую принадлежность микрококков определяли по их способности гидролизировать эскулин с образованием эскулитина и глюкозы (В.П. Саргсяна, 1988) при помощи «Enterotest-1» и «Enterotest-2» (Чехия). Эскулитин связан с цитратом железа, образует комплекс черного цвета, придает характерную черную окраску колониям в соответствии с классификацией Берджи (2004).

При учете результатов посева учитывали интенсивность роста выделенных культур:

I - очень скудный рост - рост только на жидких питательных средах; на плотной питательной среде рост отсутствует.