Работа выполнена на кафедре инфекционных и кожно-венерических болезней Ульяновского государственного университета, на базе Ульяновского областного клинического кожно-венерологического диспансера. Методика клинического обследования женщин с урогенитальным хламидиозом состояла из сбора анамнеза и объективного обследования с помощью дополнительных методов исследования.

При организации исследования были учтены международные требования, предъявляемые к работам подобного рода: репрезентативность по возрастным характеристикам и достаточный объем выборок.

Программа исследования состояла из нескольких этапов:

отбор пациентов и включение их в исследование;

оценка исходных клинико-лабораторных данных;

выявление бактериального пейзажа урогенитального тракта больных урогенитальным хламидиозом;

оценка у больных окислительно-антиоксидантной системы;

характеристика иммунологического статуса;

статистическая обработка полученных данных.

Согласно демографической классификации возрастов (Урланис Б.Ц., 2007) все обследуемые были разделены на 4 возрастные группы: 1 группа (до 25 лет), 2 группа (25-35 лет), 3 группа (36-45 лет), 4 группа (46-55 лет), 5 группа (56 и более лет).

Было обследовано 296 женщин, больных урогенитальным хламидиозом, в возрасте от 19 до 58 лет, при среднем показателе - 29,61,2 года, находившихся на лечении в Областном клиническом кожно-венерологическом диспансере г. Ульяновска в период 2010-2012 гг. (рис.1).

Рис.1. Распределение женщин с урогенитальным хламидиозом по возрасту

Только у 182 обследованных женщин, которые вошли в основную группу исследуемых лиц, этиологическим фактором воспалительного процесса являлись C. trachomatis в виде моноинфекции. У 114 пациенток (38,5%) возбудитель урогенитального хламидиоза был обнаружен в сочетании с возбудителями герпетической инфекции, урогенитального микоплазмоза, остроконечных кондилом, трихомониаза и др. (рис.2).

Рис.2. Хламидийная инфекция у обследованных женщин

В ходе исследований 62 женщин из группы сравнения 10 человек были исключены из исследований, в связи с обнаружением в ПЦР-исследованиях генетических детерминант вирусов герпеса и остроконечных кондилом. Таким образом, в группу сравнения были включены 52 практически здоровых женщины, репрезентативных по возрасту. Все обследования проводили с письменного согласия пациенток. Материал для исследования у всех женщин брали до проведения антибиотикотерапии.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методы детекции видового состава микрофлоры урогенитального тракта женщин. Исследование методом ПЦР в режиме реального времени

С целью идентификации возбудителя урогенитального хламидиоза и других инфекций, передающихся преимущественно половым путем нами использован метод ДНК диагностики микроорганизмов. Из многочисленных модификаций данного метода использовалась полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени (Real-Time PCR). Применялся диагностический комплекс "QIAGEN" (Rotor-Gene, Германия). Для детекции продуктов амплификации использовалась методика 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay), который отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов (Зорина В.В., 2012; Stary A., 2001). Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3' конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5' конце второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида.

При одновременном связывании обоих зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа.

Программное обеспечение, поставляемое с набором оборудования, обеспечивает получение данных в графическом и цифровом формате, удобном для трактовки и хранения результатов.

Методы бактериологическогой диагностики. В ходе исследований также проводилась бактериологическая диагностика, которая основана на выделении хламидий из исследуемого материала путем заражения первичных или перевиваемых клеточных культур (Баткаев Э.А., Липова Е.В., 2004).

Для выделения хламидий клетки линии L-929 выращивали на покровных стеклах, помещенных в плоскодонные пробирки. Посевная доза клеток - 100 тыс. кл. /мл среды. В питательную среду 199 Хенкса добавляли 5% сыворотки крупного рогатого скота. Через 24 часа культивирования клетки должны давать рост в виде монослоя. До инокуляции инфекционного материала клеточный монослой обрабатывался ДЕАЕ-декстраном (30 мкг/мл.) в течение 30 мин.

После инокуляции исследуемого материала на монослой культуральных клеток (по 0,2 мл в 2 плоскодонные пробирки со стеклами, покрытыми клеточным монослоем) применялся метод принудительной адсорбции - центрифугирование при 3000 об. /мин. в течение часа. После центрифугирования неадсорбированный материал удаляли, клетки промывали культуральной средой без сыворотки. Затем клетки помещали в питательную среду с добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5% 0,5 М раствора глюкозы и с антибиотиком циклогексимидом (0,5-1,0 мкг/мл), подавляющим синтетическую активность клетки-хозяина, дальнейшее культивирование проводили в течение 48-72 часов при температуре 35,5⁰ С.

Оценку результатов производили через 48-72 часа методом непрямой иммунофлуоресценции (НИФ), с использованием специфических моноклональных антител, меченных флуоресцеином, а также при окраске 1 стекла по Май-Грюнвальд-Гимза (Бочкарев Е.Г., 2000, 2005). При получении отрицательных результатов производился новый посев (пассаж) материала.

При исследовании препаратов инфицированных клеточных культур хламидии выявлялись в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет. Выявление хотя бы одного цитоплазматического включения, имеющего специфическое окрашивание, форму и структуру было достаточно для констатации факта хламидийной инфекции в исследуемом объекте.

Серологические методы диагностики хламидий. Методы серологической диагностики хламидиоза основаны на определении специфических антител в сыворотке крови больных. Интерпретацию результатов серологического обследования следует проводить в совокупности с другими методами детекции возбудителя.

Принцип ИФА-дигностики: антиген фиксируется на твердой поверхности, обрабатывается испытуемой сывороткой, а затем антивидовым иммуноглобулином, связанным с ферментом, визуализирующимся после добавления субстрата. Достоинством метода является возможность автоматического учета результатов и выявления классов антител - Ig M, Ig G и Ig A.

Общеупотребительным методом серодиагностики является реакция непрямой иммунофлуоресценции (НИФ) для выявления антител (Воробьева М.С., Манзенюк И.Н., 2001). При проведении НИФ используются фиксированные очищенные антигены хламидии, нанесенные в виде точек на стекло. Нанесенная сыворотка больных реагирует с антигенами различных серотипов, после чего обрабатывается антивидовой люминесцирующей сывороткой. Для идентификации антител к C. trachomatis нами применялась пептидная тест-система с видоспецифическими белковыми антигенами клеточной стенки хламидий (Immunocomb, Orgenic, Израиль).

Изучение микрофлоры влагалища. Состояние вагинального микроценоза, количественную и качественную оценку его состава производили в соответствии с Приказом МЗ СССР №535 от 22.04.85. "Об унификации микробиологических методов исследования, применяющихся в клинико-диагностических лабораториях". С целью определения видового состава и микрофлоры производили взятие материала из заднего свода влагалища, уретры и цервикального канала. Видовой состав определяли с помощью коммерческих тест-систем фирмы "Lachema" (Чехия), набор СИБ для дифференциации коринебактерий, набор №2 СИБ для энтеробактерий и определителя бактерий Берджи.

Для выделения и идентификации микрофлоры влагалища у обследованных женщин применяли бактериологический метод, при выполнении которого использовали вышеуказанные специальные среды.

Видовую принадлежность энтерококков определяли по их способности гидролизировать эскулин с образованием эскулитина и глюкозы (Бондаренко В.М., Суворов А.Н., 2007). Эскулитин связан с цитратом железа, образует комплекс черного цвета, придает характерную черную окраску колониям в соответствии с классификацией Берджи (Бондаренко В.М., Лиходед В.Г., 2007).

При учете результатов посева учитывали интенсивность роста выделенных культур:

I - очень скудный рост - рост только на жидких питательных средах; на плотной питательной среде рост отсутствует.

II - скудный рост - на плотной питательной среде рост до 10 колоний микроорганизмов определенного вида.

III - умеренный рост - на плотной питательной среде рост от 10 до 100 колоний.

IV - обильный рост - на плотной питательной среде рост более 100 колоний

Питательные среды, используемые при выполнении работы. При изучении микрофлоры влагалища бактериологическим методом исследования применяли специальные среды (табл.1).

Таблица 1

Среды, использованные при изучении микрофлоры влагалища

Кроме указанных сред с целью идентификации выделенных культур использовали дополнительные среды: Colambia CAN agar и Vaginalis agar (Becton Dickison, USA) - для выделения Gardnerella vaginalis, которые давали рост на этих средах в виде гладких, выпуклых, слегка сероватых и блестящих колоний.

Получение клинических изолятов Enterococcus faecalis. Посевы помещали в термостат на 24-48 часов при температуре 37⁰ С, после инкубации производили идентификацию на основании морфологических, тинкториальных (положительная окраска по Граму) свойств и положительной реакции в тестах Шермана. При наличии в материале энтерококков в бульоне отмечался диффузный рост, в желчи - придонный рост, происходило обесцвечивание метиленового синего.

Для выделения чистых культур энтерококков использовали энтерококк агар (НПЦ, г. Оболенск) с последующим накоплением на Columbia agar (Bio-Rad, Франция) с кровью и идентификацией на среде Diskinson Oxoid (Himedia, Индия) (Бугеро Н.В., Потатуркина-Нестерова Н.И., 2012).

Определение вирулентности in vivo. Вирулентность микроорганизмов определяли путем внутрибрюшинного введения белым мышам массой 16-18 г 0,5 мл взвеси суточной культуры Enterococcus faecalis. Взвеси готовили путем серийных разведений различной концентрации от 10¹ КОЕ/мл до 10⁹ КОЕ/мл. На каждый исследуемый штамм делали шесть таких разведений, которые затем вводили внутрибрюшинно беспородным белым мышам. Через сутки отмечали число погибших животных и определяли значение LD_{50 (}Костюкова Л.Н., Набережнев Ю.И., 1996).

Исследование нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности. Исследование нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности E. faecalis проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции. При выполнении ПЦР с целью выявления генетических детерминант патогенности энтерококков использовали штамм Enterococcus fаecalis №111, полученный из музея культур Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург) (табл.2).

Выделение бактериальной ДНК. Выделение ДНК энтерококков проводили по методу R. Boom et al. (1990) с использованием гуанидинтиоцианата (GuSCN).

Таблица 2. Использованные в работе праймеры Enterococcus faecalis

Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ в Gene Runner Version 3.05 и Primer Blast (ресурсы GeneBank) (США). Праймеры энтерококков были синтезированы в "ЗАО Симтол" (Москва).

Кольпоскопическое обследование больных урогенитальным хламидиозом. Осмотр влагалищной части шейки матки определялся на бинокулярном кольпоскопе фирмы "OLYMPUS-OSC-2" (Япония). Оптическая система представляет собой систему линз с фокусным расстоянием 25-28 см., имеет сменные окуляры Х 7, Х 15, Х 28, а также комплект сменных фильтров и фотокамерой. Определялась форма, величина шейки матки и наружного зева, цвет, рельеф слизистой оболочки, граница плоского эпителия, покрывающего шейку, и цилиндрического эпителия цервикального канала. Затем шейку матки обрабатывали 3% раствором уксусной кислоты. Исследование проводилось в течение ближайших 4-5 минут. После изучения кольпоскопической картины шейки, обработанной уксусной кислотой, проводилась проба Шиллера (Залуцкий И.В. и соавт., 2007). Для этого шейку матки смазывали ватным тампоном смоченным 3% раствором Люголя и в зависимости от окрашивания эпителия шейки матки выявлялись зоны патологически измененного эпителия и обозначались участки для биопсии шейки матки.

2.2.2 Оценка состояния редокс-системы

Активность редокс (окислительно-антиоксидантной) системы изучали в плазме крови и гемолизате эритроцитарной массы, полученного разведением отмытой эритроцитарной взвеси в дистиллированной воде в соотношении 1: 100. В гемолизате эритроцитов и плазме крови определяли активность уровень МДА, супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы и каталазы.

Определение малонового диальдегида (МДА). МДА определяли в тесте с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Андреева Л.И., Кожемякин Л.А., 1988). К 0,3 мл плазмы крови и отмытой эритроцитарной взвеси добавляли 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты (р=1,004 г/мл, рН 2,0-3,0), 1 мл 0,6% раствора тиобарбитуровой кислоты и 0,1 мл раствора сернокислого железа (28 мг FeSO₄-7 H₂0 в 10 мл дистиллированной воды), что соответствует 1 мкмоль в пробе.

Пробирки помещали в кипящую водяную баню на 1 ч., затем охлаждали в холодной воде, добавляли 4 мл бутанола, тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин. при 3000 об. /мин.

Измеряли оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм (Е_оп) против бутанола на спектрофотометре СФ-46; толщина кюветы - 1 см. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, производился по формуле:

где

А - содержание МДА (в мкмоль/л),

4 мл - объем бутанольной фазы,

0,3 мл - объем сыворотки,

1 см - толщина кюветы,

Молярная экстинкция МДА = 1,56 х 10⁵ л/моль х см.

Определение активности супероксиддисмутазы в модификации Г.Ю. Мальцева, А.В. Васильева (1994). Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах крови смешивали раствор 1: 50 см³ реагента 1 (2 мМ NaPO x 10 HO, pH 8,3), с 7,5 см³ реагента 2 (0,05 мМ нитросиний тетразолий) и 2 см³ реагента 3 (2,5 мкМ НАДН) непосредственно перед измерением.

Реакционная смесь: 0,32 см³ раствора 1 смешивали с 20 мм³ гомогената отмытых эритроцитов. Старт реакции осуществлялся добавкой 50 мм³ реагента 4 (25 мкМ феназинметосульфат), разведенного в 10 раз.

Режим измерения: время задержки - 10 с., время измерения - 180 с., кинетический режим, температура - 25⁰ C, длина волны на спектрофотометре СФ-46 540 нм, параллельный режим для измерения опытной и контрольной проб. Расчет проводился по формуле:

Активность СОД (усл. ед. /мин.) = (1 - A/A) ·оп. фон. k·p, где

A - оптическая плотность соответственно в опытной пробе и контроле;

p - разведение пробы;

k - коэффициент, подобранный для анализатора используемого типа.

С целью диагностики супероксиддисмутазы в плазме крови использовался метод, основанный на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы НАДН и феназинметасульфата (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается.

В пробирки вносят следующие реагенты: плазму крови - 0,05 мл, реагент 1 (62 мг ЭДТА, 500 мг НСТ, 92 мг феназинметасульфата растворяют в 1000 мл фосфатного буфера, рН 7,8) - 2 мл, реагент 2 (76,3 мг НАДН растворяют в 100 мл ТРИС-ЭДТА буфера, рН 8,0) - 0,1 мл.

Реакцию проводят при температуре 25⁰ С. Измерение ведут в кювете с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. После перемешивания компонентов пробы в кювете устанавливают начальную экстинкцию. Через 10 мин. измеряют нарастание оптической плотности раствора.

Расчет ведут по формуле:

блокирования, где

Ео - экстинкция реакционной смеси в отсутствии СОД (нулевой пробы) в состоянии равновесия;

Епр - экстинкция исследуемой пробы в состоянии равновесия.

За единицу активности принимают 50% торможения реакции восстановления НСТ, активность фермента выражают в усл. ед. на 1 мг белка.

Определение активности каталазы (Карпищенко А.И., 1999). Каталаза осуществляет распад перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода, снижение ее активности в эритроцитах и плазме крови наблюдается при развитии воспалительных процессов и интоксикации. Об интенсивности утилизации перекиси водорода сулят по скорости снижения экстинкции при длине волны 260 нм, на которой перекись водорода имеет максимум светопоглощения.

К 2,5 мл 0,3% раствора перекиси водорода добавляли 200 мкл гемолизата эритроцитов или плазме крови. Реакцию проводили 10 мин. при комнатной температуре, после чего останавливали внесением 0,3 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). После центрифугирования в течение 10 мин. при 5000 об. /мин. супернатант опытных и контрольных проб фотометрировали при длине волны 260 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против 5% раствора ТХУ.

Расчет активности каталазы производили по разнице экстинкции в опыте и контроле согласно закону Бугера-Ламберта-Бэра с учетом молярного коэффициента светопоглощения перекиси водорода по формуле:

где

А - активность фермента, ммоль/ (схл);

?Е - разность экстинкции контрольных и опытных проб;

V p. c. - объем реакционной смеси (3 мл);

V пр. - объем пробы, использованной для определения активности каталазы (0,2 мл);

l - длина оптического пути (1 см);

е - молярный коэффициент светопоглощения Н₂О₂ (22 М^-1 х см^-1);

t - время инкубации (10 мин.).

Определение активности глутатионредуктазы (Асатиани B.C., 1969). Глутатионредуктаза (glutathione reducease; NADPH₂ окисленный глутатион, оксидоредуктаза) - широко распространенный флавиновый фермент, катализирующий восстановление окисленного глутатиона. Является одним из важнейших глутатионзависимых антиоксидантных механизмов, принципиально важных для обеспечения нормального функционирования тканей. Его дефицит в эритроцитах и плазме крови ведет к преждевременному гемолизу.

Измерение проводили на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 340 нм против воды; толщина кюветы - 1 см; температура 25⁰С. В кювету последовательно отмеряли пипеткой: 2,4 мл раствора фосфатного буфера, 0,2 мл раствора GSSG, 0,2 мл раствора НАДФ-Н₂, 0,2 мл гемолизата эритроцитов или плазмы крови, смешивали и отсчитывали экстинкцию Е₀. Через 3 мин. отсчитывают экстинкцию Е₃. Активность глутатионредуктазы рассчитывали по формуле:

где

А - активность фермента, мкмоль/ (схл);

?Е - разность экстинкции контрольных и опытных проб;

V p. c. - объем реакционной смеси (3 мл);

Содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови. Для определения количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови применялся автоматический гематологический анализатор (Cell-Dyn 3700), который оценивает размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики клеток. В анализаторах серии Cell-Dyn для дифференцировки лейкоцитов применяется технология MAPSS - Multi Angle Polarized Scatter Separation (мультипараметрическая система лазерного светорассеивания) регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами (Луговская С.А. и соавт., 2006). Этот метод заключается в компьютерном анализе дисперсии лазерного счета клетками крови. Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах, как: размер клеток, структура и степень сложности клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, оценка формы клеточного ядра.

Анализ клеток происходит в проточной кювете при пересечении луча лазера длиной 633 нм. После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеивание последнего под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Данные сигналы улавливаются фотоумножителями. На основании полученных сигналов все клетки распределяются по соответствующим кластерам в соответствии с их размером, структурой и количеством ДНК. Таким образом, происходит дифференцировка лейкоцитов на популяции.

Определение субпопуляций лимфоцитов и их функциональной активности. У пациенток исследовали мембранные маркеры субпопуляций лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺, CD19⁺ лимфоциты) с помощью моноклональных антилимфоцитарных антител к дифференцировочным антигенам поверхности клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции (Козинец Г.И. и соавт., 2002). Использовали диагностикумы ООО "Сорбент" для проточного цитометра (фитц-меченные моноклональные а/т).

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). Проводили исследование функциональной активности иммуноцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов in vitro по А.Г. Артемовой (1973), т.к. происходит выделение белкового биологически активного продукта - МИФ (миграцию ингибирующим фактором). По степени торможения миграции лейкоцитов можно судить о лимфокинпродуцирующей способности лимфоцитов.

Учет миграции лейкоцитов проводили с помощью шкалы окуляра-микрометра, считая от их исходного положения до границы миграции основной массы клеток в контроле и опыте. Величину индекса миграции (ИМ) определяли по формуле:

Процент миграции= ИМ•100%

Среднюю величину выводили из данных постановки опыта в 5 капиллярах системы Перфильева-Габбе. Исходя из величины процента миграции лейкоцитов у здоровых людей, судили о степени угнетения Т-системы при усилении миграции лейкоцитов.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ). По способности лимфоцитов под влиянием неспецифической стимуляции митогеном переходить в лимфобласты оценивают функциональную активность всего пула Т-лимфоцитов (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978). Степень функциональной активности лимфоцитов, их готовность к стимуляции определяли по проценту лимфоцитов, претерпевших бласттрансформацию при трехдневном культивировании в присутствии митогена. Для этого готовили мазки (окраска по Романовскому-Гимзе) и производили подсчет отдельно количество малых лимфоцитов (диаметр клеток 7-7,5 мкм), бластоподобных переходных форм (диаметр клеток 8-14 мкм) и бластов (диаметр клеток более 14 мкм).

Определение количества Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Еа-РОК) (Jondal M., 1997). Феномен розеткообразования заключается в способности Т-лимфоцитов человека спонтанно адсорбировать эритроциты барана. Клетки, образующие розетки с эритроцитами барана, в литературе обычно называют сокращенно Еа-РОК (Еа - эритроцит, РОК - розеткообразующая клетка). За РОК принимают лимфоцит, присоединивший 3 и более эритроцита. Количество Еа-РОК соответствует количеству зрелых Т-лимфоцитов.

Определение проводили смешивая 1% смесь отмытых эритроцитов барана, 0,6% раствор глютарового альдегида, краску Романовского, 0,01 М раствор теофиллина, среду 199 Хенкса, 1% раствор бычьего альбумина, раствор фиколла-400, раствор уротраста, 3% раствор уксусной кислоты и 0,2% раствор трипанового синего.

Готовят стандартную взвесь лимфоцитов 2?10⁹ клеток в 1 мл, в центрифужную пробирку вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и 0,1 мл 1% взвеси эритроцитов барана, полученную смесь перемешивают. Смесь инкубируют 10 мин. при температуре 37⁰ С, затем центрифугируют 5 мин., при 1000 об. /мин. После центрифугирования клетки помещают на 2 часа в холодильник при температуре 4⁰ С. Клетки аккуратно ресуспендируют и в камере Горяева определяют процент РОК.

Сывороточные иммуноглобулины. Метод радиальной иммунодиффузии в геле агарозы для количественного определения иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови (Галицкий Я.Д., 1987).

Приготовленный в лабораторных условиях вероналовый буфер (1,84 г веронала и 0,34 г едкого натра и 200 мл дистиллированной воды) смешивают с гелем агарозы (агароза 3,6 г), после чего кипятят в течение 10-15 мин. на водяной бане до полного расплавления агара и получения прозрачного геля. Расплавленный агар разливают по 21 мл в подогретые стеклянные цилиндры, которые закрывают пробками и помещают на водяную баню с температурой 56-58⁰ С. Ампулу моноспецифичной сыворотки с рабочим титром 1: 20-1: 30 разводят в 1 мл вероналового буфера, выливают в соответствующий цилиндр, перемешивают и 10-15 мин. выдерживают в водяной бане.

Стеклянные пластины размером 9x12 см протирают эфиром, помещают на строго горизонтальную поверхность и подогревают. На середину пластины из цилиндра выливают расплавленный агар, содержащий моноспецифическую сыворотку. С помощью круглого штампа по трафарету в геле вырезают лунки. На одном стекле размером 9x12 см можно разместить до 48 лунок.

Исследуемую сыворотку вносят в лунки до исчезновения вогнутого мениска. Каждую сыворотку вносят в лунки агаровых пластин, содержащих ту или иную моноспецифическую сыворотку. В 4 лунки агаровой пластины вносят цельную и разведенную в 2, 4, 8 раз стандартную (эталонную) сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов всех классов.

После внесения исследуемых сывороток пластины помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 24 часов (для определения Ig A и Ig G) или 48 часов (для определения Ig M). После инкубации пластины извлекают из влажной камеры и окрашивают красителем бромфеноловым синим.

Для оценки результатов реакции измеряют диаметр образовавшихся вокруг лунок колец преципитации. Затем на полулогарифмической бумаге наносят на оси абсцисс диаметры колец стандартной сыворотки, а по оси ординат - известную концентрацию каждого класса иммуноглобулинов в (г/л) и строят калибровочный график, с помощью которого вычисляют содержание иммуноглобулинов в каждой исследуемой сыворотке.

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Определение производили с помощью метода, основанного на способности полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 в низких концентрациях (3,5%) растворять свободные иммуноглобулины и преципитировать иммунные комплексы (Гриневич Ю.А., Алферов А.Н., 1981). Исследуемую сыворотку инкубировали в течение 18 часов с 7% раствором ПЭГ, затем центрифугировали при 20000g на рефрижераторной центрифуге УРВ-1. Осадок растворяли в 5 мл 0,1% раствора NaOH. Оптическую плотность определяли на СФ-26 при длине волны 280 нм в кюветах 10 мм против 0,1 Н NaOH, оптическая плотность принималась за 100% шкалы пропускания. Позитивным считали тест, если оптическая плотность исследуемого образца составляла 0,12 и более. Для определения концентрации белка строили калибровочную кривую, где на оси ординат отмечали оптическую плотность раствора, а на оси абсцисс - содержание белка в мг. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Концентрацию иммунных комплексов рассчитывали на 1 мл цельной сыворотки.

Метод определения фагоцитарной реакции лейкоцитов крови. Оценку функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови проводили в тесте с микробной тест-культурой (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Фагоцитарная активность лейкоцитов определялась при помощи процентного отношения активных, участвовавших в фагоцитозе лейкоцитов, к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

Фагоцитарный индекс определялся средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит. Фагоцитарный индекс характеризует интенсивность фагоцитоза. Для определения фагоцитарного индекса использовали те же мазки, по которым определялась фагоцитарная активность лейкоцитов. В препаратах, приготовленных описанным выше способом, подсчитывали не менее 100 лейкоцитов и количество поглощенных ими микробных тел. Вычислялся фагоцитарный индекс путем деления числа фагоцитированных бактерий на число активных лейкоцитов.

Фагоцитарное число является дополнительным показателем, характеризующим как агрессивность лейкоцитов, так и их активность. Вычислялось фагоцитарное число путем деления числа фагоцитированных бактерий на общее число подсчитанных лейкоцитов.

Для определения индекса завершенности фагоцитоза в мерную центрифужную пробирку с 5 мг щавелевокислого натрия вносили 0,5 мл исследуемой крови. После тщательного перемешивания в пробирку добавляли равное количество двухмиллиардной взвеси микроорганизмов. После перемешивания смесь помещали в термостат при 37^о С на 30 мин. Затем, несколько капель исследуемой лейкоцитарно-микробной взвеси вносили в чашку Петри с застывшим хорошо подсушенным 2% -ным мясо-пептонным агаром.

Засеянные чашки помещали в термостат, при 37^о С для выращивания микробов и наступления третьей фазы фагоцитарной реакции, т.е. захватывания микробов фагоцитами. После окончания установленного срока инкубации приступали к изготовлению мазков-отпечатков. Приготовленные мазки-отпечатки высушивали и окрашивали способом Романовского-Гимза.

При микроскопировании препаратов, приготовленных из лейкоцитарно-микробной взвеси, инкубированной в термостате, отчетливо были видны различия между жизнеспособными и нежизнеспособными клетками. Первые характеризовались гигантскими размерами, вторые сохраняли исходную величину. В случаях, когда процесс фагоцитоза носил завершенный характер, внутри лейкоцитов отмечались фрагменты разрушенных клеток, имеющих разнообразную форму и отдельные микробные тела значительно меньших размеров, чем в лейкоцитах с незавершенным фагоцитозом.

Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Метод основан на цитохимическом выявлении темно-синих гранул диформазана, которые образуются в цитоплазме нейтрофила в результате восстановления нитросинего тетразолия. Эти химические реакции осуществляются благодаря активации кислородзависимой биоцидности фагоцита (Маянский А.Н. и соавт., 1999). Повышенный метаболизм лейкоцитов выступает как донатор электронов бесцветного раствора НСТ, трансформируя формазан в восстановленную форму в виде черных глыбок определяющихся в нейтрофилах крови (Герасимов И.Г., Калуцкая О.А., 2000).

Мазки крови окрашивали дважды: по Паппенгейму (комбинация методов Мая-Грюнвальда и Романовского-Гимзы) и второй раз тетразолиевым нитросиним. В готовом мазке подсчитывали общее число нейтрофильных гранулоцитов и число нейтрофилов, содержащих зерна формазана. Результат выражали в процентном отношении числа активированных нейтрофилов к 100 клеткам нейтрофилов в мазке. Подобная реакция обозначается как спонтанный тест НСТ. Он улавливает такие отклонения в организме, которые не регистрируются общепринятыми лабораторными тестами и другими маркерами. Нарушение кислородзависимых механизмов совпадает с увеличением числа активированных нейтрофилов (Карпищенко А.И., 1999).

Механизм данного теста основан на том, что фагоцитирующие клетки в присутствии фагоцитированного антигена активируют цитоплазматические пищеварительные энзимы, способные разрушить данный антиген. Доказано, что поглощение НСТ является эквивалентом поглощения микробных тел. Как микробные АГ, так и НСТ в присутствии ионов галоидов (йода, брома, хлора) активизирует клеточный метаболизм, вызывает "респираторный взрыв", который сопровождается увеличением потребления кислорода, активизацией гексозомонофосфатного шунта, образованием перекиси водорода и свободных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах. Это дало основание считать НСТ-тест показателем метаболической активности клеток, в частности нейтрофильных лейкоцитов и эквивалентом их фагоцитарной и бактерицидной активности (Зинкин В.Ю., Годков М.А., 2004).

Метод определения активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах (Allen R. C., Stephens J. T. Jr., 2011)

Активность миелопероксидазы проявляется при наличии в среде перекиси водорода. Активность фермента определяется по появлению в цитоплазме нейтрофилов (n=100) окрашенного продукта пероксидазной реакции - оксибензидина. Оксибензидин окрашивает места локализации пероксидазы в желто - коричневый цвет, под микроскопами эти участки выглядят как желто-коричневые гранулы. Степень окрашивания цитоплазмы нейтрофилов пропорциональна активности миелопероксидазы.

С целью определения уровня активности миелопероксидазы в нейтрофильных гранулоцитах готовили мазки крови, наносили на них инкубационную среду, докрашивали ядра клеток 0,1% раствором нейтрального красного и производили сравнительную оценку результатов по определению средних цитохимических коэффициентов (СЦК) по формуле:

,

где a - количество нейтрофилов без гранул;

b,c,d - количество нейтрофилов с окрашенной цитоплазмой.

Цифры обозначают степень окрашивания цитоплазмы: 0 - цитоплазма не содержит гранул; 1 - слабое окрашивание цитоплазмы; 2 - окрашивание средней интенсивности; 3 - интенсивно окрашенная цитоплазма.

Снижение СЦК свидетельствует о дефектности кислородзависимых антимикробных систем нейтрофила.

Метод определения активности катионных белков нейтрофильных гранулоцитов. Катионные белки лизосом нейтрофилов в нейтральной среде способны связывать анионный краситель бромфеноловый синий. Степень гранулярного синего окрашивания цитоплазмы пропорционально содержанию катионных белков в клетках. Снижение данного показателя свидетельствует о дефектности кислороднезависимой системы нейтрофила (Карпищенко А.И., 1999).

Готовые тонкие мазки крови высушивали, фиксировали их и окрашивали 0,15-ый раствором бромфенолового синего. Затем производили докрашивание ядер 0,1% -ым раствором нейтрального красного. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК):

, где

a - количество нейтрофилов без гранул; b,c,d - количество нейтрофилов с окрашенной цитоплазмой. Цифры, указывающие на интенсивность окраски цитоплазмы: 0 - отсутствие окраски, 1 - наличие в цитоплазме единичных синих гранул; 2 - синие гранулы занимают до ¹/₃ площади цитоплазмы; 3 - синие гранулы занимают Ѕ площади цитоплазмы.

Методика выявления щелочной фосфатазы. Щелочная фосфатаза (ЩФ) или фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты локализуется в специфических, или вторичных гранулах нейтрофильных лейкоцитов. Отмечается повышение активности ЩФ в нейтрофилах при воспалении, облучении, интоксикации, острых повреждениях тканей, шоке.

Мазки крови фиксировали смесью формальдегид-метанола в течение 30 с. (формальдегид - 10 мл, абсолютный метанол - 90 мл). Затем помещали на 20 мин. при комнатной температуре в инкубационную среду следующего состава: б-нафтил-фосфат натрия - 35 мг, прочный синий RR - 35 мг, трис-буфер, рН 9,6 (вместо пропандиолового буфера) - 35 мг. В 50 мл дистиллированной воды растворяли 2,42 г трис-буфера, добавляли 18,9 мл соляной кислоты, приливали дистиллированную воду до общего объема 100 мл. Докрашивали ядра 0,01% водным раствором азура II и микроскопировали (Ч90, Ч10). Места локализации щелочной фосфатазы определялись в виде гранул коричневого цвета. Анализировали интенсивность окрашивания цитоплазмы 100 нейтрофилов, вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК).

При проведении цитохимических исследований применялась оценка результатов по М.Г. Шубич, Б.С. Нагоеву (1980), основанная на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов.

Картина распределения и количества осадка позволила разделить клетки на четыре типа по степени активности фермента: "0" - отсутствие фермента, цитоплазма не окрашена; "1" - слабое диффузное окрашивание, единичные гранулы в цитоплазме; "2" - диффузная окраска с умеренным количеством гранул; "3" - сильно положительная реакция с многочисленными гранулами.

Для определения СЦК количественное выражение результатов проводилось путем подсчета 100 нейтрофилов с их дифференцировкой по описанному выше принципу. Число клеток с одинаковой активностью окраски умножали на цифру, соответствующую данному типу степени активности фермента. Сумма этих произведений, деленная на 100, и представляет собой СЦК для одной клетки: