Вірусні і бактеріальні препарати для захисту рослин та біотехнологічні основи їх виробництва

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Контрольна робота

Вірусні і бактеріальні препарати для захисту рослин та біотехнологічні основи їх виробництва



Зміст

1. Віруси у захисті рослин

2. Використання бакуловірусів для захисту рослин

3. Бактерії, що спричинюють хвороби комах, та препарати для захисту рослин на їх основі

4. Препарати на основі Bacillus thuringiensis

5. Препарати на основі Salmonella enteritidis var. Issatschenko

6. Безпечність мікробіологічних препаратів захисту рослин

Література



Вступ

Вірусні препарати для захисту рослин в основному мають інсектицидну дію. Найпоширенішими препаратами цієї групи є препарати на основі бакуловірусів.

Серед бактеріальних препаратів для захисту рослин найбільш поширеними є препарати на основі Bacillus thuringiensis . Препарати на основі цих бактерій мають інсектицидні властивості і використовуються у захисті рослин з 1928 року. Досить розповсюдженими є також фунгіциди на основі бактерій. Це препарати, які містять живі клітини Bacillus subtilis, Pseudomonas aureofaciens або інших видів бактерій. Бактеріальні препарати також використовують для боротьби з мишоподібними гризунами. Найвідоміший на території України препарат такого напряму - Бактеродентицид, який містить живі клітини Salmonella enteritidis var. Issatschenko.



1. Віруси у захисті рослин

Вірусні хвороби комах. Віруси, які розмножуються у клітинах комах і мають у своєму складі ДНК, належать до родин бакуловіруси (Baculoviridae), віруси віспи (Poxiviridae), іридовіруси (Iridoviridae) і парвовіруси (Parvoviridae), які мають РНК- пікорнавіруси (Picornaviridae) і реовіруси (Reoviridae).

Представники родини Baculoviridae розмножуються переважно у тілі комах. Залежно від морфології включень представників цієї родини ділять на три підгрупи: А- збудники поліедрозів, В - гранульозів і С - віруси, що не утворюють включень.

Підгрупа А характеризується тим, що віріони містяться у білкових включеннях типу поліедрів (рис. 1).

Рис. 1. Поліедрені тільця-включення, що утворилися в ядрі зараженої вірусом клітини.

Поліедри є кристалічними утвореннями завбільшки 1-10 мкм. Репродукція бакуловірусів, що викликають ядерні поліедрози комах з формуванням повноцінних вірусних включень, відбувається в клітинах тканин екто- і мезодермального походження. Поліедренні включення локалізуються насамперед у ядрах клітин жирового тіла, гіподерми, епітелію трахей, гемолімфі, додаткових залозах мальпігієвих судин. Хворіють личинки. Зовнішні ознаки - пожовтіння або побіління покривів. Уражують представників, що належать до трьох рядів (лускокрилих, перетинчастокрилих, двокрилих) та 24 родин.

Підгрупа В відрізняється від підгрупи А тим, що віріони по одному (рідше по два) розташовані в гранулі або капсулі овальної форми. Гранули за розміром менші за поліедри. Нині нараховується 34 види комах-хазяїв вірусів цієї підгрупи, які належать до восьми родин лускокрилих. Зовнішні ознаки гранульозу подібні до таких при захворюванні на ядерний поліедроз, в першу чергу уражується жирове тіло. Розвиток вірусу гранульозу починається в ядрі клітини, але після розриву мембрани ядра триває в цитоплазмі клітини.

Захворювання, спричинені бакуловірусами, що не утворюють включень тепер описані для окремих видів твердокрилих, лускокрилих та перетинчастокрилих комах. Віруси цієї групи морфологічно близькі до підгруп А і В, але на відміну від них не утворюють включень. Розмір віріонів - 120-220 нм. Захворювання розвивається як при інтралімфальному, так і пероральному введенні інфекційного матеріалу. Зовнішні ознаки проявляються через 15-17 діб після зараження.

До родина Poxiviridae належать найбільші з відомих вірусів. Для біологічного захисту рослин найбільше значення мають представники роду Entomopoxvirus. Представники цього роду спричиняють віспові хвороби приблизно у 30 видів комах із рядів твердокрилих, лускокрилих, перетинчастокрилих, двокрилих та прямокрилих. Типовий вірус віспи травневого хруща - Entomopoxvirus melolontha. В процесі репродукції вірусів у чутливих клітинах комах-господарів виявляються різні за формою включення: овоїдні, веретеноподібні і ромбічні. Розміри їх коливаються від 1-5 до 10-12 мкм. Кожне включення містить кілька десятків віріонів.

Райдужні віруси родини Iridoviridae таку назву набули за райдужне світіння - від жовто-блакитного до темно-фіолетового. Райдужні хвороби описано у представників рядів двокрилих, твердокрилих, напівтвердокрилих та перетинчастокрилих. Віріони вірусів мають форму ікосаедра розміром 125-210 нм, в процесі розвитку утворюють парактисталічні угруповання. Збудник знаходиться у різних частинах комах, але частіше хвороба розповсюджується з клітин жирового тіла. Ентомопатогенні віруси належать до роду Iridovirus. Типовий вид - райдужний вірус шкідливої або болотної довгоніжки - Iridovirus tipula.

Вірусні препарати для захисту рослин.

Вірусні препарати для захисту рослин виробляють в основному на основі бакуловірусів, а саме вірусів ядерного поліедрозу і вірусів гранульозу. Дія вірусів високоспецифічна і спрямована на комах певних видів. Вірусні препарати не шкідливі для довкілля і не порушують усталені біоценотичні зв'язки. Ентомопатогенні віруси безпечні для людини, сільськогосподарських тварин, корисних комах. Однак для більш широкого використання вірусних препаратів в сільському господарстві існує низка перепон. Однією з головних причин обмеженого використання вірусів є висока вартість вірусних препаратів, а також тривалий латентний період розвитку вірусної інфекції. Латентний період між початком інфекції і загибеллю шкідника визначається тривалістю процесу проникнення вірусу в організм хазяїна і наступного накопичення вірусних частинок. Зазвичай латентний період розвитку бакуловірусної інфекції 7-10 діб, за цей час шкідник може завдати значної шкоди рослинам і урожаю.

Вірусні препарати як правило спрямовані на захист рослин від комах-шкідників. Такі препарати прийнято називати віринами. Крім слова «вірин» до назви препарату включають індекс, що позначає назву віруса та комахи-хазяїна. Наприклад, препарат «вірин-ГЯП» - створено на основі вірусу гранульозу яблуневої плодожерки, препарат «вірин-АББ» - містить віруси гранульозу та поліедрозу американського білого метелика (бабочка).

Віруси здатні до розмноження лише у живих організмах, чим і визначаються способи їхнього масового розмноження при виробництві вірусних препаратів. Для отримання великої кількості вірусних часток (які згодом стануть основою біологічного препарату) використовується два підходи: вирощування в лабораторіях хазяїна вірусу, зараження його та отримання очищеного інфекційного матеріалу; культивування в лабораторних умовах окремих клітин, чутливих до вірусу, та їх зараження вірусом.

На сьогодні в промислових масштабах виготовлення вірусних препаратів здійснюють зараженням хазяїна вірусом, тому при виробництві вірусних препаратів для захисту рослин виникає першочергова потреба у масовому розмноженні та вирощуванні комах в лабораторних умовах. Виробництво більшості вірусних препаратів базується на вирощуванні комах-хазяїв на штучних поживних середовищах в лабораторних умовах. Якщо комах-хазяїв не можливо культивувати в штучних лабораторних умовах (наприклад, пильщиків), то здійснюють збір личинок цих комах в місцях їхнього масового розмноження, дорощування їх на природному кормі, зараження та отримання вірусного інфекційного матеріалу. Отримання в промислових умовах вірусних препаратів складається з трьох блоків рис.2.

Рис. 2. Схема отримання вірусних препаратів для захисту рослин

2. Використання бакуловірусів для захисту рослин

Технологія отримання препарату вірин-КС на основі бакуловірусів включає всі етапи характерні для виробництва вірусних препаратів: вирощування комах, культивування в них вірусів, збір гусені, що загинула, виділення біомаси вірусів та приготування препаративної форми.

В якості комахи-хазяїна використовують капустяну совку (КС). Партію гусені капустяної совки по досягненню нею 4 вікової стадії інфікують вірусом ядерного поліедрозу (штам КС-3-86). Для цього штучне поживне середовище обприскують суспензією вірусу КС-3-86 титром 1-2*107 поліедрів/мл і згодовують заражений корм гусеницям КС. Гусінь КС утримують при 28 ±1oC і вологості 65%. Час інкубування інфікованих гусениць 11-12 діб. При цьому загибель комах становить не менше 75%. Загиблі личинки збирають і заморожують при мінус 20oC протягом 18 годин, ліофілізують і переносять в апарат для видалення ворсин, що є сильним алергеном. Апарат представляє собою спеціальний барабан для стряхування ворсин, які потім видаляють за допомогою вакуумної системи. Позбавлені ворсин ліофілізовані гусениці розмелюють для отримання сухого вірусного порошку. В якості наповнювача використовують цеоліт або кремнієву кислоту. Сухий препарат є порошком білого кольору з титром не менше (2-5)*109 поліедрів/г.

Для оброблення рослин можуть використовуватися препарати, які містять лише вірусні частинки, та комплексні препарати, які крім вірусів містять активатори стресу. В якості активатора використовують хімічні інсектициди, гормони та інші агенти.

В якості активатора дії вірусних частинок може бути використана хітиназа. Наприклад, за використання препарату, який містить суспензію вірусу ядерного поліедрозу титром 106 вірусних часток/мл і хітиназу в концентрації 2*10-6 - 5*10-4 одиниць активності/мл, латентний період становить 3 доби, а смертність шкідників на 15 добу становить 83-99%.

3. Бактерії, що спричинюють хвороби комах, та препарати для захисту рослин на їх основі

вірус рослина бактерія захист

Бактерії, патогенні для комах, належать до трьох родин: псевдомонасів, ентеробактерій та бацил.

Серед представників роду Pseudomonas є антагоністи фітопатогенів та ентомопатогенні форми. Бактерії роду Pseudomonas часто виявляють у здорових та загиблих комахах.

Pseudomonas fluorescens описано як збудника септицемій совки озимої, мухи шведської в асоціації з іншими потенційно патогенними бактеріями.

Pseudomonas carnea - паличкоподібна, 0,5-0,8х1,5-2,0 мкм, джгутики розташовані полярно, ендоспор не утворює, грамнегативна, утворює червоний або рожевий пігмент, кристали токсину відсутні. Потенційний збудник хвороб комах. Викликає септицемію у комах. Хазяїн - капустяний білан, бавовняна совка, воскова міль, таргани.

Serrattia marcescens - факультативний паразит, грамнегативна, розміром 0,7х1,5 мкм, джгутики розташовані перитрихально, неспороутворююча. Утворює характерний червоний пігмент, за що отримала назву „паличка чудесної крові”. Уражує твердокрилих, лускокрилих, двокрилих, прямокрилих, перетинчастокрилих, кліщів.

Bacillus thurіngiensis - збудник септицемій комах. Факультативний паразит. Клітини паличкоподібні, прямі або злегка зігнуті, розміром 0,3-2,2х1,7 мкм, грампозитивні, джгутики розташовані латерально. Зустрічається переважно у лускокрилих. У хворих комах спостерігається виділення з ротового і анального отворів рідини бурого кольору з різким гнилосним запахом. Сприйнятливими є білани, молі, п'ядуни, коконопряди, листокрутки тощо.

Bacillus popilliae - облігатний паразит, утворює ендотоксини. Палички розташовуються поодиноко і парами, рухомі, розміром 0,9-1,0х5-8 мкм. У разі проникнення збудника розвиток відбувається в порожнині тіла комахи впродовж тривалого періоду. Тіло хворих комах заповнюється спорами і вони гинуть, як правило в період метаморфозу. Уражує личинок японського жука, майського, червневого хрущів та інших пластинчатовусих.

Bacillus cereus - грампозитивні палички розміром 1,0-1,2х3-5 мкм. Спори формуються центрально або субтермально. Поширена в ґрунті, тілі комах, продуктах. Патогенна для комах, особливо лускокрилих. Істотну роль в патогенній дії відіграє продукування протеолітичних ферментів. Штучне зараження комах частіше не дає позитивних результатів. Вважають, що для розвитку хвороби необхідні певні фактори навколишнього середовища, що впливають на організм комах.

Clostridium malacosomae - збудник бактеріозу кільчастого шовкопряда. Бактерії розмножуються у кишечнику хазяїна, викликаючи його параліч, не проникають у порожнину тіла. Після гибелі тіло комах висихає і муміфікується.

В Україні препарати для захисту рослин від комах-шкідників на основі бактерій виробляються лише із застосуванням штамів Bacillus thuringiensis.

4. Препарати на основі Bacillus thuringiensis

Виробництво бактеріальних препаратів для захисту рослин не є складним завданням. Більшість штамів бактерій, що є складовими препаратів, здатні добре рости на штучних поживних середовищах. Культивування бактерій зазвичай здійснюють глибинним способом. Поживне середовище повинно містити всі необхідні для росту продуцента елементи ( вода, вуглець, азот, мінеральні солі та інше). Під час культивування необхідно підтримувати оптимальні для росту продуцента умови (рН, температура, аерація та інше). Кінцевий продукт видаляють за допомогою центрифугування, фільтрування, адсорбції.

Технологічні проблеми при виробництві бактеріальних препаратів для захисту рослин найчастіше пов'язані з отриманням, зберіганням та використанням фагостійких штамів продуцентів та створенням препаративних форм, які забезпечують тривале підтримання в активному стані клітин продуцента.

Інсектицидні бактеріальні препарати випускають на основі Bacillus thuringiensis. Кількість біоінсектицидів на основі B. thuringiensis становить 1% світового ринку інсектицидів. Однак за прогнозами ця цифра буде збільшуватися і подальший прогрес в галузі використання інсектицидів пов'язують саме з біоінсектицидами.

Механізм інсектицидної дії Bacillus thuringiensis пов'язаний з утворенням цими бактеріями білкового параспорального кристалу. Цей кристал утворюється під час споруляції бактерій. На його долю припадає від 20 до 30 % сухої маси спорюльованої культури B. thuringiensis (рис. 3). Складається кристал в основному з білку (близько 95%) та вуглеводів ( до 5%).

Рис. 3. Клітини, параспоральні кристали та спори Bacillus thuringiensis.

Білковий кристал, який утворюється безпосередньо в клітинах B. thuringiensis не має інсектицидної активності. Після проковтування кристалу комахою в її кишківнику в слабко лужних умовах він розпадається на субодиниці (протоксин), які за дії специфічних протеїназ перетворюються на активний токсин. Активний токсин вбудовується в мембрану епітеліальних клітин кишківника комахи і утворює іонний канал, через який відбувається втрата значної кількості клітинної АТФ (рис. 4). Через 15 хвилин після утворення іонного каналу клітинний метаболізм блокується, комаха перестає харчуватися, відбувається зневоднення організму та його загибель.

Оскільки перетворення прототоксину в активний токсин відбувається лише за дії специфічних протеїназ, токсини Bacillus thuringiensis є безпечними для людини та сільськогосподарських тварин.

Рис. 4. Механізм дії інсектицидного токсину B. thuringiensis.

В біоконтролі комах-шкідників важливе значення мають 3 патоваріанти B. thuringiensis:

Патовар А - підвиди B. thuringiensis, кристали яких є найактивнішими щодо лускокрилих комах. B. thuringiensis subsp. thuringiensis (бітоксибацилін), B. thuringiensis subsp. dendrolimus (дендробацилін), B. thuringiensis subsp. galleriae (ентобактерін), B. thuringiensis subsp. kurstaki (лепідоцид, дипел).

Патовар В - підвиди B. thuringiensis, які уражують двокрилих комах. B. thuringiensis subsp. israelensis (бактокуліцид).

Патовар С - підвиди B. thuringiensis, які активно знищують жуків. B. thuringiensis subsp. tenebrionis (децимід, колорадо).

Штами B. thuringiensis, що використовуються в захисті рослин, в основному виділяють з природного матеріалу з місць загибелі комах. B. thuringiensis є ґрунтовим мікроорганізмом і тому виділити ці бактерії можна не лише із загиблих комах, а і з ґрунту та водоймищ.

Препарати на основі цих бактерій можуть містити спори бактерій і кристали ендотоксину або спори, кристали ендотоксину та термостабільний екзотоксин. В деяких країнах виробляють інсектицидні препарати, які містять очищений ендотоксин B. thuringiensis. Випускають препарати на основі B. thuringiensis у вигляді сухих порошків. Як наповнювачі використовують каолін та інші матеріали, що використовують при створенні хімічних інсектицидів. Препаративні форми містять від 30 до 100 млрд. спор та кристалів в 1 г. Використовують бактеріальні препарати у вигляді суспензій за допомогою наземної та авіаційної апаратури.

Інсектицидні препарати на основі B. thuringiensis використовують для боротьби з листогризучими комахами овочевих та садових культур, паркових та лісових насаджень, лікарських рослин (табл. 1).

Зараження здорової комахи-шкідника відбувається через забруднений спорами бацил рослинний корм. Потрапляючи в кишківник спори проростають в вегетативні клітини, в яких у процесі життєдіяльності утворюється спора та кристалічний ендотоксин. Утворення термостабільного екзотоксину підвищує інсектицидний ефект препарату, оскільки він має овіцидну та тератогенну дію на комах.

Таблиця 1.

Використання інсектицидних препаратів на основі B. thuringiensis

Назва препарату	Бактерії, що входять до складу препарату	Комахи-шкідники, для боротьби з якими використовують препарат
Бактокуліцид	B. thuringiensis subsp. israelensis	Комарі на водоймах, що не мають рибогосподарського значення
Бактоспеїн	B. thuringiensis subsp. thuringiensis	Білянки, капустяна міль і вогнівки на овочевих культурах.
Бітоксибацилін	B. thuringiensis subsp. thuringiensis	Капустяна совка, колорадський жук на овочевих культурах; листовертки, американський білий метелик у плодових насадженнях.
Гомелін	B. thuringiensis subsp. thuringiensis	Хвоє- та листогризучі комахи в лісових насадженнях.
Дендробацилін	B. thuringiensis subsp. dendrolimus	Луговий мотильок, білянки, капустяна міль, вогнівки в овочевих культурах і посівах; яблунева і плодова міль, златогузки, яблунева плодожерка, смородинова листовертка в садах; совки на бавовнику.
Дипел	B. thuringiensis subsp. kurstaki	Лускокрилі комахи в сільськогосподарських та лісових насадження.
Лепідоцид	B. thuringiensis subsp. kurstaki	Білянки, міль, вогнівки, листовертки, шовкопряди, златогузки, совки, луговий метелик на овочевих, плодових і ефіролійних культурах.
Ентобактерін	B. thuringiensis subsp. galleriae	Білянки, капустяна міль, вогнівки, листовертки, совки в овочевих і плодових культурах.
Новодор	B. thuringiensis subsp. tenebrionis	Колорадський жук на картоплі

При промисловому виробництві препаратів на основі B. thuringiensis використовують середовища, які містять кукурудзяний та пшеничний екстракти, кукурудзяне борошно, кормові дріжджі та мелясу.

Для виробництва препарату Лепідоцид може бути використано наступне середовище: кормові дріжджі 3%, соєве борошно 0,6%, крохмаль 0,4%, зелена патока 1,3%, хлорид кальцію 0,15%.

Посівний матеріал отримують культивуючи спорову культуру B. thuringiensis на рідкому середовищі в колбах при температурі 30°С впродовж 48 годин (до завершення спороутворення). Основна ферментація триває 35 - 40 годин за постійної аерації та перемішування. Культуральну рідину згущують до пастоподібного стану на сепараторі. Пасту висушують на розпилювальній сушарці і змішують з наповнювачем.

Виробництво препарату Колорадо

Діючою речовиною препарату є штам Bacillus thuringiensis H8 (ВКПМ B-6306), що синтезує кристалічний ендотоксин. Токсин є летальним для широкого кола твердокрилих комах, в тому числі колорадського жука.

Для отримання препарату штам B. thuringiensis H8 культивують глибинним способом на середовищі наступного складу, г/л:

кормові дріжджі - 15,0;

хлористий кальцій - 0,1;

калій фосфорнокислий однозаміщений - 27,0;

гідроокис калію - 6,0;

пропінол Б - 1,0.

рН середовища 6,5 - 7,2. Середовище стерилізують при температурі 123С і в асептичних умовах засівають спорами продуцента. Під час культивування обов'язково здійснюють мікробіологічний контроль за станом продуцента, повнотою споро- та кристалоутворення. Тривалість культивування становить 48-56 годин. Процес завершують коли 50 - 60% клітин утворили спори.

Після завершення культивування культуральну рідину охолоджують до 18 - 20 С та передають на етап концентрування.

Концентрування здійснюють шляхом сепарування, центрифугування, мембранної фільтрації або розпилювального сушіння. Вміст токсичного білку в концентраті повинен бути 40 - 100 мг/г.

Концентрат використовують для виготовлення різних товарних форм інсектицидного препарату.

Пастоподібний препарат містить:

концентрат культуральної рідини 50 - 55 %;

гліцерин 8 - 10%;

масло тридекан 20 -30%;

спан -60 або неонол 6 - 8%;

амбреїн 0,1 - 0,2%.

5. Препарати на основі Salmonella enteritidis var. Issatschenko

Мишовидні гризуни завдають не лише значної шкоди сільському господарству, але й є джерелом важких інфекційних та інвазійних хвороб людини та сільськогосподарських тварин. Тому заходам із знищення цих шкідників приділяють велику увагу.

Методи знищення мишовидних гризунів поділяють на механічні, хімічні та біологічні. Біологічні методи боротьби з гризунами включають використання природних ворогів (домашні тварини (коти, собаки); хижі ссавці (лиси, ласки, горностаї); птахи (сови, сороки, сіра ворона)) та збудників хвороб гризунів.

Біотехнологічні препарати почали використовувати у боротьбі з гризунами ще наприкінці ХІХ ст. Метод базується на зараженні гризунів специфічними патогенами, які належать до роду Salmonella і спричинюють епізоотії. Фундаторами такого методу боротьби із гризунами є І.І. Мечников, Н.Ф. Гамалея та Л.Пастер.

Штам, який тепер використовують на території України та Росії для створення препаратів для боротьби із гризунами, було ізольовано у 1897 році Б.Л.Ісаченко під час епізоотії серед сірих пацюків. За морфолого-культуральними, серологічними, біохімічними та патогенними властивостями він належить до виду Salmonella enteritidis.

Для збереження біологічних властивостей бактерії Salmonella enteritidis var. Issatschenko С.С.Мережковський запропонував оригінальне поживне середовище - 10% відвару курячого білка на воді.

В нашій країні для боротьби з мишовидними гризунами використовують препарати на основі Salmonella enteritidis var. Issatschenko. Ці бактерії характеризуються специфічною вірулентністю до багатьох видів гризунів і є непатогенними для людини, свійських тварин. Найбільш чутливими до зараження цими бактеріями є миші - домова, лісова, миша-малютка, полівки - звичайна, стадна, темна, малоазійська, кущова, водяна, степова, - саме ці гризуни є найпоширенішими шкідниками.

Зараження гризунів відбувається при поїданні бактеріальних препаратів у чистому вигляді або разом із приманками. Бактерії надходять у шлунок і далі у кішківник тварини, звідки через стінки кишківника і лімфатичні вузли потрапляють в кров, паренхіматозні органи і спричинюють септичний процес у гризунів. Першими ознаками хвороби є підвищення активності мишовидних гризунів. Потім вони стають в'ялими, малорухливими. Загибель тварин починається через 3 - 5 діб і триває 2 - 4 тижні.

У боротьбі з гризунами застосовують препарат бактеродентицид, що створений на основі бактерій Salmonella enteritidis var. Issatschenko, var. Danysz. штам 5170 Прохорова. Випускають дві форми препарату - зерновий і аміномісний.

Бактеродентицид зерновий сухий виготовляють з цілого зерна вологістю не менше 14%. В 1 г сухого препарату міститься 2-3 млрд. спор бактерій. У герметичних банках зберігається до 2 років. Використовують проти мишей і полівок усіх видів навесні, взимку або восени в місцях сезонного скупчення гризунів. У безсніжний період препарат розкладають купками по 5-10 г на стежках гризунів, у нори або під трав'яний покрив. При застосуванні препарату в зимовий період по 1-2 столові ложки його (10-25 г) розфасовують у невеликі паперові пакети, які опускають у пророблені в снігу (до поверхні ґрунту) лунки. У складах з насіннєвою продукцією, парниках, теплицях дозволено застосування препарату способом розкладання по 5- 100 г/м2. Строк очікування 8 днів.

Для отримання препарату в промисловості готують посівну культуру штаму Salmonella enteritidis var. Issatschenko N 18/1. Поживне середовище повинно містити автолізат і сірчанокислотний гідролізат дріжджів, сірчанокислотний гідролізат рибокістного борошна, білково-вітамінний концентрат, глюкозу, зелену патоку, крейду та воду. Вміст в ньому водорозчинних вуглеводів повинен бути 2,3% по масі, амінного азоту 0,12% по масі. Середовище стерилізують та засівають посівною культурою. Культивування здійснюють глибинним методом при перемішуванні та аерації при температурі 36oС впродовж 48 годин. Після завершення культивування культуральну рідину змішують з зерном, висушеним в псевдозрідженому шарі при температурі 105oС 24 години, і соняшниковою олією, що є смако-ароматичною принадою.

Виробництво зернового родентициду можна здійснити і за безпосереднього культивування Salmonella enteritidis на зерні. Для отримання препарату згідно з цією технологією якісне зерно пшениці, вівса чи ячменю 3 - 4 рази промивають і заливають водопровідною водою. Через добу залишок води зливають і зерно промивають ще 2 - 3 рази та розфасовують по 0,8 - 1 кг у посуд об'ємом 3 літри. Перед стерилізацією в посуд наливають воду в кількості 10 - 15% маси зерна. Для підлужнення зерна до рН 7,5 - 7,6 додають 20%-ний розчин Na2С03 з розрахунку 5 мл на 1 кг зерна. Посудини закривають і стерилізують.

Посівну рідку культуру Salmonella enteritidis готують на м'ясо-пептонному бульйоні, гідролізаті кормових дріжджів, рибному гідролізаті. Рідку культуру бактерій висівають у посуд з зерном у боксах. Після висівання посуд добре струшують для рівномірного розподілу бактеріальної культури у масі зерна. Процес інкубації за температури 37°С триває 2 - 3 доби. Готовий препарат є вологим набряклим зерном.

У готовому препараті міститься від 2 до 8 млрд. бактерій на 1 г. Зберігають його за температури 1 - 10°С безпосередньо в культиваційному посуді.

Бактеродентицид зерновий вологий виготовляють з цілого зерна пшениці, ячменю, вівса, розбухлого від замочування і витримування в автоклаві. Вологість його становить 50-60%. В 1 г його міститься 2,5-5 млрд. спор бактерій. Смертельна доза від 2-3 (для мишовидних гризунів) до 10-20 зерен (для щурів). У герметично закритих банках може зберігатися до 6 місяців.

Бактеродентицид амінокістковий виготовляють при вирощуванні бактерій на рідких поживних середовищах з послідовною сепарацією та змішуванням з кістковим борошном.

Посівну культуру готують зі штаму Salmonella enteritidis var. Issatschenko (Danitsch-Mereshkovsky) N 29/1. Поживне середовище містить: солянокислий гідролізат казеїну, білково-вітамінний концентрат, технічну глюкозу, хлорид натрію, крейду, воду. Вміст в ньому водорозчинних вуглеводів повинен бути 3% по масі, амінного азоту 0,13% по масі. Культивування здійснюють глибинним методом при перемішуванні та аерації при температурі 37oС впродовж 36 годин. Культуральну рідину змішують з борошном, висівками і олією, що є смако-ароматичною принадою. Суміш екструдують і висушують.

Препаративна форма - гранули сірого кольору вологістю 6%, титр не менше 0,1 млрд/г. Розфасовується по 5 кг в паперові мішки. Перед застосуванням до препарату додають кип'ячену воду (1:1), після чого його змішують з кормом для гризунів і в той же день розкладають. Дозволений для одноразового використання на полях, луках, посівах кукурудзи й соняшнику на силос, у садах, заселених мишовидними гризунами у формі принад з вмістом 20% препарату. Норма витрати 0,1-0,4 кг/га. У всіх випадках строк очікування 8 днів.

6. Безпечність мікробіологічних препаратів захисту рослин

Основна перевага біологічних препаратів - специфічність дії на організми, що є запорукою їх безпечності для здоров'я людини. Однак, необхідні певні методи контролю за їх виробництвом і застосуванням задля максимальної безпечності. Так, новий препарат можна запустити у виробництво тільки з дозволу Державної комісії, що відає випуском та застосуванням хімічних та біологічних засобів у боротьбі зі шкідниками, збудниками хвороб та бур'янами. При цьому однією з вимог до нового препарату є його оцінка на безпечність для людини та тварин.

Одними з перших у польових умовах використали препарати на основі В. popilliae - збудника молочної хвороби пластинчастовусих жуків. Вивчення патогенності цього організму здійснено на шпаках, дорослих курях, курчатах, пацюках та мавпах. В жодному випадку будь-яких патологічних явищ не спостерігали.

Нині найпоширенішими біоінсектицидними препаратами є препарати на основі В. thuringiensis. У США та деяких інших країнах перевірку безпечності ентомопатогенних бактерій було здійснено на добровольцях. Було поставлено досліди з вдиханням та заковтуванням 18-ма добровольцями ендотоксину В. thuringiensis, які попередньо пройшли медичний огляд і лабораторне обстеження. Усі учасники досліду залишались абсолютно здоровими. Дані, отримані на людях, включали також відомості про вісім службовців, причетних до виготовлення бактеріальних препаратів. У цьому випадку також не було виявлено жодної шкоди для здоров'я від роботи безпосередньо з препаратом.

Відсутність патогенної дії кристалоутворюючих бацил було показано на 11 видах ссавців (білі миші, пацюки, мурчаки, кролі, велика рогата худоба, вівці, свині) та на 7 видах птахів (фазани, куріпки, курчата, кури, горобці, шпаки, качки) і 6 видах риб (форель, окунь, молодь лосося, гамбузія та акваріумні риби).

У колишньому СРСР біопрепарати і культури кристалоутворюючих бацил були випробувані на 8 видах ссавців (білі миші і пацюки, морські свинки, кролі, бурундуки, вівці, бики), на 3 видах птахів (горобці, курчата, качки), 2 видах риб (форель, короп). При цьому виявлено дві особливості впливу мікроорганізмів на тварин: перша - В. thuringiensis неінфекційні для теплокровних тварин і не можуть бути причиною інфекційного захворювання; друга - згодовування тваринам спор і кристалів В. thuringiensis у дозах, застосовуваних проти комах, а також у дозах, що перевищують ентомоцидні в 10- 100 разів, не спричиняють будь-яких патогенних реакцій.

Встановлено, що В. thuringiensis та препарати на її основі практично не шкодять бджолам.

Досвід роботи з ентомопатогенними вірусами засвідчує, що на здоров'ї осіб, які працювали з ними, це не позначалося.

Досліджували пероральне введення вірусу поліедрозу бавовникової совки добровольцям. Кожен із десяти чоловіків та жінок після прискіпливого медичного обстеження протягом п'яти днів одержав 5,82 млрд. поліедрів. Помітних змін у самопочутті будь-кого зі складу контрольних чи дослідних груп не виявлено. Через два роки після досліду всі члени обох груп були цілком здоровими. В іншій роботі досліджували сироватку крові семи лаборантів, які працювали з вірусами ядерного поліедру шовкопряда-недопарки і пильщика рудого на наявність антитіл до вірусних чи поліедренних білків. Антитіл до вірусних чи поліедренних білків не було виявлено. Поряд з цим серологічно порівнювали згадані віруси з арбовірусами везикулярного стоматиту, енцефаломієліту коней, жовтої лихоманки, а також з вірусами лімфоцитарного хоріомененгіту. Віріонні і поліедренні білки вірусів ядерного поліедру серологічно відрізнялися від білків усіх перелічених вірусів.

Намагання заразити клітини людини препаратами вірусної ДНК були безуспішними. При застосуванні препаратів ДНК вірусів ядерного поліедру шовкопряда тутового і молі вощинної великої жодного разу поліедрів у клітинах не було виявлено, цитопатична дія вірусу іноді була помітною, але вірус не репродукується, а лише перебуває в цілих чи зруйнованих клітинах.

Спеціалісти вважають неймовірною можливість мутаційних змін В. thuringiensis, що могли б небажано розширити спектр дії бактеріальних препаратів.

Є відомості, що в осіб, які працювали з грибом Beauveria bassiana, препарати спор спричиняли помірні й сильні алергічні реакції. Це проявлялося у формі втоми, нездужання, головного болю тощо. У більшості випадків ці симптоми швидко минали.

Такі самі явища спостерігалися за лабораторного одержання боверину. Встановлено також, що за поверхневого вирощування гриба B. bassiana для одержання боверину, повітря приміщень забруднюється не лише спорами B. bassiana, а й супутньою мікрофлорою (пеніцили, аспергили), що може посилювати алергізацію працюючих.

Отже, серед вироблюваних нині мікробіологічних препаратів жоден не завдає серйозної шкоди здоров'ю персоналу, який має з ними контакт. Однак не можна виключати можливість розвитку алергічних реакцій на мікробні препарати. Тому досить важливо при роботі з біопрепаратами забезпечити механізацію виробничих процесів, герметизацію апаратури, а за необхідності - застосовувати індивідуальні захисні засоби, захищаючи шкіру, очі і верхні дихальні шляхи від забруднення мікроорганізмами та біопрепаратами.

Встановлено, що, як правило, прямого специфічного впливу ентомопатогенних вірусів та бактерій на корисну фауну безхребетних не спостерігається. Однак зниження чисельності фітофага за застосування мікробіологічних препаратів опосередковано впливає на паразитів і хижаків, оскільки при цьому погіршується забезпеченість останніх кормом. Більшою мірою це позначається на високоспеціалізованих ентомо- та акарифагах.

Первинний контакт мікробіологічних препаратів завжди відбувається з рослинами, що є кормом для комах-шкідників. Очевидно, взаємовідносини цих препаратів з рослинами обмежуються адсорбцією на поверхні листя та стебел. Будучи природними елементами біоценозів, ентомопатогенні мікроорганізми не завдають шкоди рослинам. Більше того, внесення ряду бактерій у ґрунт і на частини рослин сприяє росту сільськогосподарських культур і збільшенню врожаю. Однією з таких бактерій є В. thuringiensis.

У цілому мікробіологічні засоби захисту рослин досить безпечні для людини та навколишнього середовища, що робить їх незамінним елементом системи захисту рослин.



Література

1. Бровдій В.М., Гулий В.В., Федоренко В.П. Біологічний захист рослин: Навчальний посібник. - Київ.: Світ, 2004. - 348 с.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

3. Картель Н.А., Кильчевский А.В. Биотехнология в растениеводстве. - Мн.:Тэхналогія, 2005. - 310 с.

4. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.А., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. - М.: Изд-во Общ. Фитопатологов, 2001. - 302 с.

5. Франц И., Криг А. Биологические методы борьбы с вредителями. - М.: Колос, 1984.

6. Сельскохозяйственная биотехнология/ Под ред. Шевелухи В.С. - М.: Выс. школа. - 1998. - 416 с.

Додаткова

7. Бурьянов Я.И., Кадо К.И. Стратегия создания трансгенных растений с устойчивостью к фитопатогенам и вредителям // Биоорган. химия, 1999. - Т. 25. - С. 903 - 910.

8. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений // Физиология растений, 1999. - Т.46. - С. 930 - 944.

9. Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений биогенными элиситорами фитопатогенов // Прикладная биохимия и микробиология, 1994. - Т. 30. - С. 325 - 339.

10. Бондаренко Н. В. Биологическая защита растений. - М.: Агропромиздат, 1986. - 278 с.

11. Муровцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.Н. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. - М.: Агропромиздат, 1990. - 287 с.

12. Биорегуляция микробно-растительных систем / Под ред. Иутинской Г.А., Пономаренко С.П. - К.: Ничлава, 2010. - 464 с.

13. Патыка В.Ф., Патыка Т.И. Экология Bacillus thuringiensis // К.: Изд. ПГАА, 2007. - 216 с.

14. Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis / Под ред. Кандыбина Н.В. - Санкт-Петербург, Пушкин: Изд. ВИЗР, 2009. - 252 с.

Размещено на Allbest.ru