Производство амилазы

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Амилазы использовались человеком давно, однако их изучение началось с открытия Кирхгофом в 1814 г. вещества, способного превращать крахмал в сахар. Препарат, полученный Кирхгофом из пшеничной муки, обладал способностью разжижать крахмальный клейстер и превращать его в сахарный сироп. Аналогичное явление автор наблюдал при смешивание крахмального клейстера с ячменным солодом. Уже в этих первых исследованиях Кирхгоф отметил губительное действие на это вещество серной кислоты. В то же время он подчеркнул, что сахарообразование является необходимы условием для сбраживания крахмалсодержащих материалов и таким образом положил начало научному объяснению технологии брожения.

Биологически активное вещество в дальнейшем было выделено из солода и подверглось детальному изучению. Было обнаружено, что его действие на крахмал проходит через три стадии: разжижение, декстринизацию и осахаривание. Это привело к признанию существования в солоде двух различных компонентов, которые в дальнейшем были по лучены в отдельности и названы а-амилазой (декстринирующий компонент) и в-амилазой(осахаривающий компонент).

б-Амилазы и в-амилазы широко распространены в высших растениях. Наиболее важным источником амилаз являются хлебные злаки, зерно которых в проросшем состоянии (в виде солода) находит широкое применение в промышленном гидролизе крахмала. Солод из ячменя, ржи, пшеницы, овса, проса в настоящее время используется для осахаривания крахмала в спиртовом производстве.



1. Общая характеристика амилаз

Классификация ферментов

Класс	Катализируемая реакция	Тип реакции	Важнейшие подклассы
КФ 1 Оксидоредуктазы	Окислительно-восстановительные реакции. Перенос атомов H и O или электроновот одного субстрата на другой	AH + B > A + BH (восстановленный) A + O > AO (окисленный)	дегидрогеназа, оксидаза, пероксидаза,редуктаза, монооксидаза, диоксигеназа
КФ 2 Трансферазы	Перенос функциональной группы от одного субстрата на другой. Это может быть метильная, ацильная, фосфатная группа или аминогруппа.	AB + C > A + BC	аминотрансфераза, фосфотрансфераза, C1-трансфераза, гликозилтрансфераза
КФ 3 Гидролазы	Образование двух продуктов из одного субстрата в результате гидролиза.	AB + H2O > AOH + BH	эстераза, гликозил-гидролаза, пептидаза,амидаза
КФ 4 Лиазы (синтазы)	Негидролитическое добавление или удаление группы к или от субстрата. Образование C-C, C-N, C-O или C-S связи.	RCOCOOH > RCOH + CO2	C-O-лиаза, C-S-лиаза, C-N-лиаза, C-C-лиаза
КФ 5 Изомеразы	Внутримолекулярная перестановка, то есть изомеризация молекулы субстрата.	AB > BA	эпимераза, цис-транс-изомераза,внутримолекулярная оксидоредуктаза и др.
КФ 6 Лигазы(синтетазы)	Соединение двух молекул в результате синтеза новой C-O, C-S, C-N или C-Cсвязи, сопряжённое с одновременным гидролизом АТФ.	X + Y+ ATP > XY + ADP + Pi	C-O-лигаза, C-S-лигаза, C-N-лигаза, C-C-лигаза

Согласно современной классификации и номенклатуре ферментов а- амилаза получила название б-1,4-глюкан-4глюкангидролаза; в -амилаза - б -1,4-глюкавмальтогидролаза; глюкоамилаза-б -1,4-глюкогидролаза;олиго- 1,6-глюкозидаза декстрин-6-глюкангидролаза.

Роль б-амилаз при гидролизе крахмала исключительно велика. Из трех основных функций при действии на клейстеризованный крахмал (разжижение, декстринизация, осахаривание) разжижение и декстринизация зависят от б-амилаз. Они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный крахмал, разрушая крахмальные зерна.

б-Амилазы различного происхождения имеют много общих свойств: хорошо растворяются в воде или в сильно разбавленных растворах солей.

Более концентрированные растворы солей (например, 20 - 30%ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферментов, б-Амилазы легко растворяются в разбавленных растворах этилового спирта, но осаждаются при его концентрации в среде свыше 60%. Белок б-амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах pH 4,2--5,7. Молекулярная масса солодовой б-амилазы 60000, б-амилаз микроскопических грибов - 45000--50000. Многие из известных ныне б-амилаз получены либо в высокоочищенном, либо в кристаллическом виде.

Действуя на целое крахмальное зерно б-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е как бы раскладывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образование не окрашиваемых йодом продуктов в основном низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный.



а - ферментативный гидролиз амилозы; б - начальная стадия гидролиза амилопектина; в - конечная стадия осахаривания амилопектина.

Рисунок 1.1 Стадия гидролиза крахмала б-амилазой:

В результате воздействия а- амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются б- амилазой до ди- и моносахаридов. Все б-амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же or-амилазы, особенно грибного происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с образованием небольшого количества мальтозы и глюкозы.

Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на а -амилазы. Это впервые было обнаружено Воллерштейном, затем подтверждено Накамурой. В настоящее время это явление отмечено почти для всех амилаз. Однако теоретически этот вопрос применительно к промышленному гидролизу крахмала до сих пор не разработан.

б-Амилаза солода и глюкоамилаза микроскопических грибов являются осахаривающими ферментами, образующими при гидролизе крахмалаебраживаемые сахара- мальтозу и глюкозу соответственно.

в-Амилаза -типичный представитель амилаз высших растений. Ее действие на крахмал, содержащий б -гликозильные связи, ведет к образованию в -мальтозы. Это явление было первым признанным примером



а-гидролиз амилозы; б-гидролиз наружных ветвей амилопектина (в-декстрин обведен пунктирной линией)

Рисунок 1.2 Действие в-амилазы на крахмал

Открытие глюкоамилаз, называемых иначе г-амилазами, амилоглюкозидазами, б-глюкозидазами или така-амилазами В, связано с исследованием ферментов микроскопических грибов, используемых в производстве спирта.

Согласно новой номенклатуре глюкоамилаза должна расщеплять лишь б - 1,4-связи в поли- и олигосахаридах. Однако установлено, что этот фермент расщепляет также б-1,6-глюкозидные связи. Поэтому для глюкоамилазы предложено систематическое название б-1,4-:1,6-глюкан-4:6- глюкангидролаза.Таким образом, под рабочим названием глюкоамилазы следует иметь в виду фермент, расщепляющий в крахмале и олигосахаридах б-1,4- и б-1,6-глюкозидные связи. Существование в микроскопических грибах таких ферментов, как олиго- 1,6-глюкозидаза (конечная декстриназа) и изомальтаза, расщепляющих б-1,6- связи,некоторые исследователи ставят под сомнение. Весьма активная глюкоамилаза содержится в микроскопических грибах.

2. Обзор возможных способов получения

Амилолитические препараты могут быть получены из поверхностных и глубинных культур. Получение препаратов амилаз из поверхностных культур. Средой для выращивания продуцентов являются пшеничные отруби с добавлением до 25 % солодовых ростков, увлажненные водой, подкисленной 0,1 н. раствором серной или соляной кислоты. Выход готовой культуры составляет обычно от 70 до 80 % массы среды. Продуцентами а- амилазы и глюкоамилазы чаще всего используются микроскопические грибы A. oryzae, A. awamori, A. niger, R. delemar и др. В Японии при твердофазном культивировании применяют бактерии В. subtilis и В. amylosolvents. Режимы выращивания зависят от физиологии продуцента.

Экстракт из поверхностной культуры может быть использован для получения очищенных амилолитических препаратов путем осаждения ферментов органическими растворителями или нейтральными солями. Амилазы выпадают в осадок почти полностью (93-96 %) при концентрации этанола в растворе 69-72 %, ацетона 60-62 и изопропанола 54-55%. Но сейчас поверхностная культура не считается перспективным сырьем для производства высокоочищенных амилолитических препаратов.

Получение препаратов амилаз из глубинных культур. В настоящее время в нашей стране для получения амилолитических ферментных препаратов преимущественно используется глубинный способ культивирования продуцентов. В качестве продуцентов используют грибы рода Aspergillus (A. oryzae, A. usamii, A. batatae), спороносные бактерии, относящиеся к группам В. subtilis - mesentericus, дрожжеподобные организмы родов Endomycopsis, Endomyces и многие другие микроорганизмы.

Источники азота. Выбор сред для каждого продуцента про водится опытным путем с учетом физиологических потребностей продуцента и условий производства. Например, при изучении факторов, влияющих на биосинтез ферментов, было показано, что культура В. subtilis 103 весьма чувствительна к источнику азота в среде (табл. 1.1.).



Таблица 1.1

Источник азота	Активность б-амилазы, ед.	рН исходной среды	рН Культуральной жидкости	Содержание биомассы, г на 100 мл
Цитрат аммония двузамещаемый	82,8	6,9	7,5	0,84
KN	14,4	6,9	6,1	0,11
NN	0	6,9	4,45	0,26
(NS	0	6,9	4,8	0,40
(NHP	86,4	6,9	5,6	0,80
NCl	43,2	6,9	7,4	0,40
Казеин	24,0	6,9	7,7	0,80
Пептон	43,2	6,9	7,5	1,00
Кукурузный экстракт	36,0	6,8	7,6	1,00
Глютеин	14,4	7,0	6,8	0,74

Наилучшие результаты согласно данным К. А. Калунянца и др. (1979) наблюдаются в присутствии двузамещенного цитрата аммония - 82,8 ед. АС/мл и (NH4)2HP04 - 86,4 ед. АС/мл. Органические источники азота менее эффективны, чем неорганические.

Дополнительное введение азота в виде экстрактов из растительного, животного и микробного материала к (NH4)2HP04 позволяет на 30-40 % повысить продуцирующую способность бактерий и достичь активности 110-114 ед. АС/мл(табл 1.2.).

Таблица 1.2

Вариант среды	(NHP	Азотсодержащая добавка	Количество довавки	рН Исходной среды	рН готовая культуральная жидкость	Актив. б-амилаз ед.
1	1,0	Пептон	0,9	6,9	7,2	108,4
2	1,0	Кукурузный Экстракт	0,9	6,8	7,3	111,6
3	1,0	Экстракт солодовых ростков	5,0	6,8	6,6	114,0
4	1,2	Кукурузный экстракт и пивные осадочные дрожжи	0,8 и 0,4	6,7	7,2	111,6

Источники углерода. Главным источником углерода в среде для всех продуцентов б-амилазы является крахмал различного происхождения. Используют чаще всего крахмал картофельный или кукурузный, который вводится в среду в клейстеризованном состоянии. Вместо крахмала может применяться крахмалсодержащее сырье, например ячменная или кукурузная мука. Все эти компоненты используются в нативном виде или в виде различных гидролизатов.

Установлено, что биосинтез б-амилазы протекает более интенсивно, если крахмал частично гидролизовать в процессе приготовления питательной среды, не допуская при этом накопления в среде низкомолекулярных дисахаров (мальтозы) и особенно глюкозы (табл 1.3.).

Таблица 1.3

Вариант среды	Способ обработки крахмала в питательной среде	рН готовой культуральной жидкости	Активность б-амилазы в КЖ ед.	Активность б-амилазы в КЖ % от контроля
1	Гидролизат крахмала при длительности гидролиза ф=10 мин	5,70	177,0	158,5
2	Гидролизат крахмала при ф=60 мин	5,65	168,0	150,5
3	Гидролизат крахмала при ф=1,5 ч	5,72	180,0	161,0
4	Гидролизат крахмала при ф=18 ч	5,68	180,0	161,0



Поэтому, если состав среды предусматривает высокое содержание крахмала, целесообразно вводить его порциями по мере потребления культурой микроорганизма, что позволяет избежать явления катаболитной репрессии синтеза а - или глюкоамилазы (рис. 1.3)

1-контроль; 2-дробный режим введения крахмала в количестве 0,5 %

Рисунок 1.3 Влияние дробного введения крахмала

3. Обоснование целесообразности использования биотехнологический приемов в производстве амилаз

Амилазы для промышленного применения получают только биотехнологическими приемами - биосинтезом с помощью микроорганизмов, так как в растениях их содержится в небольших количествах и выделять их экономически не целесообразно.

При биотехнологических приемах используются мягкие режимы выращивания биомассы продуцента и выделение ферментов (амилаз), так как основная масса продуцентов относится к мезофильным микроорганизмам, оптимум роста для которых находится при температуре 28-36°С.

Использование ферментов -- биологических катализаторов -- очень заманчивая вещь. Ведь они по многим своим свойствам, прежде всего активности и избирательности действия (специфичности), намного превосходят катализаторы химические. Ферменты обеспечивают осуществление химических реакций без высоких температур и давлений, а ускоряют их в миллионы и миллиарды раз. При этом каждый фермент катализирует только одну определённую реакцию.

Биологические катализаторы можно использовать также не извлекая их из живых организмов, прямо в бактериальных клетках, например. Этот способ, собственно, есть основа всякого микробиологического производства, и применяется он издавна.

Разработка способа повышения устойчивости ферментов значительно расширяет возможности их использования. С помощью ферментов можно, например, получать сахар из растительных отходов, и этот процесс будет экономически рентабельным. Уже создана опытная установка для непрерывного производства сахара из клетчатки.

4. Описание технологических стадий и режимов производства амилолитического ферментного препарата

В Последовательность стадий получения ферментного препарата, содержащего б-амилазу, представлена на рисунке 1.4

В настоящее время для получения амилолитических ферментных препаратов преимущественно используется глубинный способ культивирования.

Продуцентами при данном способе культивирования являются: микроскопические грибы рода Aspergillus (A. Oryzae, A. Ussamii, А. Batatae), спороносные бактерии, относящиеся к группам Bacillus. Subtilis-mesentericus, дрожжеподобные организмы родов Endomucopsis, Endomyces и многие другие микроорганизмы.



Рисунок 1.4. Схема получения ферментного препарата

Приготовление посевного материала. Этапы получения посевной культуры следующие: 1) обновление исходной культуры на агаризованной среде; 2) выращивание культуры продуцента на жидкой среде в колбах на качалке; 3) культивирование продуцента в малом, а затем, если требуется, в большом инокуляторе. Посевная доза при засеве производственной среды составляет 4% по объему.

Компонентами среды являются: кукурузная мука, крахмал, патока, гидролизатыказеина и дрожжей, древесины, липиды, минеральные соли. (Содержание СВ от 1,5 до 15,5 %, pH от 3,5- 8,5)

Приготовление питательной среды включает в себя составление композиции для роста биомассы и накопления ферментов. В питательную среду входит следующий состав (в %): (NH4)2HPO4 - 0.8; КН2РО4 -0.1; KNO3 -0.11; кукурузный экстракт - 1. Среду стерилизуют для удаления посторонней микрофлоры при температуре 121 °С в течение 1 часа. Температура культивирования: 26-32 С для грибов, а для бактерий 32-35 С. Режим аэрации: 50- 60 м3/ч м3.

Ферментация - процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов. Ферментация - это комплекс процессов, в который входят рост и развитие клеток, биосинтез ферментов, тепловыделение, транспорт метаболитов в культуральную жидкость. Исходный pH питательной среды 6,5-7,0 поддерживают на оптимальном уровне с помощью мела. Процесс протекает при температуре 35 °С и длительность ферментации составляет 55 -60 ч. На рост и развитие клеток существенное влияние оказывает концентрация питательных веществ в субстрате.

Фильтрация - процесс разделения суспензии с использованием пористых перегородок, которые задерживают твердую фазу суспензии и пропускает ее жидкую фазу. Полученную биомассу продуцента вместе с нерастворимыми частицами среды при необходимости стерилизуют, высушивают и используют на корм животным. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может хранится и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.

Выпаривание - процесс концентрирования растворов путем частичного испарения жидкого растворителя. Фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм их необходимо сконцентрировать. Ферменты очень чувствительны к термической обработке и нуждаются в мягких режимах концентрирования. При температуре греющего пара 90-100"С и при температуре кипения 35- 40 С потери активации не превышают 10%.

Сепарирование - разделение под действием центробежных сил. Во вращающемся потоке на взвешенную частицу действует центробежная сила, направляющая ее от центра к периферии.



=

где Gk - центробежная сила, m-масса частицы, r-радиус вращения, wr -окружная скорость.

Сепарирование применяется, когда концентрация взвешенных частиц в жидкости, их размер не очень велики

Образовавшийся осадок балластных веществ удаляется из культуральной жидкости, а очищенная жидкость подвергается осаждению.

Осаждение - выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящего его в твердую фазу. Широкое распространение, для выделения ферментов из водных растворов, получил метод осаждения этанолом, изопропанолом и ацетоном. Добавление таких реагентов вызывают потерю растворимости белковых молекул, и сопровождается образованием осадка из-за снижения полярности среды в присутствии осадителя. В водной среде энергия притяжения молекул фермента и диполей воды (энергия сольватации) превосходит взаимопритяжение молекул фермента, в связи, с чем образуется устойчивый раствор. При определенной концентрации органического растворителя энергия сольватации становится меньше энергии связи между диполями воды и молекулами растворителя, так как он обладает более сильной полярностью. В результате сольватная оболочка белковой молекулы разрушается, что приводит к коагуляции белка. При осаждении 2-2,5 объемами изопропанола активность ферментов в осадках сохраняется на 93-95% от исходной, pH обрабатываемого раствора 6,5-6,8.

Стандартизация ферментных препаратов. Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определенном количестве, которое зависит от полученной активности в культуре и препарате. Желательно, чтобы наполнитель по отношению к ферменту выступал и в роли стабилизатора, а не просто инертного соединения. Известно, что хорошим стабилизатором амилолитических ферментов хлористый натрий. С внесением наполнителя в виде 1 % хлористого натрия показали возможность получения из фильтрата культуральной жидкости и грибной культуры сухих амилолитических ферментных препаратов с индексом ГЗх. Количество наполнителя можно рассчитать по формуле:

S=-b

где S - количество наполнителя, необходимое для получения стандартного по активности препарата, кг; а - активность исходного препарата, ед. ФА/г; b - количество исходного препарата, кг; с - стандартная активность препарата, ед. ФА/г/

Сушка - удаление влаги из твердых и пастообразных материалов путем ее испарения и отводом образовавшихся паров. Движущей силой этого процесса является разница давлений насыщенных паров над влажным материалом и в газе.

Р = р* -р

Для обезвоживания ферментных растворов применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При высушивании ферментсодержащих материалов имеется ряд трудностей, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Сушку проводят распылением при мягком режиме (температура теплоносителя на входе 120 - 125 °С и на выходе 55 - 60 °С). Длительность распылительной сушки очень мала, пребывание препарата в сушильной башне ограничивается 5-8с. При соприкосновении массы с теплоносителем влага мгновенно испаряется, частицы охлаждаются и поэтому, несмотря на довольно высокие температуры теплоносителя на входе и выходе, препарат не нагревается более 35-40 °С. Потери активности сравнительно малы (7-10%).

5. Химический состав и физико-химические свойства сырья и полуфабрикатов

Кукурузная мука. Является самым дешевым продуктом из всех зерновых и ее цена зависит от степени измельчения (помола).

Таблица 1.5. Химический состав сырья

Содержание	%
Крахмал	67-70
Другие углеводы	10
Белки	12
Глютетелин	30
Зеин	50
Количество зольных веществ	0,92
Ангидрид фосфорной кислоты	45
Окись калия	30
Окись магния	15
Влажность не должна превышать	15

Гидролизаты древесины. Сама древесина является не очень «вкусным» сырьем для микроорганизмов, но после предварительной обработки - высокотемпературного кислотного гидролиза - превращается в гидролизаты. Целлюлоза и пентозаны гидролизуются до глюкозы и других сахаров. Содержание сахаров зависит от породы древесины и технологии гидролиза и составляет 4-8%. Кроме древесины можно использовать для тех же целей различные целлюлозосодержащие сельскохозяйственные отходы (солому, кукурузные кочерыжки, стебли хлопчатника и т.п.).

Дрожжевые гидролизаты в высушенном виде содержат до 52% органического азота, в основном в виде аминокислот.

Кукурузный экстракт - отход крахмалопаточного производства, получающийся путем упаривания жидкости от замачивания («настоя») кукурузных зерен (замочная жидкость) с содержанием сухих веществ не ниже 48%. В процессе замачивания происходит ферментный гидролиз белков кукурузы, вследствие чего около половины азотсодержащих веществ экстракта представляет собой смесь аминокислот, полипептидов и белков. Экстракт - темная вязкая жидкость, содержит 6,4-8% общего азота, не более 24% золы. В золу входят фосфор, калий, магний, причем фосфор - до 5%, частично в связанном состоянии в виде фитина. Имеются также витамины группы В (биотин), ростовые вещества и биостимуляторы. Таким образом, кукурузный экстракт представляет собой хорошую смесь источника питания.

Продуценты. Плесневые грибы рода Aspergillius, видов niger, orizae, usamii, awamori, batatae; рода Rhizopus, видов delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные представители Neurospora crassa и Mucor.

Плесневые грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания -- почва. Несмотря на наличие многих родов и видов плесневых грибов все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Гифы распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие или спорангиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки -- конидии.

Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит - в стадию споро- или конидиебразования. Споры и конидии плесневых грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску.

Аспергиллы являются типичными аэрофилами, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для, большинства аспергиллов 25--30°С, для некоторых -- до 35°С. Большинство грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40 и даже 45°С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65%.

Для питания аспергиллов необходимы азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода кроме моносахаридов, многих олиго- и полисахаридов могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. На средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу грибы амилазы не образуют. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты.

6. Расчет теоретического выхода целевого продукта

1. Составляем предварительную рецептуру синтетической питательной среды для выращивания биомассы:

компонент «С» - амилаза,

компонент «N» - кукурузный экстракт, (NH4), НР04.

Компонент «О» - воздух.

2. Составляем стехиометрическое уравнение:

у_А А + vВ+ v С>+F+G (4.1)



3. Для расчета стехиометрических коэффициентов составим формулу биомассы бактерий.

Элементарный состав биомассы: С -53%, Н-7%, N-12%, О- 20%, S-1% и золы -4%. В первом приближении формула биомассы бактерий имеет вид:

В гипотетической молекуле биомассы не может быть дробных атомов, поэтому умножим коэффициенты на 100: Н 700 0125 N 8б Р,0 S, В стехиометрических расчет допускается пренебрегать малоколичественными элементами (S). Для расчетов принимают молекулярную массу такой, чтобы в ней оказался I атом углерода. Для этого поделим на 442: CH1,8O0,3N0,24

4. Производим расчет С-моля биомассы бактерий:

M_с-моль=п_с ММ_С +п _н ММ _н + n ₀ ММ ₀ + n _N ММ _N (4.2)

ММS с-моль=l *12+1.8* 1+0.5* 16+0.2* 14=30

Расчет С-моля субстрата определяют исходя из формулы амилазы (С6Н1206)n так же как и для С-моля биомассы по формуле (4.2). После деления коэффициентов на 6 она имеет вид: (СН2O)n (4.3). Тогда молекулярная масса С-моля амилазы равна:

ММБМ с -моль=1 *12+1,8*1+0,5*16+0,2*14=24,6

5. Определяем теоретический выход биомассы по формуле:

Y = ММS c-моль/ММБМс-моль (4.4)

Подставив численные значения, получим: УБМ=24,6/30=0.85

6. Для определения количества субстрата затрачиваемого биомассой на энергетические нужды рассчитываем энергетический выход биомассы по формуле:

?=г_s/г_x (4.5)

где г s,г x- энергия, заключенная в субстрате и биомассе соответственно.

Расчет величин гs и гл осуществляем, используя степень восстановленное™ по элементам углероду, водороду, кислороду, азоту.

7. Степень восстановленности С-моля амилазы рассчитаем по формуле:

гs=4m + 1n - 2р - 3q, (4.7)

где 4,1,2,3 - числа свободных электронов, соответственно С, Н, О, N; m,n,p,q- индексы атомов при углероде, водороде, кислороде, азоте соответственно.

Подставив численные значения, получим: Гs =4* 1+1 *2-2* 1=4

Аналогично рассчитаем степень восстановления биомассы:

гs=4* 1 + 1* 1.8-2*0.5-3*0.19-3*0.2=4.2

Рассчитаем энергетический выход: ? =4/4.2=0.95

От этой величины можно перейти к обычному выходу биомассы:

YБМ=? MMsс-моль/MMБМс-моль (4.9)

YБМ= 0.95*0.85=0.807

8. Составляем стехиометрическое уравнение для синтеза биомассы бактерий, исходя из теоретического выхода биомассы Y БМ = 0.85, т.е. из 1кг пектина образуется 0.807 кг биомассы. Общее стехиометрическое соотношение обмена веществ имеет вид:

v s [S]+ v02[O2]+ vNH3[NH3] >X + vp[P]+ vco2[СО2]

По рецептуре на долю углеродсодержащего сырья (кукурузной муки) приходится 2 кг с влажностью 10%. Доля СВ 1.8 кг. Количество амилазы составляет:

Х=(1.8*22)/100 = 0.396 кг,

где 22 - содержание амилазы в кукурузной муке (в %).

Общий азот из кукурузного экстракта:

х = 0.9*7/100=0.063 кг, где 0.9 - масса кукурузного экстракта, кг,

7 - содержание общего азота в кукурузном экстракте, в %.

Азот из (NH4)2 НРО 4: 0.8*28/132=0.169 кг, где 0.8 - масса соли, кг,

132 - молекулярная масса соли, кг/кмоль

+ 0.169 = 0.232 КГ

9. Рассчитаем стехиометрические коэффициенты обмена веществ.

vs = 0.396/2=0.198

vs=0.232/(0.45=0.8)=0.186

vsns + vNH3 *3 = 1.58 + vpnp

vp=(vsns+vNH3*3-1.8)/np

vp = (0.198 * 7 + 0.186 *3 -1.8)/1256 = 0.0006

vsms =1 + vpmp +vCQ2

vco2 = vsms -1 - vpmp

vC02 = 0.198 * 6 - 1 - 0.0006 * 510 = 0.178



Общее стехиометрическое соотношение обмена веществ имеет вид:

198((С6H12O6)n) + 0.186(NH3)>CH1.8O 0.3N 0.24 +

0006(C510H12560413N250) + 0.178(CO2)

7. Особенности применения продукта в производстве продуктов питания

амилаза биотехнологический

Амилазы находят применение почти во всех областях, где перерабатывается крахмалсодержащее сырьё. Амилазы используются для осахаривания зернового и картофельного крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в настоящее время солод (пророщенное зерно) успешно заменяется амилолитическими ферментными препаратами. Эти препараты используются в хлебопечении, а также в крахмалопаточном производстве для получения различных видов паток, глюкозы и глюкозо- фруктозных сиропов. Амилазы используются для улучшения качества концентратов и быстроразвариваемых блюд, большую перспективу представляют амилолитические ферментные препараты для промышленности, изготовляющей моющие средства. Там термостабильные и щелочеустойчивые амилазы могут быть прекрасной биологической добавкой для снятия углеводных загрязнений. Амилазы используются в текстильной промышленности для расшлихтовки тканей и приготовления высококонцентрированных клейстеров крахмала в процессе крашения тканей. В последнее время уделяется внимание использованию амилаз при переработке различных крахмалсодержащих отходов в кормовые белковые препараты. Высокоочищенные амилазы применяются для аналитических целей и в медицине.

В настоящее время большое внимание уделяется разработкам схем по применению концентрированных ферментных препаратов в хлебопечении. Показано, что ферментные препараты могут быть широко использованы в качестве улучшителей хлебопекарных свойств как пшеничной, так и ржаной муки. При добавлении препарата амилоризина П 10х в количестве 0,002- 0,004 % к массе муки повышается удельный объём хлеба, существенно улучшаются физико- механические свойства мякиша, становится более интенсивной окраска корки и более приятным вкус и аромат. Амилолитические препараты из Asp.oryzae и A. awamori оказывают положительное влияние на процесс приготовления заквасок и жидких дрожжей. В связи с улучшением бродильной активности заквасок и жидких дрожжей сокращается продолжительность брожения полуфабрикатов на 25- 30 % и длительность расстойки при одновременном улучшении качества хлеба. Нельзя забывать о том, что в подавляющем большинстве случаев ферментные препараты представляют собой комплексы большого числа ферментов. При действии этих комплексов может присходить не только гидролиз крахмала, но и гидролиз других компонентов муки. С этой точки зрения весьма нежелательно присутствие в препаратах активных протеиназ. Отмечено, например, что протеиназа препарата П 10х Asp. Oryzae оказывает отрицательное воздействие на клейковину муки из мягких пшениц. В то же время она неоходима при переработке муки из твёрдых пшениц, когда воздействие фермента на недостаточно эластичную клейковину дает положительный эффект. В последнее время обращено внимание на использование в хлебопечении препаратов, содержащих активную глюкоамилазу. Особая роль отводится препаратам из Asp. Awamori и Rh. Delemar, содержащих малоактивную протеиназу.

В пивоваренном производстве главная задача- получить высокий выход экстрактивных веществ из перерабатываемого сырья. Основным сырьём здесь является солод. Выход экстракта находится в тесной взаимосвязи с активностью гидролаз, образованных при солодоращении и со степенью растворения солода. Особенно велика роль амилаз. Она заключается в максимальном извлечении крахмала из солода и переводе этого субстрата и сбраживаемые углеводы. Однако в пивоварении в противоположность спиртовому производству не стремяться осахарить конечные декстрины. Они необходимы в сусле, поскольку в дальнейшем создают полноту вкуса пива, в определенной степени обуславливают его пеностойкость.

Гидролиз крахмала в сбраживаемые сахара (мальтозу, глюкозу) и конечные декстрины осуществляется в процессе затирания. Основными факторами, с помощью которых регулируют специфичность и интенсивность действия амилаз, являются температура и pH среды. Интервал температур 60- 65"С является оптимальным для образования сбраживаемых сахаров. В интервале температур 70- 75"С происходит быстрый перевод крахмала в экстракт с образованием большого количества декстринов. Регулируя продолжительность эти двух температурных фаз, можно добиваться оптимального соотношения между количеством сбраживаемых сахаров и декстринов, определенной степени сбраживания пива, его высокой коллоидной стойкости и пеностойкости. Важное значение здесь имеет не только активность амилаз солода, но и их различная термостабильность.

Существенное влияние на гидролиз крахмала при затирании окозывает концентрация Н - ионов. При высоких значениях pH (6,2-6,5) скорость гидролиза крахмала уменьшается, замедляется фильтрация сусла, а пиво становится менее стойким при хранении. Оптимальным pH при затирании следует считать 5,3- 5,6, чего можно достичь внесением в затор молочной кислоты.



Список используемой литературы

1. Иванова А.А. Л.И. Войно, И.С. Иванова. Пищевая биотехнология. М.: Колос С, 2008 -- 427 с.

2. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов - М.: Агропромиздат., 2008 - 358с.

3. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии: Учеб. пособие для вузов. - М.: Колосс, 2004.

4. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. Издательство: М.: ДеЛи принт, 2002 г

5. Кулев Д.Х., Шарова Н.Ю. Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов. Издательство. М., ДеЛи принт, 2008.

6. Сайты: Биотехнология, Ферменты

7. Патенты РФ, источник - www.fips.ru

Размещено на Allbest.ru