Перспективы внедрения трансплантации костного мозга в Республике Узбекистан

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДИССЕРТАЦИЯ ПО ТЕМЕ:

ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА В РЕСПУБЛИКЕ УЗБЕКИСТАН



ВВЕДЕНИЕ

Известно, что химиотерапия является базисным средством лечения гематологических больных. Химиотерапия представляет собой использование с лечебной целю препаратов, обладающих способностью блокировать пролиферацию или уничтожить опухолевые клетки. При создании новых противоопухолевых препаратов безоговорочным условием является их максимальное ингибирующие действие на опухолевые клетки при минимальном повреждении нормальных.

Долгое время поиск противоопухолевых средств осуществлялся чисто эмпирически. С открытием молекулярной биологии стало возможным создавать противоопухолевые препараты направленного, нацеленного действия (таргетные), которые создаются с учетом не только клеточного цикла, но и созданием механизма их контроля и поддержанием генетической определенности. Совершенствование химиотерапии как этапа комплексного лечения лейкозов продолжается. Большим достижением терапии лейкозов и депрессий кроветворения является трансплантация костного мозга [14]. И хотя история трансплантации костного мозга насчитывает уже не один десяток лет, успешное развитие молекулярно-генетических исследований опухолевых заболеваний, позволило мониторировать полноценность и эффективность терапии, значительно улучшило прогноз и повысило вероятность приживляемости трансплантата и процент выздоровления[22,29,48].

Рассматривая возможные варианты внедрения трансплантации костного мозга в Узбекистане, самым приемлемым для начала на данном этапе мы видим аутологичную пересадку стволовых клеток костного мозга (далее ТКМ и/или СКК). Смысл аутологичной пересадки - сократить время постхимиотерапевтической аплазии костного мозга и обеспечить рост здоровых, жизнеспособных, полноценных клеток.

По мировым данным при проведении аутологической пересадки костного мозга длительность жизни, а также безсобытийный период болезни можно значительно удлинить[23,34,84,110,]. Иначе говоря, аутологическая пересадка костного мозга влияет на продолжительность и качество жизни. Преимуществом аутологической пересадки костного мозга является и экономическая выгодность. [5,6] Один курс химиотерапии вместе с сопроводительной терапией обходится государству в миллионы сум, и таких курсов больной вынужден получать всю жизнь для поддержания стойкой ремиссии.

В случае аутологической пересадки проводят 2-4 курса ПХТ (кроме использования препарата мельфолан т.к. мельфолан сильный миелотоксичный препарат и сбор аутологических стволовых клеток становится невозможным), до достижения хотя бы частичной ремиссии, производится сбор собственных стволовых клеток и затем следует немиелоаблятивный режим кондиционирования. В режиме кондиционирования предусматриваются высокие дозы цитостатических препаратов, которые обеспечивают гибель всех опухолевых клонов. И на опустошенный от опухолевых клеток костный мозг «всаживают» собственные стволовые клетки, полученные в момент ремиссии. Обычно инграфмант «приживление» происходит на 14-16 день после пересадки. [15,20,] Далее больной наблюдается в течение 100-120 дней, после чего возвращается к обычной жизни, избегая ежемесячных курсов химиотерапии. Конечно, есть вероятность, что произойдет рецидив заболевания через несколько лет. [28,40,90] Однако огромная разница между тем, что получать химиотерапевтические препараты, имеющие особое негативное влияние на внутренние органы, особенно печень, почки, желудочно-кишечный тракт и непрерывно наблюдаться в клинике и тем, чтобы вернуться к обычной жизни, пусть даже на определенный срок, и не зависеть от препаратов.

Актуальность выбранной темы: За последние 10-15 лет в мировой гематологии произошли разительные перемены, позволяющие добиваться колоссальных результатов в лечении потенциально смертельных, в прошлом, заболеваний системы крови. Так, при лечении острых лейкозов удается добиваться полного выздоровления в 20-30% случаев среди взрослых, а у детей этот показатель достигает 70%, тогда как ранее этот показатель имел значительно более низкое значение. [17,19,] При лимфатических опухолях частота полных выздоровлений достигает в среднем 70-80%[32,86,117]. Это достигается благодаря внедрению современных диагностических и лечебных методик, требующих больших капиталовложений, обеспеченности квалифицированными кадрами и совместной работы целого перечня различных служб. Лечение онкологических заболеваний кроветворных органов заключается в применении высокодозной химиотерапии, лучевой терапии, пересадки периферических стволовых клеток крови или костного мозга, что сопровождается высокой вероятностью развития различных, порой, фатальных осложнений. [26.]

Ввиду повреждения родоначальных клеток кроветворения, наблюдается дисбаланс и дезориентация кроветворения. [8,25,62] В случае с лейкозами, потомство изначально мутировавшей, озлокачествленной клетки благодаря безудержному опухолевому росту, заполняет как костный мозг, так и метастазирует во все органы и ткани. [38,96] В случае с апластической анемией, депрессия кроветворения приводит к опустошению костного мозга[73]. То есть, костный мозг в таких случаях либо продуцируют избыточное количество дефектных или незрелых клеток крови (в случае лейкоза), или резко уменьшает выработку клеток кроветворения (при аплазии кроветворения).

При лейкозах для эррадикации опухолевых клеток крови и костного мозга требуются большие дозы химиотерапии и/или радиотерапии. [19,44,114] Агрессивная химиотерапия, используемая для лечения лейкозов, разрушает клетки костного мозга. Такое лечение повреждает не только «дефектные», но и здоровые клетки[53,54,82].

На сегодняшний день в Республике Узбекистан насчитывается порядка 6870 больных с различными гемобластозами и депрессией кроветворения. По статистическим данным НИИГ и ПК МЗ РУз показатель заболеваемости в Узбекистане на 100 тыс. населения в год составил 13 случаев, что составляет около 2.500 первичных больных по Узбекистану. За 2010 гг. в клинику НИИГ и ПК было госпитализировано 792 больных с острыми лейкозами, 653 больных с хроническими лейкозами и 55 больных с апластической анемией. На сегодняшний день на диспансерном учете в НИИГ и ПК состоит около 4.500 больных с гемобластозами (в среднем 4-5 первичных больных в день).

Эмпирические пересадки костного мозга, осуществленные в НИИГиПК МЗ РУз в 60-70 гг. не были облечены в стройную последовательную и технологически выверенную систему, в связи с чем не получили дальнейшего развития и этот опыт надолго остался эпизодом в трансплантации[1,10].

К сожалению, анализ показателей заболеваемости гемобластозами за последние годы не имеет тенденции к снижению, что обусловлено многими причинами, в том числе недостаточной изученностью патогенетических механизмов, недостаточной эффективностью проводимой терапии.

Европейская группа по трансплантации костного мозга (ЕГТКМ) была основана в 1975 году, и с этого времени количество центров, объединяемых этой группой, выросло с 10 до 361. За последние 25 лет в базу данных ЕГТКМ поступила информация о 75 000 пациентов, которым была проведена высокодозная химиотерапия с последующей трансплантацией костного мозга. [33,92,117] К настоящему времени около 30 % проведенных трансплантаций -- аллогенные, а 70 % -- аутологичные [42,68,]. Ежегодно отмечается прирост количества выполненных трансплантаций: аутологичных -- на 4 % и аллогенных -- на 8-9 % в год [16]. Помимо ведения регистра трансплантаций, ЕГТКМ участвует в разработке и проведении проспективных исследований, обучении персонала и создании стандартов высокодозного лечения в Европе [78,113]. В настоящее время в мире ежегодно проводится более 10000 операций, а пятилетняя безрецидивная выживаемость больных после трансплантации костного мозга достигает 50-80% [13].

Опыт ведущих центров по трансплантации костного мозга показывает, что метод ТКМ приводит к радикальному излечению больных с такими грозными диагнозами как гемобластозы и депрессии кроветворения [15,83]. Пересадка костного мозга позволяет врачам лечить такие болезни с интенсивной химиотерапией или облучением с последующей заменой больного или поврежденного костного мозга здоровым [11]. ТКМ является неотъемлемой частью программы лечения ряда гематологических заболеваний, которая обеспечивает полное выздоровление или более стойкую ремиссию, меньшую токсичность ПХТ, а также меньшие затраты на лечение по сравнению с больными, получающими стандартную ПХТ. [12] Исходя из вышесказанного, внедрение в клиническую практику ТКМ является необходимой частью программного лечения гематологических заболеваний. Таким образом, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток это безусловный прогресс современной биомедицины, так как благодаря только этому методу многие злокачественные болезни крови стали принципиально излечимыми (например, некоторые формы гемобластозов). Сегодня современная гематология уже не мыслима без трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и список болезней, где этот метод применим, включает более 50 позиций. [16,69,108] В настоящее время на базе НИИГиПК открыт центр по пересадке костного мозга, где созданы условия для проведения ТКМ с учетом мировых требований.

Центр по пересадке костного мозга (стволовых клеток) на базе НИИ Гематологии и переливания крови МЗ РУз позволит адекватно обеспечить соответствующей медицинской лечебной помощью больных с гемобластозами и гемодепрессиями в Республики Узбекистан.

Вышеизложенное позволяет сформулировать цель диссертации и её задачи.

Цель: Подготовить больного с Множественной миеломой (ММ) к аутологичной трансплантации костного мозга в условиях НИИГ и ПК МЗ РУз.

Задачи исследования:

Разработать и определить этапы для осуществления аутологичной трансплантации костного мозга (ТКМ) в условиях НИИГ и ПК.

Разработать и определить показания и противопоказания к проведению аутоТКМ у больных с ММ.

Определить круг необходимых исследований для отбора больных ММ на аутоТКМ.

Подготовить больного с Множественной Миеломой к аутоТКМ и разработать критерии определения эффективности аутоТКМ.

Научная новизна:

- Впервые определены условия и этапы для осуществления ТКМ в условиях НИИГиПК.

- Впервые определены показания и противопоказания к проведению аутоТКМ у больных ММ.

- Впервые определен круг необходимых исследований для отбора больных на аутоТКМ и мониторинг основных систем.

- Впервые разработаны критерии эффективности ТКМ.

Материалы и методы:

Было обследовано 50 больных с верифицированным по основным критериям диагнозом ММ. 11 больных получили полихимиотерапию по внедренному протоколу. Четверым из этих больных планируется проведение аутологичной пересадки костного мозга с целью полного выздоровления, увеличения безсобытийного периода заболевания или с уменьшением клинических признаков заболевания, отсутствием необходимости в проведении курсов полихимиотерапии, что в целом улучшает качество жизни и прогноз.

Исследование и разработка программы проводятся в ТМА и в единственном в Центральной Азии Центре трансплантации костного мозга на базе НИИ Гематологии и Переливания крови МЗ РУз, г. Ташкент, в котором проводится диагностика, лечение больных с заболеваниями крови, обучение медицинских кадров, научная работа, координация работы службы крови на местах.

Практическая значимость

Разработка, осуществление и широкое внедрение метода аутологичной трансплантации костного мозга в практическую гематологию позволит повысить эффективность лечения, прогноз, качество жизни и выживаемость больных с лейкозами и гемодепрессиями, что также имеет прямую экономическую выгоду.



ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Исторические аспекты ТКМ

Первая попытка применить донорский костный мозг для лечения пациентов, больных лейкозами, была предпринята в позапрошлом столетии. В 1891 г. двое французских врачей Brown- Sequard и d'Arsonaval давали таким больным человеческий костный мозг перорально [4, 7].

Следующее упоминание способа лечения с использованием костного мозга встречается после почти пятидесятилетнего перерыва. Так, в 1937 г. Schretzenmayer предложил внутримышечные инъекции свежеаспирированного аутологичного или аллогенного костного мозга от случайных доноров больным анемиями, в 1939 г. описано внутривенное и внутрикостное введение больным костномозговой взвеси [10, 18, 97]. А год спустя (в 1940 г.) в журнале JAMA Morrison и Samwack опубликовали наблюдение за больным апластической анемией, картина крови которого полностью нормализовалась после инъекции в грудину 13 мл костного мозга от брата.

В середине 40-х гг. Jean Bernard впервые показал, что трансплантат костного мозга целесообразно вводить внутривенно, так как при внутрикостном введении его клетки все равно сразу вымываются в кровь, и хотя в последующие годы проводились неоднократные попытки внутривенного введения донорского костного мозга больным, приживления трансплантата и образования «химеры» не достигалось. [97] Причиной тому была иммунологическая несовместимость, о существовании которой уже было известно. В 1948 г. появились факторы, способные привести к супрессии иммунной системы реципиента, достаточной для приживления трансплантата, одним из которых стала ионизирующая радиация. В 1948 г. L. Jacobson впервые показал, что введение стронция [91,97] приводит к аплазии костного мозга у мышей, а в 1951 г. Е. Lorenz продемонстрировал, что мыши, облученные в летальной дозе, могут пережить костномозговую аплазию, если им внутривенно инфузировать сингенные костномозговые клетки [2,10].

К середине 50-х гг. в эксперименте были обнаружены некоторые химические вещества, способные разрушать костный мозг подобно радиации. Ими оказались диметилмилеран и циклофосфан [9].

Результаты исследований ТКМ у животных стимулировали интерес к этой проблеме клиницистов, занимающихся лечением гемобластозов. При лейкозах химиолучевая терапия вполне могла оказаться эффективной, если бы пациенту удалось при помощи ТКМ пережить период пост цитостатической аплазии кроветворения. Но естественно, не было доказательств, что лечение, проводимое на животных, может быть применено у человека. [75,89,] Неясен был даже вопрос, можно ли перелить пациенту внутривенно без осложнений достаточное количество (400-600 мл!) костномозговой взвеси. [24,37] Поэтому в течение 10 следующих лет наряду с продолжением исследований в лабораториях ТКМ постепенно, но все более широко изучается в клинике. Будучи экспериментальным, этот метод лечения выполнялся главным образом у пациентов в терминальной стадии болезни [3, 13].

Первая публикация по использованию ТКМ в клинике [7] появилась в 1957 г. [Thomas E.D. et al]. В статье рассматривались технические подробности аспирации костного мозга из подвздошной кости донора, приготовление костномозговой взвеси, возможность ввести взвесь больному без эмболии легких. Делались попытки установить достаточную для приживления трансплантата дозу облучения реципиента. Впервые приживление трансплантата получено в 1959 г. Томасом с соавт. у двоих детей после тотального облучения в дозах 1140 и 850 рад и ТКМ от сингенных доноров. Оба ребенка вскоре погибли от рецидива лейкоза [8].

В 1968 г. G. Mathe. отмечая, что некоторые «технические» проблемы ТКМ у человека решены, характеризует общий десятилетний итог использования этого метода лечения в клинике как крайне не удовлетворительный. К этому времени в литературе описаны 417 случаев аллогенных ТКМ, из них только в трех случаях трансплантат существовал достаточное количество времени [9,17,35]. Лишь 10% больных имели временное улучшение течения болезни, связанное с ТКМ [27,94,100]. Большинство реципиентов умирали до появления признаков приживления костного мозга. Новая «волна» интереса к ТКМ возникла с открытием законов гистосовместимости и возможностей тканевого типирования. О существовании лейкоцитарных антигенов было известно с 1926 г. [93,97]

Большинство иммунологических правил, использующихся при ТКМ были открыты и разработаны в опытах па мышах в период 1967 по 1972 1г. (van Bekkiim. Trenlin) и на собаках к 1972 г. (Thomas. Storb,). Опираясь на эти правила, группа врачей под руководством Thomas с 1969 г. по 1973 г. выполнила около 50 аллогенных ТКМ при апластической анемии и лейкозах; приблизительно каждый третий больной пережил год после операции, сохраняя функционирующий трансплантат. [1,76]

Трансплантация костного мозга (ТКМ) применяется во многих странах, в том числе и в России с 1974г. [10,97] За этот срок в России накоплен значительный опыт аутологичной трансплантации (т.к. эта операция сравнительно проста и безопасна, улучшает качество жизни, внедрена в клиническую практику), а также отмечены первые успехи трансплантации аллогенной. Применение этой процедуры может значительно продлить жизнь (добиться клинического излечения) при ряде гемобластозов, однако сопряжено со значительными техническими, организационными и материальными проблемами, высоким (в среднем до 25%) риском непосредственного летального исхода. (Из материалов конференции онкологического научного центра им.Н.Н. Блохина 2009г)

Еще в 1999 г. в материалах конференции по проблемам трансплантации КМ констатировалось: «Мучительно медленно продвигается этот метод в России… Причины - медицинская и научная бедность, общий низкий уровень биологического и медицинского образования и технологий, недостаточный опыт исследования эффективности новых, редких и дорогостоящих методов лечения…». [3,7] За 1970-е - 2000-е гг. в России, менее чем в 10 высокоспециализированных трансплантационных центрах, выполнено порядка тысячи аллогенных трансплантаций КМ у взрослых (В Западной Европе - более 7 тысяч в год.). [72,114] Причины столь редкого выполнения аллогенной трансплантации в России - это не только недостаточное финансирование (затраты на проведение лечебной процедуры в РФ соответствуют (500-1500 тыс. руб.; стоимость такого лечения за рубежом достигает $200-300.000), но и высокий риск развития реакции трансплантат против хозяина, который нередко ведет к гибели больного. В здравоохранении нет национального регистра доноров-добровольцев, отсутствуют сертифицированные лаборатории типирования (соответствия антигенной структуры донора и реципиента); недостаточен опыт ведения больных после трансплантации; нуждается в совершенствовании материально-техническая база трансплантационных центров. [10,11] Отделение трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина создано в 1989 г. Благодаря значительной модернизации в 2000-х гг., (оборудование палат с ламинарным потоком стерильного воздуха, применение воздушных фильтров и др. аппаратуры), значительно возросли его лечебные возможности. Вдвое увеличилось число аутологичных трансплантаций (с 20 до 40 в год), внедрена в клиническую практику методика аллогенных трансплантаций с миелоаблативным режимом кондиционирования. Снизилась летальность, непосредственно связанная с аутотрансплантацией (16% в 2005 г. с последующим нулевым показателем). [19,97].

1.2 Гемопоэтические стволовые клетки

Известно, что все гемопоэтические клетки, лимфоидные или миелоидные, происходят от одной общей плюрипотентной стволовой клетки, способной как к непрерывному самовоспроизводству, так и к поступательной дифференцировке [1,2]. Как только указанная клетка созревает, она изначально сохраняет способность к самовозобновлению, но при этом становится детерминированной (т.е. способной дифференцироваться) в направлении одной или нескольких гемопоэтических линий, например, в направлении гранулоцитарно-моноцитарной или лимфоидной линии. Эти частично детерминированные клетки-предшественники впоследствии становятся полностью детерминированными, т.е. способными дифференцироваться в один тип клеток, теряют способность к самовозобновлению и в конце концов созревают в зрелые гемопоэтические клетки, такие как гранулоциты, моноциты, В-клетки и Т-клетки. В моделях на животных показано, что менее чем 10 плюрипотентных стволовых клеток способны восстановить полный гемопоэз реципиента в течение нескольких недель после трансплантации. [79,95] На рис. 1 представлена общая схема дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток.

Рис 1



1.3 Пролиферация гемопоэтических стволовых клеток: роль микроокружения

Доказано, что сложная структура костного мозга обеспечивает тесное взаимодействие кроветворных клеток с регуляторным микроокружением. Быстроделящиеся колониеобразующие единицы селезенки располагаются вдоль костных балок, в то время как медленноделящиеся - ближе к центру. Можно думать, что такое распределение клеток не случайно и поддерживается веществами, выделяемыми микроокружением - липоцитами, фибробластами, эндотелиальными клетками, макрофагами и Т-лимфоцитами. [21,77,108] Однако роль этих клеток пока не ясна и неизвестно даже, входят ли они в состав микроокружения in vivo. [31,80,88]

Имеются данные, что долгосрочных культурах костного мозга созревающие клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки располагаются в культуральной среде, в то время как стволовые клетки и ранние клетки-предшественники тесно связаны со стромой. [36,97] Поэтому агрегаты клеток стромы и кроветворных клеток, выделенные из свежезаготовленного костного мозга, богаты ранними кроветворными клетками. Их контакт со стромой обеспечивают молекулы адгезии. [99] Обилие адгезивных взаимодействий свидетельствует об их важной роли в регуляции кроветворения. [111]

Процессы, отвечающие за состояние покоя, самоподдержание и коммитирование стволовых клеток, пока изучены плохо. Вероятно, в этом участвуют как внешние, так и внутренние факторы. [81,103] CD-34 специфические клетки костного мозга адсорбируются к строме и обогащены предшественниками гранулоцитов/ макрофагов (Liesveld J.l., ea, 1989).



1.4 Источники стволовых клеток

Стволовые клетки костного мозга. Большинство гемопоэтических клеток-предшественников находится в костном мозге, поэтому костный мозг является традиционным источником этих клеток для целей трансплантации (см. табл. 1). [43] Важно представлять, что в нормальных условиях только 1-3% клеток костного мозга имеют маркеры CD34. [39,65] Когда забирается костный мозг для диагностики или в целях трансплантации, 25-75% полученного материала фактически составляет периферическая кровь; поэтому подсчет количества CD34 костного мозга в значительной степени зависит от качества полученного материала. [11,30]

Практически целью забора костного мозга в операционной, как правило, является получение достаточного общего объема или общего числа ядросодержащих клеток в большей степени, чем получение общего числа исключительно CD34. [67] Именно по этой причине, а также и потому, что затраты времени на подсчет количества CD34 значительны, это исследование в таких условиях относительно бессмысленно. Обычно костный мозг забирается из расчета 10 мл/кг массы тела реципиента, что позволяет получить окончательную дозу ядросодержащих клеток в пределах 1-4 х 109 клеток/кг. [85] Это количество составляет только 1-5% общего объема костного мозга и не приводит к снижению числа лейкоцитов и тромбоцитов у донора. Изменение гематокрита у донора пропорционально тому, что произошло бы при потере аналогичного объема периферической крови. Серьезные осложнения в результате забора костного мозга встречаются редко (составляют 2-3 на 1000), и свыше 90% добровольных неродственных доноров заявляют, что они хотели бы стать донорами во второй раз [1].



Таблица 1 - Источники гемопоэтических стволовых клеток

	Характеристика
Костный мозг	* «Традиционный» источник клеток-предшественников * Требует проведения забора в операционной (под общей или местной анестезией), 10-15 мл/кг веса реципиента * Очень низкий уровень осложнений (осложнения анестезии, местные нейропатии, боль, локальная инфекция) * Возможные преимущества включают относительно низкое содержание Т-клеток *Используется преимущественно при аллотрансплантации
Периферическая кровь Кровь	* Требует мобилизации клеток-предшественников донора с помощью химиотерапии, гемопоэтических ростовых факторов или того и другого, в среднем 1-3 процедуры афереза (конечная доза 2-10х 10^9 СD 34 клеток/кг)
	*Очень низкий уровень осложнений (тромбоз катетера или инфекция, тромбоцитопения, гипокалийемия, артериальная гипотензия, осложнения, обусловленные использованием ростовых факторов) Преимущества включают более быстрое приживление и при проведении аутологической трансплантации возможность более низкого уровня контаминации опухолевыми клетками: поэтому наиболее часто используется при аутотрансплантации Используется преимущественно при аутотрансплаитацни
Пуповинная кровь	Забирается из пуповинного остатка или плаценты после родов (50-150 мл) Хранится для возможного использования у ЭТОГО же человека в дальнейшей жизни или криоконсервируется в «банке» после HLA- тнпирования для использования у других реципиентов

Известно, что костный мозг представляет собой мягкое, губчатое вещество, находящееся в центре большинства крупных костей человеческого скелета. Костный мозг это кроветворный орган и производит все клетки составляющие кровь, такие как красные и белые кровяные тельца, тромбоциты. [2,7,9]

Все эти клетки происходят из клеток-предшественниц, находящихся в костном мозге и называемых кроветворными стволовыми клетками. Организм человека может управлять развитием стволовых клеток в зависимости от текущих потребностей в определенных компонентах крови. Этот процесс чрезвычайно активен, т.к. в костном мозге в час производятся миллионы разных клеток. [71,112] Большая часть кроветворных стволовых клеток находятся в костном мозге до их превращения в различные клетки крови, которые затем попадают в кровоток. [111] Однако небольшое количество стволовых клеток может быть найдено в циркулирующей крови, что позволяет выделять их оттуда при определенных условиях. Существуют различные способы для увеличения количества стволовых клеток в периферической крови перед их забором. [14]

Стволовые клетки из периферической крови. Гемопоэтические предшественники циркулируют в периферической крови обычных людей в нормальном состоянии, хотя в очень небольшом количестве (около 0,5-5,0 CD34 клеток на миллилитр с очень большим стандартным отклонением). [35,98] При некоторых заболеваниях, таких, как хронический миелолейкоз, количество циркулирующих стволовых клеток увеличивается в 20 - 100 раз. Для клинической практики более важно, что предшественники также мобилизуются в кровь после проведения химиотерапии. Степень мобилизации после химиотерапии, похоже, коррелирует со степенью миелосупрессии, что также является важным для выбора препаратов с относительно небольшой по продолжительности токсичностью в отношении стволовых клеток, таких, как циклофосфамид или этопозид. [93,101]

Соответственно гемопоэтические ростовые факторы, такие, как Г-КСФ или ГМ-КСФ, также эффективно мобилизуют клетки-предшественники в кровь, в результате увеличивается количество циркулирующих CD34 (также в пределах 20--100 раз, но опять же с сильным индивидуальным колебанием). [14,76] Отсюда следует, что применение одной или обеих этих стратегий мобилизации делает более целесообразным использование стволовых клеток периферической крови (СКПК), забранных путем афереза, нежели использование стволовых клеток костного мозга.

Отмечено что, различные факторы влияют на успех и неудачу мобилизации стволовых клеток периферической крови. Наиболее критические включают основное заболевание, наличие опухолевых клеток или фиброза в костном мозге, предшествующее облучение костей таза и предшествующую химиотерапию с использованием клеточных токсинов, таких, как алкилирующие агенты или производные нитрозомочевины. [45,51,102] Забор СКПК проводится с учетом общего количества мононуклеарных клеток или количества CD34. [46] Среднее предполагаемое количество составляет 2-8 х 10б CD34+ клеток/кг. Количество CD34 периферической крови хорошо коррелирует с количеством CD34, полученных в конечном продукте афереза. [49] Некоторые исследования показывают, что у пациентов, получивших дозу CD34 свыше 5 х 106/кг, приживление трансплантата наступает значительно быстрее. [104,108] Возможно, требуется значительно большая доза забираемых клеток, если конкретный клинический протокол включает дальнейшие манипуляции с костным мозгом; например, отбор положительных стволовых клеток или удаление опухолевых клеток или клеток, участвующих в реакции «трансплантат-против-хозяина» (РТПХ) (Т-клеток). [109] Этот принцип справедлив независимо от того, производится забор стволовых клеток костного мозга или периферической крови.

При аутологической трансплантации СКПК теоретически имеют второе преимущество перед стволовыми клетками костного мозга, а именно: вероятность того, что будет меньшая степень контаминации опухолевыми клетками. [57,58] Хотя инфузат СКПК обычно содержит значительно большее количество ядросодержащих клеток по сравнению с таковым костного мозга, было выявлено, что процент содержащихся в крови опухолевых клеток значительно ниже, поэтому абсолютное число переливаемых опухолевых клеток зачастую меньше для этого продукта. Более того, результаты нескольких исследований показали увеличение выживаемости без признаков заболевания при использовании СКПК в противоположность использованию клеток-предшественников костного мозга. [41,107] Таким образом, хотя все положения еще достаточно спорны, эти данные предполагают возможные дополнительные преимущества СКПК при аутологической трансплантации.

Стволовые клетки пуповинной крови. В течение последних лет к наиболее важным потенциальным источникам ГСК относят пуповинную кровь [8, 9,50]. Хотя среднее количество пуповинной крови, остающейся в плаценте после родов, относительно мало (50-150 мл), концентрация клеток-предшественников (и, возможно, примитивных стволовых клеток) является достаточной для успешного приживления трансплантата у детей с массой до 40 кг и у некоторых взрослых без дополнительного забора стволовых клеток даже при аллогенной трансплантации. За рубежом уже существуют банки для хранения образцов HLA-типированной криозаконсервированной пуповинной крови для использования в качестве источника клеток-предшественников у неродственных реципиентов (Лондонский, Нью-Йорский, Парижский и др.). [55, 106] Не исключено, что создание таких банков окажется потенциально полезным в будущем, особенно для пациентов, которые имеют относительно редкие HLA типы [15]. Кроме того, экономически выгодно обеспечить криоконсервированной пуповинной кровью людей в качестве источника аутологических клеток для возможного индивидуального использования. Об отдаленных результатах использования стволовых клеток пуповинной крови в клинической практике в качестве источника аутологических клеток-предшественников говорить еще рано, история использования этой разновидности клеток насчитывает 15 лет, причем, только в течение последних 6 лет начали работать банки пуповинной крови [10, 11, 12].

Гемопоэтические ростовые факторы. Для развития и дифференцировки гемопоэтическим стволовым клеткам необходимы специфические растворимые белки, известные как ростовые факторы, а также специфическое клеточное окружение. Клеточное окружение, необходимое для роста, может определяться как кроветворная строма или микроокружение. [7,8,105] Соответствующие тины клеток и необходимые для микроокружения трехуровневые структуры находятся в костном мозге, однако другие органы, такие, как печень и, возможно, селезенка, могут также обеспечивать рост ГСК внутриутробно или, при определенных обстоятельствах, во взрослой жизни. Растворимые вещества, отвечающие за нормальный миело- и лимфопоэз, в совокупности известные как гемопоэтические ростовые факторы, включают цитокины, которые оказывают преимущественное действие на наиболее примитивные стволовые клетки (например, интерлейкин-3, flt-З лиганд и фактор стволовых клеток), т.е., которые действуют на многих уровнях, например, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), и те, которые преимущественно влияют на рост и дифференцировку более зрелых предшественников (например, эритропоэтин и тромбопоэтин). [115] Применение некоторых из этих цитокинов в качестве фармакологических препаратов оказало значительное влияние на клиническую практику и позволило использовать периферическую кровь в качестве источника ГСК [3].

1.5 Трансплантация стволовых кроветворных клеток по мировым данным

Миелотрансплантация метод лечения гематологических, онкологических и аутоиммунных заболеваний, при котором пациенту после индукции глубокой депрессии иммунной системы, обусловленной применением режимов кондиционирования (большие дозы цитостатиков общее облучение тела), вводят предварительно заготовленные костный мозг или стволовые кроветворные клетки (СКК) периферической крови. [10,11,47,56,90]

Выделяют следующие основные виды миелотрансплантации:

1) аллогенную трансплантацию, при которой больному вводятся СКК от родственного или неродственного донора, совместимого по системе HLA;

2) аутологичную трансплантацию, когда реципиент получает предварительно заготовленные собственный костный мозг (АТКМ) или СКК периферической крови (АТСКК).

Разновидностями аллогенной трансплантации являются: а) аллогенная трансплантация костного мозга (АлТКМ); б) аллогенная трансплантация СКК периферической крови (АлТСКК); в) сингенная трансплантация (трансплантация костного мозга или СКК периферической крови от однояйцевого близнеца); г) аллогенная трансплантация СКК пуповинной крови (используется у детей). [10, 60,113]

Аутологическая трансплантация. При аутологической трансплантации в качестве источника клеток используются собственные клетки-предшественники пациента (собранные и криоконсервированные до трансплантации). Такие трансплантации обычно имеют меньшую частоту острой и подострой смертности и вследствие этого предлагаются пожилым пациентам, а также детям, особенно раннего возраста. Терапевтическое обоснование применения таких трансплантаций в лечении злокачественных новообразований основано на наблюдении, что многие цитостатические препараты имеют дозазависимую кривую, и что главной дозолимитирующей токсичностью большинства этих препаратов является миелосупрессия, т.е. угнетение костного мозга. Иными словами длительная панцитопения может быть уменьшена путем использования инфузии аутологических клеток-предшественников для поддержки («rescue») системы кроветворения. Поэтому этот терапевтический подход часто обозначается как «высокодозная терапия с поддержкой» (с - «rescue»). Он, несомненно, применим в любой ситуации, когда источник аутологических клеток - предшественников абсолютно не содержит опухолевых клеток, что определено in vivo путем клонирования, или может быть очищен от таких клеток путем специальной обработки взвеси стволовых клеток. Последняя манипуляция называется очисткой и может проводиться с использованием центрифугирования, химиотерапии моноклональных антител или других ex vivo методов. Как альтернатива может быть использовано переливание назад небольшого количества опухолевых клеток пациенту, если существует вероятность их разрушения хозяином и/или если целью терапии является увеличение длительности ремиссии, а не «излечивание». [3,8, 52]

Аутологическая трансплантация, конечно же, не подходит для генетических заболеваний (например, серповидно-клеточной анемии, талассемии, болезней накопления и врожденных иммунодефицитов), а также обычно не приемлема в ситуациях, когда большая часть популяции клеток-предшественников является патологической в результате приобретенных заболеваний (например, при миелодисплазии, апластической анемии и миелопролиферативных заболеваниях). [10,59]

Сингенная трансплантация. Сингенная трансплантация возможна тогда, когда у потенциального реципиента есть однояйцовый близнец, который способен стать донором стволовых клеток-предшественников. При этом отсутствует иммунологической барьер для трансплантации, поскольку хозяин и донор генетически идентичны. Когда такой выбор существует, сингенная трансплантация обычно более предпочтительна, чем аутологическая, поскольку при ней отсутствует риск опухолевой контаминации стволовых клеток. [11,61,63]

Аллогенная трансплантация. Главным барьером на пути рутинного использования других доноров для трансплантации (обозначается как аллогенная трансплантация) является существование различий в гистосовместимости между индивидуумами. Гистосовместимость обозначает, будет или нет иммунная система одного индивидуума узнавать ткани другого индивидуума как «чужеродные» и, таким образом, пытаться разрушить чужеродные ткани. Когда индивидуум (обозначаемый как хозяин), получающий новую ткань (в данном случае ГСК), распознает новую трансплантируемую ткань (обозначаемую как трансплантат) как чужеродную, он (хозяин) пытается отторгнуть новые клетки-предшественники. [36,92] Это явление известно как реакция «хозяин-против-трансплантата» (РХПТ) или как отторжение трансплантата. С другой стороны, новые трансплантированные гемопоэтические стволовые клетки (трансплантат) рассматривают хозяина как чужеродного, тогда развивается реакция РТПХ. Любое из этих состояний приводит к тяжелой патологии и смертности. [50,109]

Главный определяющий фактор гистосовместимости у людей основывается на том, имеют ли хозяин (реципиент) и трансплантат (донор) идентичный набор генов в составе главного комплекса гистосовместимости (МНС). Тип МНС индивидуума также обозначается как HLA (человеческий лейкоцитарный антиген) тип. HLA-типирование определяет, являются ли донор и реципиент идентичными по главным антигенам гистосовместимости. Тем не менее, важно понимать, что существует также значительное число второстепенных локусов гистосовместимости, которые влияют на исход трансплантации, но которые остаются относительно плохо определяемыми на молекулярном уровне. Таким образом, даже если донорами являются сиблинги, которые полностью генотипически HLA-совместимы по всем определяемым МНС (HLA) локусам, частота острой и хронической РТПХ остается на уровне 30-60%.[66,112]

Эксфузия гемопоэтических стволовых клеток. Для успешной миелотрансплантации необходимо: 1) обеспечить глубокую депрессию иммунной системы реципиента для успешного приживления трансплантата и профилактики реакции “трансплантат против хозяина” (РТПХ) после проведения АлТКМ/АлТСКК; 2) ввести реципиенту аллогенные или аутологичные СКК в количестве, необходимом для восстановления гемопоэза; 3) при АлТКМ/АлТСКК проводить иммуносупрессивную терапию с целью профилактики: а) РТПХ; б) реакции “хозяин против трансплантата” (РХПТ), которая может привести к отторжению костного мозга донора. [50,93]

Основное преимущество АлТКМ/АлCКК низкий риск рецидива. Это связано, во-первых, с тем, что пациенту вводится костный мозг здорового донора, а при онкологических заболеваниях, кроме того, с развитием РТПО. Главный недостаток АлТКМ/АлCКК высокая летальность (до 2030%). [49,64,95]

Главным преимуществом АТКМ/АТCКК является относительно низкая летальность (не более 510%), а недостатком высокий риск рецидива из-за возможного наличия опухолевых клеток в трансплантате. Очистка аутологичного трансплантата с помощью МКА или физических методов приводит к уменьшению частоты рецидивов. [75]

Важным достижением явилось внедрение в практику трансплантации СКК периферической крови. [3,8,10] Установлено, что СКК находятся не только в костном мозге, но и в ряде случаев (назначение КСФ, ”выход” из постцитостатического агранулоцитоза) появляются в периферической крови. (Моноклональные антитела МКА) позволяют идентифицировать популяцию клеток с иммунофенотипом СКК (CD34+), а автоматический сепаратор клеток крови получить их в достаточном количестве. Это дает возможность выполнить АлТСКК/АТСКК, которая занимает все большее место. [3]

Основные преимущества АлТСКК/АТСКК: 1) отсутствует необходимость в общей анестезии; 2) меньшая длительность периода цитопении; 3) более быстрое восстановление иммунной системы; 4) возможность проведения при фиброзе костного мозга (например, после лучевой терапии на лимфатические узлы и органы брюшной полости). [9]

Основные показания к трансплантации СКК представлены в таблице №.2

Таблица 2

АлТКМ/АлТСКК	АТКМ/АТСКК
1) Острый миелоидный лейкоз, первая ремиссия; 2) Острый лимфобластный лейкоз, вторая ремиссия или первая ремиссия при наличии факторов риска); 3) Хронический миелолейкоз, хроническая стадия; 4) Тяжелая апластическая анемия; 5) Тяжелые врожденные заболевания (гемоглобинопатии, болезни накопления).	1) Лимфогранулематоз, вторая ремиссия или первая ремиссия при наличии факторов риска; 2) Неходжкинские лимфомы, вторая ремиссия или первая ремиссия при наличии факторов риска; 3) Множественная миелома; 4) Солидные опухоли (рак молочной железы, яичек, яичников, мелкоклеточный рак легкого и др.).

Больной, которому планируется миелотрансплантация, должен отвечать следующим требованиям:

1) возраст менее 55 лет при аллогенной и менее 65 лет - при аутологичной трансплантации;

2) хорошее общесоматическое состояние: индекс ВОЗ 0-I (таблица № 3);

3) сохраненные функции печени, почек, сердца и легких;

4) отсутствие очагов инфекции.

Таблица 3 - Определение общесоматического статуса в модификации ВОЗ

Индекс ВОЗ	Показатели
0	Может нести нормальную нагрузку без ограничений
I	Ограничен в физической активности, но может лечиться амбулаторно и выполнять легкую работу.
II	Амбулаторный больной, способный полностью себя обслуживать, но утративший работоспособность; на ногах не менее 50% дневного времени.
III	Способен лишь к ограниченному самообслуживанию; проводит в постели или кресле более 50% дневного времени.
IV	Полностью беспомощен, не может себя обслуживать и полностью прикован к постели или креслу.

При ТКМ/ТСКК можно выделить несколько этапов:

1. Эксфузия СКК. Для успешной трансплантации необходимо заготовить не менее 2-8х109/л миелокариоцитов на 1 кг массы больного, в зависимости от вида патологии. Гемопоэтические клетки получают в условиях операционной под общей анестезией путем повторных аспираций из задних бугров и гребней подвздошной кости. Суммарное количество заготовленного костного мозга рассчитывается исходя из массы тела больного. Альтернативным вариантом является взятие СКК из периферической крови с помощью клеточных сепараторов после предварительной мобилизации колониестимулирующими факторами (чаще всего Г-КСФ). [67,85]

2. Фракционирование. Фракционирование заключается в удалении плазмы и эритроцитов путем дифференцированного центрифугирования с целью получения концентрата костного мозга (СКК). При аллогенной трансплантации СКК реинфузируются реципиенту ex tempore, при аутологичной через 2-3 недели, а в ряде случаев через несколько лет после эксфузии. Для сохранения аутологичные СКК консервируются в жидком азоте под защитой криопротектора, чаще всего диметилсульфоксида. [29,40,113]

3. Кондиционирование. Задача данного этапа максимальная депрессия иммунной системы, а при онкогематологических заболеваниях и солидных опухолях, кроме того, эрадикация остаточной опухолевой массы. Это достигается при помощи сверхвысоких доз цитостатических препаратов лучевой терапии. [93] Режимы кондиционирования дифференцированы в зависимости от нозологической формы. Дни до реинфузии костного мозга или СКК периферической крови обозначаются со знаком “минус” (Д-7, Д-6 и т.д.), день реинфузии как Д- 0, дни после трансплантации со знаком “плюс” (Д+1, Д+2 и т.д.). Для уменьшения побочных эффектов высокодозной терапии во время кондиционирования проводится инфузия кристаллоидных растворов (в среднем 45 литров в сутки), вводятся антиэметики и седативные препараты. [8]

4. Реинфузия. При аллогенной трансплантации пациенту вводятся заготовленные в Д-О костный мозг или СКК, при аутологичной размораживаются и реинфузируются криоконсервированные гемопоэтические клетки. Реинфузия проводится внутривенно капельно после премедикации антигистаминными препаратами и большими дозами глюкокортикостероидов. [115]

5. Профилактика и лечение осложнений периода цитопении. Через несколько дней после завершения кондиционирования (обычно от Д+5 до Д+10) у всех больных развивается глубокая цитопения (нейтрофилов менее 0,5х109 /л, тромбоцитов менее 2030х109 /л). Данный период характеризуется опасностью развития тяжелых инфекционных и геморрагических осложнений (таблица № 4).

Таблица 4 - Основные осложнения миелотрансплантации

Ранние (до 100 дней)	Поздние (после 100 дней)
1. Инфекционные. 2. Геморрагические. 3.Веноокклюзионная болезнь. 4. Кардиоваскулярные. 5. Нефрологические. 6. Острая РТПХ.	1. Инфекционные. 2.Хроническая РТПХ. 3.Последствия кондиционирования (катаракта, полигландулярная эндокринная недостаточность, обструктивные заболевания легких). 4. Вторичные опухоли.

Основными мероприятиями в период цитопении являются:

1) профилактика, ранняя диагностика и лечение инфекционных осложнений;

2) профилактика и лечение геморрагического синдрома.

Профилактика инфекционных осложнений включает комплекс санитарно-гигиенических мероприятий (изоляция больного в асептической палате, ежедневная смена белья, полоскание полости рта и обработка кожи дезинфицирующими растворами, использование персоналом стерильной одежды, дополнительная термическая обработка пищи). Для профилактики эндогенного инфицирования проводится частичная деконтаминация кишечника (прием неабсорбируемых антибактериальных препаратов в сочетании с противогрибковыми средствами). [7,10,15]

Основой профилактики и лечения геморрагического синдрома являются трансфузии тромбомассы (аутологичной или донорской). [13] Показанием к трансфузии является снижение уровня тромбоцитов ниже 20х109/л или наличие геморрагического синдрома. Коррекция анемии проводится при снижении уровня гемоглобина ниже 70 г/л и/или клинических признаках гипоксии.

Веноокклюзионная болезнь (ВОБ) возникает у 510% больных и обусловлена обструкцией синусоидального кровотока и дегенерацией гепатоцитов. [118] Развитие ВОБ характеризуется асцитом, желтухой и гипербилирубинемией. Лечение включает парентеральное питание, малые дозы допамина, спиронолактоны, экстракорпоральные методы детоксикации, однако летальность достигает 4050%. Профилактика ВОБ включает в себя применение антикоагулянтов и гепатопротекторов. [13,16]

Изменения со стороны почек и мочевыводящих путей обычно ограничиваются временным нарушением функции почек на фоне кондиционирования, в некоторых случаях развивается острая почечная недостаточность. Другим осложнением является геморрагический цистит. [47,73]

При благоприятном течении посттрансплантационного периода через 34 недели количество нейтрофилов превышает 0,5х109/л, тромбоцитов 20х109/л, что означает окончание периода цитопении (при использовании колониестимулирующих факторов и проведении ТСКК длительность цитопении уменьшается в 1,52 раза). [13,16]

Несмотря на возможность развития многочисленных осложнений, отдаленные результаты миелотрансплантации при многих заболеваниях существенно лучше, чем при стандартном лечении (таблица № 5) [28].



Таблица 5 - Сравнительные результаты стандартного лечения и миелотрансплантации при гематологических заболеваниях (5-летняя безрецидивная выживаемость)

Заболевания	Стандартное лечение	АлТКМ/АлСКК	АТКМ/АТСКК
Острый миелоидный лейкоз, первая ремиссия	2025%	5060%	30%
Острый лимфобластный лейкоз, вторая ремиссия или первая ремиссия при наличии факторов риска	20%	5060%	30%
Хронический миелолейкоз, развернутая стадия (медиана выживаемости при химиотерапии 34 года)	0%	5080%	-
Хронический миелолейкоз, фаза акселерации (медиана выживаемости при химиотерапии 6 месяцев)	0%	2030%	-
Неходжкинские лимфомы (вторая ремиссия или первая ремиссия при наличии факторов риска)	10%	40%	30%
Лимфогранулематоз (вторая ремиссия или первая ремиссия при наличии факторов риска)	20%	50%	4050%
Тяжелая апластическая анемия (медиана выживаемости при стандартном лечении 6 месяцев)	0%	5080%	-

Таким образом, за последние 30 лет миелотрансплантация превратилась в широко распространенный метод лечения: в настоящее время в мире ежегодно выполняется более 50 000 ТКМ/ТСКК, причем их количество непрерывно увеличивается. Расширился и спектр показаний к миелотрансплантации: наряду с гематологическими заболеваниями ТСКК применяется при солидных опухолях (мелкоклеточный рак легкого, герминогенные опухоли яичка, рак яичников) и аутоиммунной патологии (рассеянный склероз, диффузные болезни соединительной ткани). [11,39,74,76]

1.6 Перспективы лечения миеломной болезни аутологичной пересадкой костного мозга

Миеломная болезнь (болезнь Рустицкого-Калера, множественная миелома, генерализованная плазмоцитома) является заболеванием системы крови и относится к парапротеинемическим лейкозам с преимущественной локализацией процесса в костном мозге. [3,8]

Частота миеломной болезни составляет 4 случая на 100000 населения в год, женщины заболевают в 3-4 раза чаще мужчины. Более часто она развивается в пожилом возрасте. Средний возраст больных составляет около 60 лет. [119]

Природа миеломной болезни до сих пор неизвестна. Она относится к низкопролиферативным опухолям. Допускается, что предшественники миеломных клеток мигрируют из герминальных центров лимфатических узлов через кровь в костный мозг. Опухолевая пролиферация обусловлена клональной экспансией постгерминальных В-клеток с инвариабельным типом гипермутации генов иммуноглобулинов. [12,18]

В развитии миеломной болезни значение придается взаимодействию неопластических клеток со стромальным микроокружением в костном мозге, играющем решающую роль в опухолевой адгезии и неоангиогенезе с нарушением баланса между остеобластами и остеокластами, а также цитокиновой стимуляцией опухолевого роста (интерлейкин-6 (ИЛ-6) и его рецепторы (sИЛ-6). Вместе с другими цитокинами (ИЛ-1в, ФНП-альфа, ИЛ-11 -- ИЛ-?6) он стимулирует чрезмерную активность остеокластов, что имеет следствием резорбцию костной ткани. Важная роль принадлежит усилению взаимодействия между рецептором (RANK) активатора ядерного фактора-В (NF-кВ), экспрессируемым остеокластами и хондроцитами, и его лигандом (RANKL), экспрессируемым остеобластами, активированными Т-клетками и стромой костного мозга. Как результат, стимулируются вызревание и активация остеокластов. Кроме того, остеопротегерин (OPG) клеток стромы конкурентно связывается с RANKL вместо RANK, подавляя дифференцировку и активацию остеокластов. Значение принадлежит также макрофагальному воспалительному протеину-1альфа (MIP-1альфа), стимулирующего миелоцито- и подавляющего эритроцитопоэз. Среди других факторов значение имеют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста гепатоцитов (HGF). [11,19]