Епізоотологічний моніторинг та діагностика інфекційних захворювань диких птахів

Вперше віруси грипу НІ3 були ізольовані в 1977 році від мартинів у Бостоні (США) [3]. У Радянському Союзі віруси грипу НІ3 ізолювали від представників родини мартинів у 1976-77 роках в районі Каспію та у Білорусії [19, 47, 48] та також від водоплавних птахів в Бурятії [31]. В 1979-1985 роках ізольовано 93 штами вірусів грипу цього серотипу від мартина каспійського (Larus ichthyaetus), мартина сріблястого (Larus argentatus), крячка каспійського (Hydroprogne caspia) [3, 89]. У Чорноморському заповіднику в чапель, качок та мартинів встановили антитіла до вірусів грипу серотипів H13N6 та H13N3 [66].

При серологічних дослідженнях пінгвінів у Східній Антарктиці у них були зареєстровані антитіла до вірусу грипу птахів [177].

На території Росії на півдні Західного Сибіру від двох видів чирянок (Anas querquedula) та (Anas crecca) ізольовані віруси грипу, які відносяться до підтипу НЗ та Н4 та мікст НЗ+Н4 [86].

Що стосується вірусу грипу В, то антитіла до нього виявляли в крові колоніальних птахів на узбережжі Чукотки, Камчатки, на Командорських островах, острові Іоні, а також птахів Далекого Сходу, Приморського краю, Західної Туркменії та півночі Архангельської області. Вірус грипу В виявлено у 2 тонкодзьобих кайр та 1 топорка з Командорських островів [46].

Антитіла до вірусу В/Сингапур встановлено у 34,2% диких птахів (в основному у сорок та крутиголовок), які були відловлені поблизу Дніпра [20].

Родина коронавірусів. Найбільш важливим для промислового птахівництва представником цієї родини є вірус ІБК. Інфекційний бронхіт курей -висококонтагіозна хвороба, що проявляється у курчат респіраторними та уремічними синдромами, а у курей - враженням органів репродуктивної системи. Хвороба спричиняє великі економічні збитки [16, 32].

Almarza A.G. вважає, що в розповсюдженні збудника хвороби можуть приймати участь дикі птахи [107]. Ізолювати вірус вдавалося від перепелів з характерними проявами захворювання (враженням респіраторного тракту, нирок, порушення діяльності шлунково-кишкового тракту, зниженням інтенсивності несучості), а також після експериментального інфікування [46, 124, 125]. В Криму при проведенні серологічних досліджень диких птахів антитіла до нього були встановлені у ворон, мартинів, щигликів, дроздів [8]. В Антарктиці у чубатих пінгвінів були виявлені AT до збуднику ІБК [118].

Родина реовірусів. При проведенні широкомасштабних серологічних досліджень у Німеччині Ziedler K., Hlinak А. зі співав, виявили в сироватках крові крижнів, чирянок та болотних качок AT до реовірусів птахів [229].

Родина бірнавірусів. Небезпечним для галузі птахівництва, особливо м'ясного напрямку, є хвороба Гамборо. Збудник цього захворювання - представник цієї родини. У природних умовах вірусом ХГ вражаються тільки кури, але в останні роки вірус ізолювали від качок [62], у Росії та СІЛА від індиків [16, 26, 35]. При експериментальному інфікуванні індичат клінічних проявів хвороби не спостерігали, але в організмі індичат утворювалися антитіла до вірусу [232]. Крім курей та індиків, вірус було ізольовано від кажанів, та деяких видів комах [26, 32]. Вважається, що дикі птахи можуть бути прямими та непрямими векторами [16]. Про загибель горобців на одній з ферм, де спостерігався спалах хвороби Гамборо, повідомляє Edgar S.A., Yung Cho [137]. Інші автори також вважають, що ці птахи чутливі до хвороби [62]. Стосовно чутливості перепілок існують протилежні відомості. Так Edgar S.A. та Waggoner R. [136] повідомляють, що вірус ХГ є патогенним для них, a Weisman J., Hitcher S.B. [232] при експериментальному інфікуванні не встановили клінічних проявів хвороби та змін у бурсі в перепілок. В Антарктиці у двох видів пінгвінів та інших птахів дослідники в сироватці крові виявили AT до вірусу ХГ [58]. У той же час у Німеччині при серологічних дослідженнях диких качок, гусей, бакланів та інших птахів, що належать до 21 виду, не встановлено AT до збудника цього захворювання [229].

Родина парвовірусів. До цієї групи вірусів входить збудник ВЕГ, захворювання яке небезпечне для гусей та спричиняє великі економічні збитки господарствам. Зараз на території України ситуація щодо цього захворювання складна. Захворювання реєструються практично в усіх регіонах, що підтверджується результатами серологічних та вірусологічних досліджень [7]. Що стосується поширення цього захворювання серед представників дикої орнітологічної фауни, то відомостей дуже мало. Так, вчені з Німеччини Ziedler K., Hlinak А. та ін. при дослідженні диких птахів 21 виду AT виявили тільки в 5,8% випадків у крижнів та лебедей [229].

Родина пікорнавірусів. Небезпеку для галузі розведення качок представляє ВГК, збудник відноситься до родини пікорнавірусів. Це - гостра висококонтагіозна хвороба, яка супроводжується характерними враженнями печінки та високою летальністю молодняка каченят у віці 1-30 діб. Птахи родини курячих стійкі до захворювання [15, 16, 60]. Експериментально вдавалося викликати захворювання у цесарят, гусят, фазанят, перепелят, індичат. Загибель гусенят може становити до 95% [16].

У поширенні вірусного гепатиту каченят не виключається роль диких птахів як джерела збудника інфекції [16]. Буряковський В.Д. [12] довів, що збудник вірусного гепатиту каченят може розповсюджуватися дикими качками. Він встановив чутливість каченят крижнів до вірусу з розвитком клінічної картини та те, що перехворілі каченята крижнів є вірусоносіями протягом 3-х місяців. При дослідженні крижнів, чирків, лисух, мартинів, які були відстріляні на території неблагополучного щодо ВГК господарства, в 11% крижнів встановлені антитіла у високих титрах, але ізолювати вірусний агент не вдалося. Можливість заносу вірусу до господарств дикими качками та іншими птахами була доведена багатьма вченими при вивченні ензоотій в господарствах Чехословаччини, Московської і Київської областей [60]. Про роль диких качок у розповсюдженні збудника ВГК повідомляють також Anon та Фотін А.І., які ізолювали вірус від диких качок [88, 108, 120]. В Німеччині AT в титрах 1:8-1:16 виявили у крижнів та чирянок [229].

1.3 Бактеріальні хвороби

Розкриваючи етапи досліджень диких птахів як можливого вектора передачі збудників інфекційних хвороб сільськогосподарських птахів, неможливо обійти хвороби бактеріальної етіології.

Сальмонельоз. До захворювання чутливі людина, всі види свійських птахів та тварин і багато видів диких. Можливим джерелом збудників хвороби вважають інфікованих диких птахів [46, 79, 80]. Croven S.E., Stern N.J., Line E. зі спів, ізолювали Salmonella spp. в 24-33% випадків із кишечнику та проб фекалій шпаків і горобців, які мешкають поблизу ферм із вирощування бройлерів [132]. Smyser С. P. та Snoeyenbos G. Н. виділяли Sal. typhimurium від птахів різних видів, у тому числі від голубів [215]. Що стосується голубів та горлиць Кокошаров Т. вважає, що вони можуть механічно переносити збудника хвороби на кінцівках та пір'ї [36]. Sal. pullorum-gallinarum у природних умовах викликає захворювання у молодняка курей, індиків, фазанів, цесарок, голубів, павичів, лебедів, горобців, чижів, снігурів, куріпок [46, 79, 80, 176]. Збудника цього захворювання Pennycot T.W. та Duncan G. отримали від фазанів під час спалаху інфекції у Великобританії [196]. У Німеччині зареєстровані спорадичні випадки ізоляції Sal. litchfield від птахів у зоопарках та від диких і синантропних птахів [207]. Palmgren Н. зі співавторами та McFarlane R.A. ізолювали Sal. havana, Sal. typhimurium, Sal. enteritidis із проб фекалій пінгвінів та альбатросів в Антарктиці в 1996-1998 роках [58, 177, 206].

Пастерельоз. У природних умовах хворіють кури, індики, качки, гуси, цесарки, фазани, перепілки, голуби, а також багато видів диких птахів [79, 80, 191, 152]. Збудника пастерельозу знаходили у сов (Tybo alba, Strix aluco). Клінічний прояв захворювання з 40% смертністю зареєстровано у Кенії в 1940 році в єгипетських чапель. Зафіксовані великі епізоотії (приблизно 40 тис. птахів) серед диких водоплавних птахів (гуси, качки, лисухи, буревісники) [46]. Aye P.P., Morishita T.Y. та Angrick E.J. отримали патогенні для курей ізоляти P. multocida від хижих птахів [113]. В Антарктиці реєстрували випадки захворювання пінгвінів та інших морських птахів пастерельозом [58].

Колібактеріоз. Інфекційна, септична хвороба всіх видів свійської птиці. Е.соіі -звичайний коменсал шлунково-кишкового тракту свійських і диких тварин та птахів. Колібактеріоз, як самостійна хвороба, спостерігається у вигляді спорадичних випадків. Частіше вона спостерігається як вторинна інфекція при інших бактеріальних чи вірусних хворобах [32, 46, 79, 80]. Але все ж таки збудника хвороби ізольовано від мартинів, голубів, ворон, горобців та інших диких птахів [131, 143].

Туберкульоз. До туберкульозу чутливі практично всі види свійських та диких птахів [79, 80]. Роботи Аллахвердиєва І.І. підтвердили, що дикі птахи (в даному випадку горобці) є джерелами збудника туберкульозу для тварин та птахів [1, 2]. Захворювання виявлено серед шпаків, голубів, фазанів, мартинів, гусей, лебедів, куріпок, індиків та ін. [46, 201]. Рягузов B.C., Хабузов І.П., Чернавіна М.Є. отримали дві культури М. avium від грака та горобця [72]. Як повідомляють Nesic D., Radosavljevic D., Romanic S., в Югославії у 70% голубів на одній з ферм діагностовано туберкульоз М. avium [183]. У Чехословаччині від диких птахів 5 видів ізольовані культури М. avium [218]. У Нідерландах від канюків, боривітря, мартинів, голубів, лебедів, вухастих сов, галок, фазанів та інших диких птахів ізольовано 82 штами мікобактерій, серед яких М. avium, M. fortuitum, M. terrae [112]. Roffe TJ. ізолював М. avium від крижня звичайного та нерозня [204].

Збудник респіраторного мікоплазмозу Mycoplasma gallisepticum у природних умовах, крім курей та індиків, вражає фазанів, куріпок, перепілок, цесарок, голубів, павичів [32, 67, 79, 80]. AT в сироватках крові лисок та лебедів виявляли німецькі дослідники [229]. Davidson W. R., Nettles V. F., Couvillion C. E. зі співав, у США ізолювали збудника захворювання від диких індичок (Meleagris gallopavo) з проявами синуситу [155].

До Mycoplasma synoviae - збудника інфекційного синовіту - в природних умовах чутливі фазани [79]. Що стосується інших представників Mycoplasma, то в Англії Keymer I.F., Leach R.H., Clarke R.A. від голубів ізолювали Mycoplasma columbium [166]; М. imitans ізольовано від качок, гусей та куріпок [146]; не ідентифіковані мікоплазми було виділено від хижих птахів (Buteo lagopus) та (Buteo buteo) з ознаками аеросакуліту та пневмонії [115].

На думку багатьох дослідників, дикі та синантропні птахи можуть відігравати певну роль у поширенні таких захворювань, як вібріоз, псевдомоноз, ботулізм [79, 80, 132]. Так, ботулізм відмічено в США та Канаді у 36 видів птахів, серед яких сокіл, мартин, чапля, чорний дрозд [46]. Польников Д.Г. у Киргизії від диких птахів 38 видів отримав 97 штамів клостридій, в тому числі 72 патогенних та 25 умовно патогенних [64].

Що стосується збудників інших бактеріальних хвороб, то збудник туляремії Francisella tularensis ізольований від шуліки {Milvus korshun), голуба {Columbia sp.), глушеця {Tetrao urogallus), орябка {Tetrastes bonasia), перепілки {Coturnix coturnix), водяної курочки {Gallinula chloropis), деркача {Сгех сгех), крячка звичайного {Sterna hirundo), мартина звичайного {Larus ridibundus), орябка {Bonasa umbellus), фазана {Pediocetes phasianellus), тетерука {Centrocercus urophasianus), пугача {Bubo virginianus), мартина {Larus pipixcan) [46]. Лістеріоз описано у курей, качок, індиків, голубів, канарок, папуг, гусей [32, 46]. AT до Leptospira spp. Були встановлені у лебедя та качок [229]. До збудника псевдотуберкульозу Yersinia pseudotuberculosis чутливі горобці, канарки, кури, голуби, індики, лебеді та інші (понад 44 видів). У природних умовах захворювання спостерігалося у курей, індиків, голубів, фазанів, канарейок, лебедів, качок, туканів, чорних дроздів, синиць, міських та берегових ластівок, ворон [32, 46]. Від різних видів пінгвінів в Антарктиці виявляли AT до Borrelia burdorferi sensulato, ізолювали Campylobacter jejuni [58].

Диким та синантропним птахам належить важлива роль у поширенні такого небезпечного захворювання, як орнітоз. На цей час орнітоз виявлено у 132 видів птахів з 18 рядів та 28 родин: фазани, голуби, горлиці, чаплі, мартини, а також інші морські, лісні та болотні птахи. Птахи цих видів й можуть бути джерелом інфекції. Вчені надають особливу роль, як джерела розповсюдження збудника орнітозу, представникам папугових та голубів. Так, у США Panigrahy В., Grimes J.E., Brown CD. при дослідженні 190 папуг у зоомагазинах у 119 з них ізолювали збудник орнітозу [192]. За даними різних авторів інфікованість голубів орнітозом у різні роки складала від 50 до 80% [32, 46, 79, 128, 208]. Page L. при серологічних дослідженнях чорних дроздів, горобців, голубів, пісочників у 25-65% з них виявив антитіла до збудника орнітозу [189]. Travnicek М., Cislakova L., Misko J. встановили AT в сироватці крові фазанів [226]. За результатами Сарьіева Г.А., Ахмедовой А.Г. Алиевой Н.А. в Азербайджані у розповсюдженні та зберіганні збудника орнітозу приймають участь представники 7 видів диких птахів фауни республіки [73].

Хвороба також була встановлена і серед водоплавних птахів. її реєстрували на Каспії у крижнів, чапель та інших птахів на гніздуванні. Збудник ізольовано від крижня, чирка. У дельті Волги у представників 18 з 22 досліджених видів птахів у 24-32% популяцій в сироватці крові встановлені антитіла [46]. McFarlane R.A. ізолював збудника інфекції, а інші дослідники виявляли до нього AT у пінгвінів (Pygoscelis adeliae) [58, 177]. Roberts J.P. та Grimes J.E. експериментально підтвердили можливість інфікування збудником орнітозу представників екзотичних видів: (Cassidix mexicanus), (Quiscalus quiscula), (Molothrus ater), (Zenaidura macroura) [203] Узагальнюючи вищевикладене, можна стверджувати, що епізоотологія має

численні відомості про широкі екологічні зв'язки бактерій та вірусів - збудників інфекційних хвороб із птахами. Це підтверджується як фактами носійства птахами ряду мікроорганізмів, так і наявністю в сироватках крові антитіл до них. З огляду на факти, наведені в літературному огляді, контакти свійських птахів з дикими можуть бути причиною виникнення гострих інфекційних захворювань у вигляді спорадичних випадків, ензоотій та епізоотій.

Доведеною можна вважати роль диких, особливо мігруючих, птахів у розповсюдженні арбовірусів та підтриманні їх природних осередків. Також можна вважати, що встановлена роль диких птахів в поширенні бактеріальних інфекцій сільськогосподарських птахів.

Не дивлячись на великі зусилля вчених різних країн, багато питань досі залишаються нез'ясованими. Роль диких птахів у розповсюдженні збудників деяких вірусних хвороб залишається дискусійною, так як все ж таки основними джерелами збудників є свійська птиця.

Що стосується вірусних хвороб, то з всього їх різноманіття найбільш широко дослідженими можна назвати дві хвороби: НХ та грип. Це й не дивно, бо вони належать до списку найнебезпечніших інфекційних хвороб за номенклатурою МЕБ (список А). Доведена роль водоплавних, навколоводних птахів та голубів як джерела збудників НХ, та не в повній мірі з'ясована роль синантропних птахів. Що стосується грипу, то роль диких птахів у поширенні захворювання доведена остаточно. Але з огляду на величезне епідеміологічне, соціальне, економічне, епізоотичне значення цієї хвороби має сенс проведення постійного моніторингу за ситуацією серед диких птахів (мігруючих та синантропних). На цьому наполягають представники МЕБ, які з метою попередження спалахів грипу рекомендують проводити моніторингові дослідження.

Взагалі, літературні відомості, наведені в огляді літератури, в більшості стосуються закордонних країн, де дослідження проводили 10, 15, 20 років тому. За цей час ситуація докорінно могла змінитися. Крім того, кожна країна, кожний регіон є своєрідним та унікальним. Висновки, що відносяться до Західної Європи, не говорячи вже про Америку та Азію, мало стосуються України. Дотепер не проведено моніторингу епізоотичної ситуації щодо інфекційних хвороб (вірусних хвороб) диких птахів у різних регіонах України.

Актуальність цієї роботи підтверджується існуванням у різних країнах світу центрів з вивчення хвороб диких тварин, а при МЕБ - робочої групи з контролю за ними. Ще одним перспективним напрямком досліджень центрів, робочої групи та референт-лабораторій є розробка чутливих та специфічних тестів для діагностики хвороб диких ссавців та птахів [186]. В Україні подібних центрів немає і такі роботи не проводяться.

За даними МЕБ в 2000-2002 pp. серед диких птахів були зареєстровані такі інфекційні хвороби, що відносяться до списку А: НХ у бакланів, голубів, горлиць, страусів, альбатросів у Північній Америці, Канаді, Франції, Швеції, Швейцарії, Австрії, Італії, Індії, Зімбабве, ПАР, Австралії; грип птахів у мартинів та інших птахів в Австралії. З списку В - вірусний ентерит качок у диких качок та гусей (США), холера птахів у диких качок та гусей (США) та у бакланів (Канада), хвороба Гамборо у пінгвінів в Антарктиді, сальмонельоз у чижів (Північна Америка), снігурів, зеленяків, мартинів (Північна Європа), горобців (Нова Зеландія) [6]. За даними 72-ї сесії МЕБ, в 2003 році зі списку А у диких птахів були зареєстровані грип та НХ, а зі списку В - холера птахів. У більшості випадків ці хвороби встановлені у тих самих видів та в тих самих регіонах, що і раніше [186].

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальні дослідження роботи проведені протягом 2000-2004 років у відділі профілактики хвороб птахів Інституту птахівництва УААН, Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Державному Біосферному заповіднику „Асканія-Нова" ім. Ф.Е. Фальц-Фейна (Херсонська область), у птахівничих господарствах Харківської, Черкаської, Запорізької областей та у біотопах птахів на території м. Харкова, Харківської та Сумської областей.

Дослідження щодо індикації та ідентифікації збудників виконані спільно з фахівцями Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини (м. Київ) та ФДУ «Федерального центру охорони здоров'я тварин» (ФДУ ВНДІЗТ м. Владимир Російська Федерація). Імунологічні дослідження сироваток крові та екстрактів жовтків яєць диких птахів щодо наявності в них антитіл до вірусу грипу були проведені спільно з фахівцями Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини (м. Київ) та Інституту вірусології ім. Д.І.Івановського (м. Москва, Росія).

2.1 Об'єкти досліджень

Аналізуючи наведені в літературному огляді матеріали щодо інфекційних хвороб серед диких птахів, враховуючи небезпеку, яку вони представляють для свійських птахів та те, що дикі птахи є потенційним резервуаром збудників, основним напрямком нашої роботи було обрано вивчення розповсюдження серед птахів фауни України збудників вірусних хвороб. Моніторингові дослідження проводили щодо вірусних хвороб, які за номенклатурою МЕБ відносяться до списку А - ньюкаслська хвороба та грип, до списку В - вірусний гепатит качок, інфекційний бронхіт курей, інфекційний ларинготрахеїт, хвороба Гамборо, а також інші хвороби, які спричиняють значні економічні збитки птахівництву України -

синдром зниження несучості-76, вірусний ентерит гусей [6].

У роботі були проведені дослідження диких птахів, яких умовно можна поділити на три групи: водоплавні, синантропні та птахи орнітологічної фауни Сходу України. Зазначені види птахів належать до численних, так званих фонових видів, які в повній мірі можуть відображати ситуацію щодо інфекційних хвороб.

2.1.1 Водоплавні птахи

У Біосферному заповіднику „Асканія-Нова" ім. Ф.Є. Фальц-Фейна протягом 2001-2004 років були проведені дослідження птахів наступних видів: крижень звичайний (Anas platyrhynchos), огар (Tadorna ferruginea), гуска сіра (Anser anser), гуска білолоба (Anser albifrons).

Відбір матеріалу для серологічних досліджень мігруючих птахів проводили під час сезонних зимових міграцій. У грудні 2001 року були відібрані проби крові від крижнів та огарів, У січні 2003 року - крижнів, огарів, сірих та білолобих гусей, в січні 2003 року - крижнів, огарів, білолобих гусей. Птахів відловлювали за допомогою пасток, розроблених та виготовлених у заповіднику.

Збір яєць для імунологічних досліджень проводили під час сезону гніздування в 2002-2004 роках на внутрішніх та зовнішніх водоймищах заповідника. В 2002 та 2003 роках були зібрані яйця крижнів та огарів, а в 2004 році - крижнів, огарів та сірих гусей.

2.1.2 Синантропні птахи

У 5 птахівничих господарствах Харківської, Черкаської і Запорізької областей в 2001-2004 роках було проведено дослідження птахів таких видів: горобець хатній (Passer domesticus), синиця велика (Parus major), грак (Corvidae frugilegus), галка (Coloeus monedula), тояуб(СоіитЬа livid), яструб великий (Accipiter gentilis), горлиця садова (Streptopelia decaocto), сизий мартин (Larus canus), ластівка сільська (Hirundo rustica).

Відбір проб крові від синантропних птахів проводили в цих господарствах протягом 2001-2003 років. Збір яєць для дослідження екстрактів жовтків здійснювали у 2-х птахівничих господарствах Харківської області в 2002-2004 роках. Яйця зібрані від птахів таких видів: горобець хатній (Passer domesticus), ластівка сільська (Hirundo rustica).

2.1.3 Птахи орнітофауни Східної України

У біотопах, не пов'язаних з помешканнями людей, сільськогосподарськими підприємствами та великими міграціями відбирали матеріал для досліджень від 11 видів птахів, що є звичайними мешканцями лісів, парків, степів Східної України.

Дослідження були проведені в 2002 році. Яйця для виготовлення екстрактів жовтків зібрані в парках м. Харкова, а також на території Харківської і Сумської областей. Види птахів та характеристика місць де були зібрані яйця наведені в таблиці 2.1.3.1.

Таблиця 2.1.3.1 Види синантропних птахів та характеристика місць збору яєць

2.2 Матеріали досліджень

У лабораторних дослідженнях використовували:

культуру клітин: ФЕГ;

ембріони птахів: КЕ, КачЕ;

живильні середовища та розчини для культур клітин: середовище Ігла,

199, сироватку крові великої рогатої худоби, розчин трипсину, МПА,

МПБ;

штами вірусів: вакциний штам „Ла-Сота" вірусу НХ; штам „L497" вірусу

СЗН-76, вакцинний штам „К-ІП" вірусу ВГК;

сироватки крові диких птахів із заповідників та птахівничих

господарств;

жовтки яєць диких птахів із заповідників та синантропних птахів із

птахівничих господарств;

діагностикуми: еритроцитарні антигени для діагностики хвороб птиці

виробництва ДП «Ветеринарна медицини» ІЕКВМ УААН (м. Харків),

«Диагностический набор антигенов вирусов гриппа (НІ-13) и

специфических антител к ним» виробництва Інституту вірусології ім.

Д.І. Івановського, (м. Москва, Російська Федерація), «Набор препаратов

на основе моноклональньїх антител для дифференциальной диагностики

гриппа птиц и болезни Ньюкасла твердофазньїм иммуноферментньїм

методом» виробництва Всеросійського науково-дослідного інституту

ветеринарної вірусології та мікробіології (м. Покров, Російська

Федерація), «Набор компонентов для виявлення антител к вирусу

синдрома снижения яйценоскости-76 в реакции торможения

гемагглютинации» виробництва ТОВ «Кронвет» (Російська Федерація).

2.3 Отримання сироваток крові та екстрактів жовтків яєць

Відбір крові у диких птахів проводили з підкрильцової вени або з яремної вени за методикою, яка прийнята при відборі крові у свійської птиці [11], а також безпосередньо з серця. Для цього швидко розтинали грудочеревинну порожнину підранків (птахи, що поранені) та відбирали проби крові з камер серця за допомогою шприца або шляхом розрізання стінок серця. Сироватку крові отримували методом відстоювання. Подальшу підготовку здійснювали за загальноприйнятими методиками [42, 83].

Екстракти жовтків яєць диких птахів готували за двома методиками. Перша методика: жовток відокремлювали від білка, ретельно змішували в співвідношенні 1:2 з фізіологічним розчином (рН 7,2-7,4). Суміш центрифугували при 2500-3000 об/хв протягом 15 хвилин, супернатант використовували в дослідженнях. Друга методика: жовток відокремлювали від білка та ретельно змішували з фізіологічним розчином (рН 7,2-7,4) в співвідношенні 1:1, до отриманої суміші додавали рівний об'єм хлороформу. Суміш ретельно шутелювали протягом 5-10 хвилин, і центрифугували при 3000 об/хв 15 хвилин. Після центрифугування супернатант використовували в подальших дослідженнях.

2.4 Імунологічні методи

Специфічні антитіла в сироватках крові та екстрактах жовтків яєць диких птахів до збудників НХ, СЗН-76, ХГ, ІБК, ІЛТ, ВЕГ виявляли за допомогою серологічних реакції: РН, РЗГА, РИГА.

РЗГА ставили згідно загальноприйнятої методики мікрометодом у плексигласових планшетах з U-подібними лунками. За цією реакцією встановлювали наявність в сироватках крові та екстрактах жовтків яєць диких птахів антитіл до вірусу НХ та СЗН-76. Компоненти реакції: сироватки крові та екстракти жовтків яєць, які досліджуються; антиген, який містить 4 ГАО; фізіологічний розчин; 1%-на суспензія еритроцитів півня [39, 42, 43, 83]. Для виявлення антитіл до вірусів грипу (НІ-13) використовували антиген, який містив 8 ГАО, фосфатний буферний розчин рН 7,4; 0,5%-ну суспензію еритроцитів півня.

За мікрометодом РНГА у плексигласових планшетах з V-подібними лунками здійснювали індикацію антитіл до збудників ВЕГ, ІБК, ХГ, ІЛТ [43] Використовували еритроцитарний діагностикум виробництва ДП «Ветеринарна медицина» ІЕКВМ (м. Харків) згідно з настановою з використання біопрепарату.

За РН виявляли антитіла в сироватках та екстрактах жовтків яєць до збудника ВГК. Постановку реакції здійснювали за загальноприйнятою методикою. Використовували 8-9-добові КЕ, двократні розведення матеріалів та постійну дозу антигену - 100 ЕЛД₅₀. Перед постановкою реакції сироватки крові та екстракти інактивували на водяній бані при температурі 56°С протягом 30 хвилин, додавали антибіотики (пеніцилін 200 ОД, стрептоміцин 100 мкг, ністатин 100 ОД на 1 мл). Облік результатів РН вели по ембріонах, що залишилися живі та не мали характерних змін. Титром сироватки, або екстракту вважали розведення, яке захищало 50% ембріонів від загибелі, розрахунок вели за Рід та Менч [60]. При постановці реакції використовували пул сироваток та екстрактів жовтків яєць від 10 особин одного виду.

2.5 Вірусологічні методи

Патологічний матеріал для вірусологічних досліджень збирали протягом 2001-2003 років. У Біосферному заповіднику „Асканія-Нова" матеріал для вірусологічних досліджень відбирався від загиблих мігруючих птахів таких видів: крижень звичайний, огар, гуска білолоба, чорний лебідь. Патологічний матеріал від синантропних птахів було відібрано в 5 птахівничих господарствах 3-х областей України (Харківської, Черкаської, Запорізької) від відстріляних птахів таких видів: горобець хатній, синиця велика, грак, голуб, галка, яструб великий, сизий мартин, ворона (таблиця 2.5.1).

Від загиблих або відстріляних птахів відбирали внутрішні органи (легені, трахею, нирки, печінку, шлунково-кишковий тракт), а також головний мозок. Також від живих птахів були відібрані клоакальні змиви за загальноприйнятою методикою [83].

Вірусні агенти виділяли з використанням первинно-трипсинізованих культур клітин та ембріонів птахів.

Курячі яйця для отримання ембріонів одержували з господарств, благополучних щодо інфекційних хвороб птиці, качині та гусячі - від качок та гусей батьківських стад відділу профілактики хвороб птахів Інституту птахівництва УААН.

Для інфікування використовували 9-10-ти добові КЕ, 10-12-ти добові КачЕ.

Таблиця 2.5.1

Характеристика місць збору патологічного матеріалу для вірусологічних досліджень

Інкубацію яєць, підготовку ембріонів, інфікування та спостереження за ними, розтин ембріонів та відбір екстраембріональної рідини проводили за загальноприйнятими методиками. При цьому наявність вірусних агентів в інфікованих ембріонах встановлювали за фактом загибелі ембріонів, наявності патологічних змін у них, позитивної РГА з 1% суспензією еритроцитів півня. При виявленні інфекційного агенту від ембріонів відбирали екстраембріональну рідину, яку зберігали до наступного пасажу при -20°С [50].

Первинно-трипсинізовані культури ФЕГ готували з 12-14-добових ГЕ за загальноприйнятою методикою [41]. Інфікування культури клітин проводили на 2-3 добу після формування щільного моношару. За інфікованою культурою спостерігали за стандартною методикою. При цьому цитологічні зміни обліковували за системою з чотириступеневою оцінкою стану моношару культури клітин. При появі в зараженій культурі цитопатичних змін на три-чотири хрести її заморожували при -20 С і зберігали в такому вигляді до наступного пасажу [41, 50].

Біологічні системи інфікували 10% суспензією патологічного матеріалу та змивами з клоаки. Підготовку матеріалу проводили згідно з існуючими методиками [26]. Вірусовміщуючий матеріал (зразки біоматеріалу) досліджували на предмет контамінації його сторонньою мікрофлорою висівом на МПБ, МПА, агар Сабуро[231].

Ідентифікацію ізольованого гемаглютинуючого агенту проводили в РЗГА з специфічною сироваткою крові проти вірусу НХ згідно з загальноприйнятими рекомендаціями [26], а також імуноферментним методом на основі моноклональних антитіл за допомогою діагностикуму «Набор препаратов на основе моноклональньїх антител для дифференциальной диагностики гриппа птиц и болезни Ньюкасла твердофазньїм иммуноферментньїм методом» виробництва Всеросійського науково-дослідного інституту ветеринарної вірусології та мікробіології (м. Покров, Росія)» згідно з настановою щодо використання біопрепарату. Для цього використовували полістиролові планшети з сорбованими моноклональними антитілами до нуклеопротеїнів вірусу грипу птахів (непарні ряди) та вірусу НХ (парні ряди). Планшети перед використанням попередньо однократно промивали ФБР-Т (фосфатний буферний розчин+твін). У лунки планшету вносили досліджувані зразки ЕЕР, специфічний позитивний антиген вірусу грипу, специфічний позитивний антиген вірусу НХ, нормальний негативний контрольний антиген, ФБР-Т (контроль кон'югату) в об'ємі 0,1см³. Планшети інкубували протягом 1 години на шутель-апараті при кімнатній температурі. Потім вміст лунок видаляли, а їх промивали тричі ФБР-Т. В непарні ряди вносили кон'югат моноклональних AT до антигену грипу, а в парні - кон'югат моноклональних AT до антигену НХ в об'ємі 0,1 см³, інкубували протягом 1 години на шутель-апараті при кімнатній температурі, промивали ФБР-Т 5-6 разів. До усіх лунок вносили хромогенний субстратний розчин в об'ємі 0,1 см³. Облік результатів проводили через 30 хвилин фотометрично при довжині хвилі 405 нм. Реакція підлягала обліку, якщо оптична щільність хромогенного субстратного розчину в лунках, в яких інкубували специфічні антигени, перевищували 0,4 одиниці, а в лунках, в яких інкубували контрольний нормальний антиген, - не перевищувала 0,15 од. Позитивними вважали зразки, якщо оптична щільність хромогенного субстрату в лунках, в яких вони інкубувалися, в 2 та більше разів перевищує оптичну щільність в лунках з нормальним контрольним антигеном.

Визначення патогенності ізоляту вірусу НХ проводили методом визначення середнього часу загибелі 10-денних КЕ, яка викликана мінімальною летальною дозою [26]. Для цього використовували десятикратні розведення вірусу 10"¹, 10~⁷, 10"⁸, 10"⁹, 10"¹⁰. Кожним розведенням вірусу інфікували по 10 ембріонів (5 ембріонів о 8 годині ранку та 5 ембріонів о 16 годині дня) в дозі 0,1 мл в алантоїсну порожнину. Інкубували при 37°С протягом 120 годин. Спостерігали за ембріонами двічі на день, час загибелі кожного ембріону фіксували. Середній час загибелі визначали шляхом поділу суми годин загибелі всіх ембріонів, яку викликала мінімальна летальна доза, на кількість ембріонів.

2.6 Молекулярно-біологічні дослідження

Для молекулярно-біологічних досліджень патологічного матеріалу від диких птахів використовували тест-системи ПЛР, які розроблені ФДУ «Федерального центру охорони здоров'я тварин» (ФДУ ВНДІЗТ, м. Владимир, Російська Федерація) згідно з настановами та методичними рекомендаціями щодо їх використання [51]. При виготовленні буферних розчинів та розчинів для ферментативних реакцій використовували хімічні реагенти фірм «Serva» (Німеччина), «Sigma», «Promega» (США), «Fluka» (Швейцарія), «Pharmacia» (Швеція), а також реактиви марок х.ч. та о.с.ч. При проведенні ПЛР були використані праймери люб'язно надані для досліджень лабораторією молекулярної діагностики ФДУ «Федерального центру охорони здоров'я тварин». У роботі було використано обладнання: мікролабораторія «Eppendorf» (Німеччина), вакуумний насос, амплифікатор РТС-100 MiniCycler (MJ Research Inc, США), джерело живлення GPS 200/400 та EPS 3500 XL («Pharmacia», Швеція), апарат для електрофорезу, джерело УФ-випромінювання (трансілюмінатор).

Індикація геному та штамова диференціація вірусу НХ методом ПЛР та

секвенуванням участку гену F.

Сумарну РНК виділяли за допомогою набору реактивів RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, США) згідно з інструкцією щодо їх використання. У роботі використовували РНК-залежну ДНК-полімеразу з вірусу міелобластозу птахів, Taq-полімеразу та dNTP (Promega, США). Праймери були люб'язно надані к.б.н. Грибановим О.Г.

Синтез кДНК. Для реакції зворотної транскрипції до 10 мкл розчину сумарної РНК додавали реакційну суміш, яка містила 2 мкл 10 мМ dNTP, 3 мкл Юх ревертазного буфера (0,5 М трис-НСІ, рН 8,3; 1,4 М КС1; 100 мМ MgCl₂, 200 мМ Р-меркаптоетанол), 15 од. РНК-залежної ДНК-полімерази та 100 пМ праймера ID (5'-CCATTGATGGCAGGCCTCTT-3'), додавали воду до кінцевого об'єму ЗО мкл, перемішували і інкубували 40 хв. при 37 С. Після інкубації прогрівали 4 хв. при 96°С та швидко охолоджували на льоду.

Ампліфікація кДНК. ПЛР проводили в програмованому амплифікаторі РТС-100 MiniCycler (MJ Research Inc, США). У пробірку об'ємом 0,5 мл вносили 5 мкл першого ланцюга кДНК, по 10 пМ праймерів ID (5'-CCATTGATGGCAGGCCTCTT-3') та 2D (5'-CCGCTACCGATTAATGAGCT -3'), 5 мкл IOxPCR буферу (570 мМ трис, рН 8,3; 160 мМ (NHO2 SO₄, 25 мМ MgCl₂, 0,1 % Твин-20), 3 мкл 10 мМ dNTP, 2 од. Taq-полімерази та воду до кінцевого об'єму 50 мкл, зверху нашаровували 50 мкл мінеральної олії. Реакцію проводили в два етапи. Перший етап - ампліфікація з зовнішньою парою праймерів (ID и 2D), ЗО циклів при наступних режимах: 94° С -0,5 хв; 53° С- 0,5 хв; 72° С- 1 хв. Аналіз продуктів ампліфікації проводили електрофорезом у 2% агарозному гелі 0,001% бромистим етидієм. У випадку, коли вірусспецифічна стрічка не виявлялася, проводили другий етап - реампліфікацію з внутрішніми праймерами ЇВ (5'- GTCAACATATACACCTCATC-3') та 2В (5'-ТААСАААСТССТОСАТСТТ-3')втомужрежимі. Продукти ПЛР очищали за допомогою набору реактивів Wizard™ PCR Preps DNA Purification Kit (Promega, США).

Секвенування кДНК. Нуклеотидну послідовність фрагменту F гену визначали методом прямого секвенування ампліфікованих фрагментів за допомогою набору "fmol DNA Sequencing System" (Promega, США). Аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей проводили, використовуючи пакет прикладних програм SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версія 1.0 (N.J. Knowles, IF AN, Великобританія).

2.7 Статистичні методи

Статистичний аналіз результатів досліджень проводили за загальноприйнятими методами [63, 69]. Результати обчислювали за допомогою персонального комп'ютера та пакету програм „Microsoft Excel XP".

2.8 Характеристика осередків, де збирали матеріал для досліджень

Біосферний заповідник „Асканія-Нова" ім. Ф.Е. Фальц-Фейна. Розташований в Херсонській області, в створі Азово-Чорноморського міграційного коридору. З 1985 року заповідник "Асканія-Нова" віднесено до системи біосферних резерватів ЮНЕСКО. Загальна площа заповідника 33397,6 га. До його землекористування входять: цілинний степ (11054 га), дендрологічний парк (196,6 га), зоопарк (61,6 га). Аборигенна фауна налічує 28 видів ссавців, понад 2000 видів безхребетних. У відкритому степу гніздяться майже два десятки видів птахів, а разом з тими, що заселяють деревостани і мігрують до вирію, їх 272 види. З широкого довкілля в захисні зони степового резервату щорічно збираються величезні зграї мігруючих птахів: сірих журавлів (9-15 тис), сірих (5-10 тис.) і білолобих гусей (20 - 500 тис), десятки тисяч крижнів та інших птахів. У зоопарку утримуються три види безкільових птахів: (африканський страус, нанду та ему), 72 види килегрудих: (лебеді, гуси, казарки, качки, фазани, журавлі та інші). Географія розльоту птахів з заповідника охоплює три континенти і простягається від Франції до Забайкалля та від Півночі Європейської Росії до Судану. Тут утримують 15 видів птахів, занесених до Червоної книги України: степовий орел, журавлі, сірий та красавка, огар та інші.

Господарство № 1 (Харківська область). Працює з трьома видами птиці: кури, індики, качки. Кури утримуються в приміщеннях у кліткових батареях та на підлозі. Індики - в приміщенні з вигулами. Качки - в приміщеннях з вигулами та вільним доступом до водоймища. На території господарства мешкають такі види синантропних птахів: горобець хатній, ластівка сільська, ворона, голуб та ін. Вони мають вільний доступ до годівниць та поїлок з питною водою на вигулах.

На території селища, в якому розташоване господарство, в приватному секторі утримується велика кількість сільськогосподарської птиці різних видів.

Господарство №2 (Харківська область). Спеціалізується на виробництві товарного курячого яйця. Населений пункт розташований на відстані 10 км від пташників. На території ферми мешкають такі види синантропних птахів: горобець хатній, галка, голуб. Вони мають вільний доступ до місць утилізації трупів загиблих птахів. Відстріл синантропних птахів було проведено на території ферми де утримуються кури.

Господарство № 3 (Харківська область). Спеціалізується на утриманні та розведенні гусей. Гуси утримуються в приміщеннях з вигулами з вільним доступом до розташованого поблизу природного водоймища, на якому вільно мешкають різни види диких птахів. Населений пункт розташовано на відстані 1 -2 км від птахівничих приміщень. Відстріл проведено на території ферми з вирощування гусей. На території ферми та в господарчих приміщеннях мешкають та мають вільний доступ до годівниць горобці та сільські ластівки.

Господарство №4. Розташоване в Черкаській області. Спеціалізується на утриманні та розведенні качок. Качки розміщені в пташниках з вигулами; до годівниць та питної води мають вільний доступ дикі птахи. Господарство розташоване неподалік від Дніпра та Кременчуцького водосховища, на відстані 5 км від населеного пункту та оточене лісом. На території господарства мешкають горобці хатні, часто зустрічаються хижаки, такі як яструб великий. Відстріл синантропних птахів проведено на фермі з утримання качок.

Господарство №5. Розташовано в Запорізькій області неподалік від Дніпра та Каховського водосховища. Спеціалізується на утриманні курей, гусей, качок. Кури розміщені в приміщеннях ізольовано від водоплавної птиці. Гуси утримуються в приміщеннях з вигулами. Дикі та синантропні птахи мають вільний доступ до годівниць, поїлок з питною водою, відходів боєнського цеху. На території господарства мешкають хатні горобці, голуби, ворони, а також зустрічаються дикі водоплавні птахи (крижні, представники мартинів) особливо в зимовий період. Відстріл відбувався на території ферми з утримання водоплавної птиці.

РОЗДІЛ З. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

3.1 Епізоотична ситуація щодо вірусних хвороб серед мігруючих водоплавних птахів у Біосферному заповіднику "Асканія-Нова"

3.1.1 Імунологічний моніторинг

Ньюкаслська хвороба. При інтерпретації отриманих результатів за діагностичний титр вважали титр антитіл 1:8 (3 log₂), тобто такий, який прийнятий в діагностиці НХ у сільськогосподарської птиці. Титр AT 1:2-1:4 в сироватці або в екстрактах жовтків яєць не вважали за позитивний. Результати імунологічного моніторингу мігруючих водоплавних птахів щодо цієї хвороби наведено в таблиці 3.1.1.1.

Встановлено, що з 57 досліджених у грудні 2001 році 10 проб сироваток крові крижнів не мали антитіл до вірусу НХ (17,54% від загальної кількості проб), 12 проб мали антитіла в титрах 1:2-1:4 (21,05%). У 35 пробах сироватки (61,41%), були виявлені антитіла в діагностичних титрах 1:8 (3 log₂) і вище. Антитіла в титрі 1:8 (З logz) мали 8 проб (14,03%), 1:16 (4 log₂) - 14 (24,58%), 1:32 (5 log₂) - 9 (15,79%). Максимальний рівень антигемаглютинінів 1:64 (6 log₂) було встановлено в - 4 пробах (7,01%). Слід відмітити, що рівень вірус специфічних антитіл не перевищував 1:128.

Наступні дослідження мігруючих крижнів були проведені в січні 2003 року. Всього було отримано проби сироватки крові від 113 крижнів. У 22 крижнів, тобто 19,46% від загальної кількості птахів цього виду, в сироватці крові не було встановлено AT до вірусу НХ. У 37 (32,74%) птахів були встановлені AT в титрах 1:2-1:4. Діагностичні титри антигемаглютинінів зареєстровані у 54 крижнів, що становило 47,80%. З них титр AT 1:8 мали - 25 (22,14%), 1:16 - 13 (11,51%), 1:32 -10 (8,85%), 1:64 - 6 (5,30%) крижнів.

Як і раніше, у 2003 не відмічено високих титрів антитіл до вірусу НХ (1:128 та вище).

При вивченні ситуації щодо НХ серед мігруючих крижнів під час чергової зимової міграції в січні 2004 року відловлено 145 птахів. Встановили, що тільки 12 з них, тобто 8,27%, не мали AT до збудника хвороби. Кількість позитивно реагуючих птахів - 133, що становило 91,73% від усіх досліджених. З них титр антитіл 1:8 мали 7 (4,82%) особин, 1:16 - 21(14,48%), 1:32 - 24 (16,56%), 1:64 - 46 (31,74%). У 2004 році, на відміну від 2001 та 2003 років, встановлені високі титри AT в сироватці крові крижнів: 1:128 - відмічено у 23 (15,87%), 1:256 - у 9 (6,20%), 1:512 - у З (2,06%) птахів, у той же час не було проб сироватки крові з титрами AT нижче діагностичних (1:2 -- 1:4).

Поряд з крижнями нами було обстежено 50 мігруючих огарів. У 2001 році для дослідження було відловлено 3 огарі, у яких титри AT до вірусу НХ становили 1:4, 1:32 та 1:128 (середній титр становив 4,66±1,45 log₂). У наступному 2003 році кількість досліджених птахів становила 10 особин. З них 20% були серонегативні, 40% мали AT в титрі 1:2 -- 1:4, та 40% - в титрі 1:8 (середній титр - 1,9±0,376 log₂). В січні 2004 року досліджена найбільша за весь період проведення моніторингу кількість огарів - 37 особин. Причому, всі птахи, яких досліджували, мали AT більш ніж, 1:8. AT в титрі 1:8 мали 2 (5,40%), 1:16 та 1:32 по 10 (27,03%), 1:64-9 (24,33%), 1:128-6 (16,21%) птахів. Середній титр склав 5,18±0,19 log₂.

За весь період моніторингових досліджень вивчено тільки 8 сірих гусок. З них три гуски (37,5%) були серонегативні до вірусу НХ, дві (25%) - мали AT в титрі 1:4 та три (37,5%) в титрі 1:8. СТ становив 1,62±0,49 log₂.

Білолобих гусей досліджували впродовж 2 років. У січні 2003 року з 19 білолобих гусей, яких вдалося відловити для досліджень, у 2 (10,52%) не було AT до збудника НХ, 8 (42,11%) - мали AT в титрах 1:2-1:4, 9 (47,37%) - в титрі 1:8 та вище, з них титр 1:8 у 15,78%, 1:16, 1:64 та 1:128-по 10,53% гусей. СТ становив 2,73±0,53 log₂.

У січні наступного року було досліджено 10 білолобих гусей, які мали AT до збудника НХ в титрі 1:8 та вище, з них титр 1:8 у 20%, 1:32 - 20%, 1:64 - 40%. У 20% птахів було зареєстровано високий титр 1:512. Середній титр - 5,8±0,64 log₂.

Результати моніторингових досліджень мігруючих водоплавних птахів у заповіднику "Асканія-Нова" під час гніздування наведено в таблиці 3.1.1.2.

Як видно з таблиці, в 2002 році для досліджень було зібрано 43 яйця крижня звичайного. При проведенні досліджень встановили, що 7 (16,27%) екстрактів жовтка яєць не містили AT до вірусу НХ, 6 (13,95%) містили антитіла в титрах 1:2-1:4. В ЗО (69,78%) пробах екстрактах жовтка встановили AT в діагностичних титрах. Причому титр AT 1:8 у 11 (25,59%), 1:16 - 14 (32,57%), 1:32 - 3 (6,97%), максимальний титр 1:64 - було встановлено у 2 пробах досліджених екстрактів жовтка (4,65%). Середній титр 2,93±0,26 log₂.

У наступному 2003 році було досліджено 20 екстрактів жовтків яєць крижня. В 5 (25%) екстрактах не було AT, у 8 (40%) містилися AT в титрах 1:2 - 1:4 та в 7 (35%) екстрактах антигемаглютиніни були в титрах 1:8 та вище, найбільший титр становив 1:32 - в 2 пробах (10%). СТ склав 1,95±0,43 log₂.

Дослідження 2004 року показали, що з 18 проб екстрактів жовтків яєць крижнів 10 (55,5%) не мали AT, а 8 (44,5%) - титр AT 1:2 - 1:4. Екстрактів жовтків із діагностичними титрами антигемаглютинінів у цьому році встановлено не було. СТ AT по групі крижнів, які гніздилися в заповіднику, становив відповідно 0,66±0,20 log₂.

За три роки в заповіднику досліджено 30 екстрактів жовтків яєць огарів. У 2002 році з 10 проб в 1 екстракті жовтка (10%) не було AT до вірусу НХ, в 4 пробах (40%) - титр AT становив 1:2 - 1:4, а в 5 (50%) пробах встановлено діагностичний титр антигемаглютинінів. З них 2 проби (20%) мали титр 1:8 та 3 (30%) - 1:16. Середній титр склав - 2,4±0,45 log₂.

У 2003 році також було зібрано 10 яєць огарів. З них 60% містили AT до вірусу НХ в титрі 1:4, а 40% - в титрі 1:8. СТ становив 2,4±0,16 log₂.

При дослідженні 10 проб екстрактів жовтків яєць огарів, зібраних у 2004 році, 30% (3 проби) з них зовсім не мали AT, також 30% (3 проби) - містили AT 1:2 - 1:4, 30% мали антигемаглютиніни в титрах 1:8, 10% - в титрі 1:16. СТ становив 1,7±0,471о&. ;

Дослідження екстрактів жовтків яєць сірої гуски були проведені тільки в 2004 році. Встановлено, що з 8 проб екстрактів всі містили AT в титрах 1:2 - 1:4. Відповідно й середній титр був 1,62±0,18 log₂.

Аналізуючи результати моніторингу ми не встановили чіткого зв'язку між епізоотичною ситуацією під час зимової та весняної міграцій. Так, у 2001-2002 роках у крижнів, які прилітали до заповідника під час зимової міграції, та птахів, які тут гніздилися, рівень AT практично не відрізнявся. У грудні 2001 року СТ AT до вірусу НХ у крижнів становив 2,94±0,269 log₂, а влітку 2002 року - 2,93±0,26 log₂. В 2003 році збереглася практично така ж тенденція, але середні титри незначно відрізнялися. У січні 2003 року СТ був вищій та склав 2,4±0,165 log₂, а влітку цього ж року - 1,95±0,43 log₂. Зовсім інша картина спостерігалася в 2004 році. Взимку серед крижнів, що прилітали до заповідника зареєстрували високу кількість птахів з титрами вище 1:8. Звертає на себе увагу той факт, що в цьому році у крижнів зареєстровано високий рівень антигемаглютинінів 1:128-1:256-1:512. Середній титр AT становив відповідно 5,24±0,170 log₂. А влітку у крижнів, що гніздилися в заповіднику AT не перевищували 1:4. Відповідним був й середній титр 0,66±0,20 log₂.

Ситуація щодо імунологічного фону серед огарів була подібна до ситуації у крижнів. Відмінністю було те, що взимку 2001 року в огарів середній титр AT до вірусу НХ, був вищий в 2 рази при порівнянні з сезоном гніздування (взимку -4,66±1,45 log₂, а влітку 2,4±0,45 log₂). У 2003 році рівень AT в огарів, що прилітають до заповідника взимку, та в тих, що гніздяться, були практично однакові, але середній титр влітку був трохи вищий (1,9±0,376 log₂ та 2,4±0,16 log₂ відповідно взимку та влітку). У 2004 році в огарів спостерігалася ситуація, подібна до ситуації у крижнів у тому ж році. Під час зимової міграції в огарів зареєстровано високий рівень антигемаглютинінів (1:16, 1:32, 1:64) СТ склав 5,18±0,19 log₂, в протилежність цього влітку в огарів був невисокий рівень AT і становив 1,7±0,47 log₂.

Отже, при проведенні імунологічного моніторингу мігруючих водоплавних птахів у заповіднику «Асканія-Нова» встановлено наявність AT до вірусу НХ у крижнів звичайних, огарів, білолобих та сірих гусей. Високий рівень AT було виявлено у крижнів, огарів та білолобих гусей. Аналіз отриманих результатів дозволяє зробити висновок, що титри AT та кількість птахів, які мають їх в діагностичних титрах, не є стабільними показниками. Вони змінюються з року в рік, під час кожного міграційного сезону.

Синдром зниження несучості-76. Враховуючи літературні відомості про широке розповсюдження збудника цієї хвороби серед свійських та диких качок, ми провели імунологічний моніторинг щодо вірусу СЗН-76 серед диких водоплавних птахів заповідника „Асканія-Нова". Результати цієї роботи представлені в таблицях 3.1.1.3.

У довідковій літературі за діагностичний титр AT при серодіагностиці СЗН-76 у сільськогосподарської птиці приймають титр AT 1:4-1:32 [26]. В нашій роботі за діагностичний титр у диких птахів було прийнято титр 1:8.

За умов проведення роботи протягом трьох років отримано такі результати. В сироватці крові крижнів, досліджених в 2001 році, у 17 (29,82%) птахів не встановлено AT до вірусу СЗН-76, 13 (22,81%) мали AT в титрах 1:2-1:4, а 27 голів (47,37%) - AT в титрах вище 1:8, а саме: 1:8-8 проб (14,04%), 1:16-10 (17,55%), 1:32-5 (8,78%), 1:64-2 (3,50%), 1:128-2 (3,50%). СТ AT до вірусу СЗН цієї групі птахів становив 2,29±0,278 log₂.