Методы химического анализа

Выходящий из колонки поток носителя -- элюента вступает в детектор, регистрирующий определённое свойство потока (например, теплоноситель).

Когда через детектор проходит зона компонента, детектор выдаёт сигнал, т.к. свойство потока изменяется и величина сигнала пропорциональна содержанию компонента в носителе.

Последовательность сигналов детектора, записанная на ленте самописца, называется хроматограммой.

Достоинствами проявительного метода хроматографии является:

При выборе подходящих условий из колонки выходят зоны всех компонентов, отделённые чистым элюетном, т.е. происходит полное разделение смеси.

Время удерживания каждого компонента при заданных условиях хроматографирования является постоянной величиной и может быть использовано для идентификации веществ.

Не требуется дополнительной регенерации сорбента, т.к. он непрерывно регенерируется элюентом.

2. Фронтальная хроматография.

Это простейший по методике вариант хроматографии, он состоит в том, что через колонку с сорбентом непрерывно пропускают смесь компонентов А, В, С, Д в растворителе S. Если сорбируемость компонентов растёт в ряду А < В < С < Д …, то на выходе из колонки сначала появляется компонент А, затем смесь А + В, затем смесь А + В + С , а потом исходная А + В + С + Д.

Хроматограмма в этом случае будет иметь вид ступенчатой кривой, т.е. детектор будет выдавать сигналы в соответствии со свойствами потока, выходящего из колонки, т.к. свойства потока изменяются, изменяется и сигнал, ему соответствующий, величина сигнала соответствует содержанию компонентов в носителе.

Сигнал детектора

А + В + С + Д

А + В + С + Д + S

А + В + С + S

А + В + S

А + S

Раств. S

Время

Фронтальный метод целесообразно применять для очистки раствора от примесей, которые сорбируются существенно лучше, чем основной компонент или для выделения из смеси наиболее слабо сорбирующихся веществ.

Таким образом, в фронтальном методе при постоянном введении в хроматографическую колонку компонентов в чистом виде можно выделить только один компонент, наиболее слабо сорбирующийся, а остальные выйдут из колонки в виде смеси.

3. Вытеснительная хроматография.

В этом методе анализируемую смесь компонентов А и В в растворителе вводят в колонку и промывают раствором вещества Д (вытеснителя), сорбируется лучше, чем компоненты А и В.

Вытеснитель Д вытесняет компонент, имеющий более высокую сорбируемость, например В, и вытесняет менее сорбируемый компонент А. Происходит перемещение компонентов А и Д вдоль слоя сорбента со скоростью, равной скорости движения вытеснителя Д.

При этом образуются зоны компонентов, вплотную примыкающие одна к другой и расположенные в порядке возрастания сорбируемости компонентов. Из колонки последовательно выходят компоненты А и В в соответствии с их избирательной сорбируемостью.

Концентрация раствора при этом методе не уменьшается, но большим недостатком является наложение зоны одного на зону другого, поскольку зоны компонентов не разделены зоной растворителя. Д

Сигнал детектора А + В

В

Д А + В

В А А + В

А + В А В

А

IV. В зависимости от способа оформления процесса различают колоночную хроматографию и плоскую (на бумаге и тонкослойную)

В колоночной хроматографии -- неподвижная фаза в виде мелкозернистого твёрдого адсорбента или инертного материала, пропитанного определённой жидкостью, находится в длинной узкой трубке. Такая колонка называется насадочной.

Применяются также капиллярные колонки, в которых неподвижная фаза покрывает тонким слоем внутреннюю стенку колонки.

В тонкослойной хроматографии используются стеклянные пластинки, на которых нанесен тонкий слой сорбента, а также листы специальной хроматографической бумаги.

V. По назначению хроматографию подразделяют на:

аналитическую -- для проведения качественного и количественного анализа

препаративную -- для выделения небольших количеств чистых веществ

промышленную -- для получения чистых веществ в больших количествах

5.1.2 Теоретические основы хроматографии.

Понятие о хроматограмме. Расшифровка хроматограмм

(расчёт на основе её параметров).

Задачей теории хроматографии является установление закона движения хроматографических зон и выбор оптимальных условий разделения.

Хроматографическое разделение основано на различной сорбируемости компонентов. Сорбируемость описывается изотермой сорбции, отражающей зависимость концентрации в неподвижной фазе (сорбенте) -- Са от концентрации в подвижной фазе -- С.

Са

С

Линейные участки изотерм, соответствующие малым концентрациям линейны и описываются законом Генри.

Са = К · С

К -- константа Генри, она характеризует сорбируемость данного компонента, чем больше К, тем больше сорбируемость.

Разделение определяемого компонента между фазами.

В любой хроматографической системе происходит обратимый переход молекул определяемого компонента А из подвижной фазы (ПФ) в неподвижную (НФ), при этом:

Сп.ф. - Сн.ф. (устанавливается равновесие)

Сорбируемый процесс в хроматографической колонке характеризуется константой равновесного распределения или коэффициентом равновесного распределения, который представляет собой отношение равновесной концентрации вещества в неподвижной фазе к концентрации вещества в подвижной фазе:

Краспр. = [Сн.ф.] / [Сп.ф.]

Рассмотрим Краспр. для компонента А:

Краспр. = [Ан.ф.] / [Ап.ф.]

[Ан.ф.] = mАн.ф. / Vн.ф. [Ап.ф.] = mАн.ф. / Vп.ф.

отсюда: Краспр. = k` = Краспр. = k`

где: mАн.ф., mАп.ф. -- количество компонента А в неподвижной и подвижной фазах

Vп.ф., Vн.ф. -- объёмы подвижной и неподвижной фазы

K -- коэффициент ёмкости

Коэффициент распределения зависит от природы определяемого компонента, природы подвижной и неподвижной фазы, температуры, рН, концентрации и др. скорость движения зоны данного вещества обратно пропорциональна коэффициенту распределения Краспр.

При больших значениях Краспр. -- большая часть определяемого компонента находится в неподвижной фазе (НФ) и перемещается медленно.

Если Краспр. малая величина, то определяемый компонент быстро продвигается по колонке.

Два компонента с различными Краспр. будут перемещаться с разными скоростями, что является определяющим фактором хроматографического разделения.

При хроматографических определениях вещество подвижной фазы (ПФ) вступает в контакт с участками неподвижной фазы (НФ) -- сорбента, проходит через весь его слой и на выходе из колонки поток подвижной фазы -- носителя вступает в детектор, который регистрирует изменение свойств потока, изменения эти происходят за счёт изменения концентрации определяемого компонента в потоке.

Понятие о хроматограмме.

Вещество подвижной фазы, содержащее жидкий или газообразный носитель и определяемые компоненты вступает в контакт с участками неподвижной фазы -- сорбента, проходит весь его слой и попадает в детектор, который регистрирует изменение свойств потока, эти изменения происходят за счёт изменения концентрации определяемого компонента в потоке. Это приводит к изменению сигналов детектора, фиксируемых лентой самописца. Эта запись, как уже упоминалось, называется хроматограммой. Хроматограмму называют также выходной кривой. Она служит выражением результатов хроматографического разделения веществ.

Сорбционная способность неподвижной фазы характеризуется временем удерживания (tR) или объёмом удерживания (VR), который представляет объём подвижной фазы, прошедшей через слой сорбента за время tR. Между ними зависимость

х_R = t_R · х х -- объёмная скорость подвижной фазы

Нулевая линия -- часть хроматограммы, полученная при регистрации сигнала детектора во время выхода из колонки чистой подвижной фазы. Существуют другие параметры хроматограммы

С tR₂

tR₁

ДtR_2,1

h

3 4

tR₀

2 1

м м _0,5

V

1 -- нулевая линия; 2 -- пик несорбируемости компонента; 3, 4 -- пики определяемых компонентов.

Высота выходной кривой -- высота пика h -- перпендикуляр из максимума пика на нулевую линию.

Ширина пика м -- отрезок отсекаемый на нулевой касательной к кривой в точке перегиба (или на половине высоты -- м_0,5).

t_R -- промежуток времени от момента ввода пробы до достижения max h на пике.

Расшифровка хроматограммы.

Расшифровка хроматограммы сводится к определению высоты и ширины пика, если пик узкий, то определяют только высоту пика. Высота пика определяется как высота перпендикуляра, проходящего через max точку пика на нулевую точку пика, если пик пологий, то высоту проводят из точки пересечения касательных. Для широких пиков определяется не только высота, но и ширина, т.к. устанавливается зависимость между концентрацией компонента и высотой и площадью пика.

h h

1/2h h

a a

h = fC S = fC S = h · Ѕ a -- основание

Ширина пика находится как ширина основания треугольника, полученного при пересечении двух касательных с нулевой линией. (иногда используют 1/2h).

Хроматографический метод анализа можно использовать как для качественного, так и для количественного анализа.

1) В качественном анализе используют несколько методик расшифровки хроматограмм.

а) качественный анализ по времени удержания Rуд. (фуд.)

Rуд. (фуд.) -- время удержания - это промежуток времени от момента ввода пробы до выхода max на хроматограмме, оно зависит от условий хроматографирования, от природы анализируемого компонента. Метод заключается в том, что отмечают фуд. эталонной смеси, затем исследуемой. При сравнении судят о составе смеси.

б) качественный анализ по форме хроматограмм.

Вначале получают хроматограмму исследуемой смеси, затем вводят в анализируемую смесь предполагаемое вещество.

Если введённое вещество в смеси есть, то увеличивается величина соответствующего пика, если отсутствует -- появляется дополнительный пик.

 а) б) в)

Хроматограмма в-ва нет есть

(первичная)

Если в анализируемую смесь, имеющую хроматограмму (а) ввести этиловый спирт и прохроматографировать, то может быть два новых вида хроматограмм.

(б) -- говорит об отсутствии этилового спирта

(в) -- говорит о присутствии этилового спирта

в) табличный качественный анализ с применением хроматографирования исследуемого и введённого эталонного раствора.

На основании полученных хроматограмм рассчитывают относительно удерживаемые объёмы по времени удержания и сравнивают с табличными данными и по ним проводят идентификацию:

V_отн. = (ф_уд.^иссп. - ф₀) / (ф_уд.^эт. - ф₀)

Где: ф_уд.^иссп -- время удержания исследуемой смеси

ф_уд.^эт -- время удержания эталона

ф₀ -- время удержания газа-носителя

Иногда используют не время удержания, а расстояние в мм (i) от момента вкалывания пробы до появления max пика.

V_отн. = (i_уд.^иссп. - ф₀) / (i_уд.^эт. - ф₀)

2) Количественный анализ основан на методиках, учитывающих изменение различных параметров пика, зависящих от концентрации анализируемых компонентов -- h, a, S и V_R или hV_R.

а) Метод нормировки -- сумму параметров пиков (h, S) принимают за 100 % и массовая доля находится как отношение h и S отдельных пиков к этой сумме (х100)

% = · 100 % = · 100

б) Метод абсолютной калибровки -- наиболее точен. В нём экспериментально определяют зависимость h или S от концентрации и строят калибровочные графики по стандартным растворам, а потом хроматографируют смесь и по высоте полученных пиков определяют С.

Если тщательно готовить стандарт смеси и выдерживать условия хроматографирования, метод отличается высокой точностью.

в) Метод внутреннего стандарта основан на введении в анализируемую смесь точно известного количества стандарта, близкого по физическим свойствам к компонентам смеси. Смесь хроматографируют, определяют h и S.

% = · 100

Дать пример расчёта на метод нормировки и внутреннего стандарта.

Примеры расчётов.

1. При хроматографировании смеси компонентов, расшифровка хроматограммы дала следующие данные:

	h	a1/2	k	S	Siki
Пропан	110	9	1,13	990	1118,7
Пентан	71	10	1,11	710	788,1
Бутан	22	7	1,11	154	170,94

Определить %-ное содержание компонентов в смеси, используя метод нормировки.

2. Вычислить % толуола в пробе по методу внутреннего стандарта, если данные хроматографирования:

(в качестве внутреннего стандарта - бензол)

3. При определении бутилового спирта методом газовой хроматографии были получены следующие пики в зависимости от содержания, используя калибровочный график:

С, мг	0,2	0,4	0,6	0,8	1
h, мм	18	37	48	66	83

Для 0,02 мл исследуемого раствора получили пик h = 57 мм.

Определить %-ное содержание спирта, если с = 0,91 г/мл

3). Методы идентификации в газовой хроматографии.

В газовой хроматографии параметры удерживания какого-либо соединения в смеси при определённых условиях характеризуют природу этого соединения, поэтому они (параметры удерживания) могут быть использованы для целей идентификации.

В качестве параметров для идентификации чаще всего используют время удерживания t_R, удерживаемый объём V_R, логарифмический индекс удерживания J.

В практике качественного газохроматографического анализа используют следующие способы идентификации компонентов:

1. Сравнение параметров удерживания неизвестного вещества и эталонного соединения при идентичных условиях хроматографирования.

2. Применение графических или аналитических зависимостей между характеристиками удерживания и физико-химическими свойствами веществ (молекулярной массой, t_кип., числом углеродных атомов или функциональных групп и т.д.).

3. Сочетание газовой хроматографии с другими инструментальными методами (ИК-спектроскопией и др.).

4. Применение селективных детекторов.

4). Практическое применение.

Большое значение газовой хроматографии в практике вызвано тем, что с её помощью можно идентифицировать отдельные компоненты сложных газовых смесей и определить их количество. Метод является универсальным и не требует больших затрат времени.

Этим методом анализируют нефтяные и рудничные газы, воздух, продукцию основной химии и промышленности органического синтеза, нефть и продукты её переработки, производят разделение изотопов некоторых изотопов. Хроматография широко используется в биологии и медицине, в технологии переработки древесины, в лесохимии, пищевой промышленности и многих других.

Методы газовой хроматографии в физико-химических исследованиях, для анализа сложных многокомпонентных систем, определение микропримесей, а также для определения защитных свойств противогазных коробок и фильтр-поглощающих элементов.

5.1.3 Газовая хроматография (ГХ). Её виды

Подвижная фаза -- газ или пар (газ-носитель).

В зависимости от состояния неподвижной фазы различают газо-адсорбционную (ГХ) и газо-жидкостную (ГЖХ) хроматографию.

В ГХ -- неподвижной фазой является твёрдый адсорбент.

В ГЖХ -- неподвижной фазой является жидкость, плёнка жидкости на поверхности частиц твёрдого сорбента.

Газовая хроматография основана на различной сорбируемости компонентов смеси, применима для анализа смеси газов, легколетучих жидкостей и некоторых твёрдых веществ, способных переходить в паро- или газообразное состояние.

В качестве газа-носителя используют инертные газы -- Не, Ne, Ar, а также N₂, H₂, CO₂ и др. Скорость газа-носителя поддерживают постоянной.

Требования к газу-носителю:

Должен быть инертен по отношению к определяемым компонентам.

Должен быть химически чистым.

Быть дешёвым и легкодоступным.

Подходить к детектору.

В ГХ колонки заполняются твёрдым сорбентом. В качестве сорбентов может применяться активированный уголь, графит, силикагель, оксид алюминия, цеолиты и т.д.

Активированные угли неполярны, обладают высокой удельной поверхностью 1000-1700 м²/г, что обуславливает большую силу взаимодействия с анализируемым веществом.

Силикагель и оксид алюминия -- полярные адсорбенты, на их поверхности имеются заряды.

Применяемые в качестве сорбента цеолиты, являются алюмосиликатами щелочных металлов. Их можно рассматривать как молекулярные сита, т.к. их поры имеют размеры, близкие к размерам молекул и адсорбция на них является своеобразным “просеиванием”, сорбируются, в основном, вещества, молекулы которых могут проникать внутрь кристаллической решётки.

Сравнительно недавно начали использовать полимерные сорбенты на основе сополимеров стирола, этилстирола, дивинилбензола и др.

Требования к сорбенту:

Должен быть однородным.

Должен иметь большую поверхность.

Не должен взаимодействовать ни с компонентами смеси, ни с газом-носителем.

Обладать активностью.

Не иметь каталитических свойств.

При проведении работ по методу газовой хроматографии в колонке происходит процесс адсорбции газа на твёрдом адсорбенте, при использовании газожидкостной хроматографии вместо процесса адсорбции -- стал происходить процесс растворения газа в тонкой плёнке, находящейся на твёрдом носителе и эффективность разделения стала определяться не процессами адсорбции -- десорбции газа, как это происходит в адсорбционной газовой хроматографии, а процессами растворения газа в жидкой плёнке и его выделения.

Дозаторы -- устройства, предназначенные для ввода пробы. Проба может быть введена непосредственно в поток газа-носителя или в специальный дозирующий объём.

Небольшие количества вводят с помощью специальных микрошприцев (или медицинских). Большие по объёму пробы вводят с помощью газовых пипеток, твёрдые пробы растворяют и вводят в виде раствора с помощью микрошприца.

Принципиальная схема газового хроматографа

4

5

2 3 10

1

6

1. Баллон с газом-носителем Р = 100 атм.

2. Редуктор

3. Ротаметр, для измерения объёма газа (расход)

4. Осушительная колонка

5. Испаритель - дозирующее устройство 8 7

6. Хроматографическая колонка

7. Детектор

8. Регистратор - самописец

9. Конденсационные ловушки 9

10. Термостат

Подвижная фаза в виде газа-носителя непрерывно подаётся из баллона, анализируемая проба с помощью микрошприца вводится в испаритель в поток газа-носителя и попадает в хроматографическую колонку - 6. Объём вводимой пробы от 0,0001 - 0,1 мл.

Колонка может быть прямая, V или W-образная, в форме спирали; может быть стеклянная, металлическая, пластмассовая.

Длина колонки 1-100 м ш 3-50 мм.

Для аналитических целей ? = 1,5-2,0 м ш 0,25-50 мм.

Чем меньше диаметр колонки, тем выше эффективность.

Металлические колонки прочнее, но плохо видно как идёт заполнение адсорбента, стеклянные -- видно адсорбент, но хрупкие.

В колонке идёт основной процесс -- процесс адсорбции газа на твёрдом адсорбенте, в газожидкостной хроматографии -- процесс растворения газа в тонкой плёнке.

Детекторы -- преобразуют информацию о составе газа выходящего из колонки в электрический или пневматический импульс. Существуют интегральные и дифференциальные детекторы.

Дифференциальные -- отражают мгновенное изменение измеряемой величины, а интегральные -- суммируют это значение за определённый промежуток времени.

Чаще применяют дифференциальные детекторы, основанные на применении теплопроводности газа (ДТП) или пламенно-ионизационные (ДИП).

Принцип ДТП -- катарометра основан на изменении электрического сопротивления проводника в зависимости от теплопроводности. Измерительная схема моста по принципу моста сопротивления, плечи этого моста - металлические нити, сопротивление которых зависит от температуры, одна нить -- в рабочей ячейке А, а вторая -- в ячейке сравнения В и нагреваются постоянным током. Если через обе ячейки идёт одинаковый по составу газ, то теплоотдача одинаковая, одинаковая температура, одинаково сопротивление и сигнал равен 0, уравновешен. При изменении состава одного из потоков - характер теплоотдачи меняется, меняется температура, сопротивление и сигнал отличен от 0.

Работа ДИП основана на измерении электропроводности водородного пламени, в котором сжигают анализируемую газовую смесь. Когда горит чистый водород -- ионов не образуется и электропроводность ничтожна. При сжигании пробы образуются ионы и электропроводность увеличивается.

5.1.4 Жидкостная хроматография

Среди хроматографических методов анализа наиболее разработанным является газовая хроматография, однако при некоторых анализах этот метод малоэффективен (малолетучих, химически и термически нестойких, высокореакционноспособных и др. веществ), поэтому целесообразнее применять жидкостную хроматографию.

Жидкостная хроматография основана на взаимодействии, возникающем при движении жидкой фазы сквозь неподвижный слой сорбента, обладающего большой суммарной поверхностью.

Особенностью хроматографического метода является распределение компонентов разделяемой смеси между фазами, одна из которых неподвижная большая поверхность, а другая -- поток, фильтрующийся через неподвижный слой, в жидкостной хроматографии этот поток -- жидкость (подвижная фаза).

Во всех случаях, когда подвижная фаза является жидкостью, мы имеем дело с жидкостной хроматографией, независимо от того, в каком состоянии находится неподвижная фаза.

Жидкостная хроматография получает всё большее развитие и применение с внедрением новых селективных адсорбентов на основе полимеров и становится высокочувствительным методом анализа многокомпонентных смесей в растворах.

В качестве хроматографической колонки в аналитической практике используют бюретки, делительные воронки.

Через колонку, заполненную адсорбентом, пропускают анализируемую смесь, состоящую из компонентов пробы и растворителя.

Эти компоненты будут распределяться на адсорбенте в зависимости от адсорбционной способности. В первую очередь (вверху колонки) будет адсорбироваться компонент с наибольшей адсорбционной способностью. Далее вниз по колонке растворяются компоненты по мере уменьшения адсорбционности. Например, имеются компоненты А и В в растворителе (Г-адсорбционная способность)

(Г) - Г_А больше Г_В

Для более чёткого разделения зон через колонку пропускают дополнительные порции растворителя, промывают растворителем.

 А + В (растворитель)

Г_А > Г_В

А А А

А

В В В В

При этом зона А смещается несколько вниз, компонент В полностью вымывается из зоны А и также смещается вниз по колонке, между зонами А и В появляется промежуток. Если промывать колонку растворителем, то можно добиться вымывания компонентов из колонки в таком порядке:

1. В 2 Растворитель 2А

Жидкость, вытекающая из колонки -- элюент.

Процесс хроматографического анализа складывается из 2-х стадий:

Подготовка колонки

Получение хроматограммы

Сущность жидкостной хроматографии состоит в том, что разделяемые вещества перемещаются через слой сорбента (НФ) вместе с подвижной фазой с разной скоростью вследствие различной сорбируемости.

В классическом варианте жидкостной хроматографии через хроматографическую колонку, заполненную сорбентом (НФ) пропускают элюент (ПФ).

Элюент -- жидкость движется под воздействием силы тяжести, скорость движения элюента можно регулировать.

Пробу анализируемой смеси помещают в верхнюю часть колонки, по мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов и через определённые промежутки времени отбирают фракции элюента, которые подвергают анализу с целью определения концентраций анализируемых компонентов.

Аппаратура, применяемая в классической жидкостной колоночной хроматографии постоянно модернизируется, совершенствуется.

С начала 70-х годов получила развитие современная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) -- скоростная, хроматография высокого давления.

Появление этого метода было обусловлено необходимостью проведения анализа высококипящих (> 400 єС) или неустойчивых соединений, которые не разделяются методами газовой хроматографии, а также с целью увеличения скорости и эффективности разделения.

Для осуществления этого применяют колонки с малым внутренним диаметром (2-6 мм), уменьшили диаметр частиц сорбента (5-50 мкм), что привело к необходимости увеличить давление на входе колонки до 0,5-40 Мпа. Выпускаемые промышленностью жидкостные хроматографы снабжены высокочувствительными детекторами, позволяющими определить до 10^-9 - 10^-10 г вещества.

Достаточно высокая скорость анализа, низкий предел обнаружения, высокая эффективность колонки, возможность определить любые вещества (кроме газов) привели к быстрому развитию высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В высокоэффективной жидкостной хроматографии реализуют все механизмы разделения -- адсорбция, распределение, ионный обмен и др., но независимо от механизма разделения подвижной фазой (ПФ) является жидкость.

В жидкостной хроматографии применяются хроматографические параметры -- t_R, V_R (время удерживания и удерживаемый объём).

Принципиальная схема жидкостного хроматографа.

Основные узлы

Элюент в колонку подаётся по определённой программе, состав и скорость подачи элюетна может изменяться в зависимости от условий анализа. Для обеспечения высокой скорости анализа установка жидкостной хроматографии снабжена двумя насосами (3, 4), которые управляются микропроцессором (5) и могут создавать давление до 40 МПа. Проба вводится в поток элюента через специальное устройство дозатор (инжектор) - (7). После прохождения через хроматографическую колонку (8) вещества детектируются высокочувствительным детектором (9), сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ (11). Можно зарегистрировать параметры t_R и V_R на ленте самописца или автоматически отобрать фракции в момент выхода пиков, чтоб провести анализ этих фракций, используя любые методы анализа.

Колонка ЖХ

Колонка в жидкостной хроматографии представляет собой трубку из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2-6 мм и длиной 10-25 см, отполированную внутри. Колонка заполняется частицами сорбента размером 3,5-10 мкм, обычно сферической формы. Обычно используют суспензию в специально подобранном растворителе под давлением 50-80 МПа, такие колонки обладают высокой разделяющей способностью.

Детекторы

В качестве детекторов в жидкостной хроматографии обычно используют высокочувствительные спектрофотометры, которые позволяют обнаружить определяемые компоненты в количествах до 10^-10 М, поглощающие свет в УФ или видимой части спектра (в пределах 190-800 нм).

В современных системах применяют высокочувствительные спектрофотометры, которые способны регистрировать спектр в течение 0,01-0,05 с, что очень важно при качественной идентификации соединений.

При анализе соединений, способных окисляться или восстанавливаться применяют электрохимический детектор, иногда применяют флуоресцентные детекторы и детекторы по электропроводности, которые чаще всего применяют в ионообменной хроматографии.

Неподвижные фазы (НФ)

Неподвижные фазы (НФ), применяемые в жидкостной хроматографии не должны смешиваться с подвижной фазой, должны быть механически и химически устойчивы в условиях анализа, обеспечивать требуемую селективность и эффективность.

В качестве таковых применяют силикагель, оксид алюминия и др.

Силикагель -- (гель кремниевой кислоты SiO₂ · xH₂O) -- одна из широко используемых НФ, специфический сорбент.

Адсорбция на силикагеле происходит вследствие образования водородных связей адсорбируемого вещества с поверхностными силанольными группами ? Si -- OH. Силикагель более прочно удерживает вещества с большим количеством водородных связей.

Для хроматографических целей используют силикагели с площадью поверхности 100-700 м²/г.

Поверхность силикагеля имеет слабо-кислый характер (рН = 3-5), поэтому соединения основного характера сорбируются на нём лучше, чем на сорбентах поверхность которых имеет основной характер (рН > 7). Силикагели применяют для разделения углеводородов, спиртов, фенолов, аминов, органических кислот, стероидов, липидов, комплексных соединений и др.

Оксид алюминия (Al₂O₃) -- поверхность этого сорбента, образованная ионами Al³⁺ и О^2- - способна создавать сильное электростатическое поле, обладающее поляризующим свойством, поэтому на оксиде алюминия в большей степени сорбируются легко поляризуемые соединения, имеющие систему легко смещаемых электронов, легко адсорбируется на поверхности оксида алюминия вода, которая удаляется при нагревании до 300-400єС.

Различают три вида адсорбционных центров на оксиде алюминия:

кислотные, взаимодействующие с веществами, имеющие области с высокой электронной плотностью;

основные -- адсорбирующие кислоты;

электронно-акцепторные, взаимодействующие с легко поляризуемыми ароматическими молекулами.

Количество воды на поверхности сорбента -- и силикагеля и оксида алюминия влияют на процесс хроматографирования, поэтому для получения достоверных результатов хроматографирования необходимо поддерживать постоянное количество воды как на поверхности сорбента, так и в элюенте.

Кроме силикагеля и оксида алюминия в высокоэффективной жидкостной хроматографии применяют модифицированные сорбенты:

¦

а) ? Si -- O -- Si -- (CH₂)₇ -- CH₃ неполярный октильный силикагель

¦

¦

б) ? Si -- O -- Si -- (CH₂)₁₇ -- CH₃ неполярный октадецильный силикагель

¦

¦

в) ? Si -- O -- Si -- (CH₂)₃ -- NH₂ полярный аминопропильный силикагель

¦

¦

г) ? Si -- O -- Si -- (CH₂)₃ -- CN полярный цианпропильный силикагель

¦

¦

д) ? Si -- O -- Si -- (CH₂) -- неполярный фенил метиленовый силикагель

¦

Модифицированные сорбенты можно получить за счёт химической модификации силикагеля, силановые группы на поверхности силикагеля заменяют на различные органические соединения, что приводит к изменению селективности НФ.

¦ ¦ ¦

O O O

¦ ¦ ¦

Si -- O -- Si -- O -- Si --

¦ ¦ ¦

O O O

¦ ¦ ¦

Si -- O -- Si -- O -- Si --

¦ ¦ ¦

O O O

¦ ¦ ¦

(силикагель)

В качестве полярных модифицированных сорбентов используют силикагели с привитыми цианопропильными, аминопропильными, оксипропильными группами и др. (в, г).

На модифицированных полярных сорбентах значительно быстрее устанавливается равновесие при переходе от элюента, меньше погрешности анализа.

В качестве неполярных модифицированных сорбентов используют силикагели с привитыми этильными (С₂), октильными (С₈), октадецильными (С₁₈) и фенильными радикалами. Эти сорбенты имеют большое сродство к гидрофобным молекулам (а, б, д).

5.1.4 Распределительная хроматография

Распределительная хроматография является разновидностью жидкостной и основана на распределении вещества между двумя несмешивающимися фазами.

В качестве основного показателя в этом методе является коэффициент равновесного распределения, вернее различие в величинах коэффициентов распределения отдельных компонентов раствора между двумя ненасыщенными растворителями.

При распределительной хроматографии носитель пропитывается одним из растворителей -- “неподвижный” растворитель (например, водой пропитывают бумагу или силикагель). Другой растворитель (например, хлороформ) является “подвижным” растворителем и его пропускают через колонку носителя.

В качестве неподвижного растворителя чаще всего используют полярные жидкости -- воду, H₂SO₄, CH₃OH и др., в качестве подвижного растворителя применяют менее полярные жидкости, органические растворители.

Анализ может проводиться как в колонке, так и на бумаге и на пластинке -- в тонком слое.

При обработке носителя неподвижным растворителем -- на поверхности носителя образуется тонкая жидкая плёнка, колонка считается подготовленной к работе. После этого через колонку начинают пропускать исследуемую смесь в подвижном растворителе.

Подвижный и неподвижный растворители подбирают в зависимости от природы носителя.

Если носитель гидрофильный, то неподвижным растворителем должна быть вода, а подвижным растворителем -- органический малоподвижный растворитель.

Если носитель гидрофобный, то неподвижным растворителем должно быть органическое вещество, а подвижным растворителем -- вода. (Полярный растворитель всегда вытесняет менее полярный из полярных сорбентов).

Порцию исследуемой смеси, растворённой в подвижном растворителе, вводят в колонку и после того, как она впитывается верхней частью колонки, начинают промывание колонки подвижным растворителем.

В процессе промывания происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами.

Так как разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, то и скорость передвижения компонентов по колонке различна. Наибольшей скоростью продвижения по колонке будет обладать тот компонент смеси, который имеет наибольший коэффициент распределения.

Краспр. =

т.е. отношение концентрации растворённого вещества в подвижной фазе (г/л) к его концентрации в неподвижной фазе (г/л). если коэффициенты распределения отдельных компонентов смеси достаточно между собой различаются, то при промывании колонки образуются отдельные зоны чистых веществ, т.е. происходит полное разделение смеси. (Чем больше Краспр., тем быстрее вещество движется по колонке).

Например, смесь веществ А и В пропускают через воронку в подвижном растворителе, причём Краспр. компонента В больше Краспр. компонента В, поэтому скорость распределения компонента А будет больше и компонент А уходит вниз колонки.

 В

В

А Первичная

позиция А

Промывая колонку растворителем между компонентами образуется чёткая граница.

При дальнейшем промывании из колонки будет вытекать:

Подв.раств. + А

Подв.раств.

Подв.раств. + В

Разновидностью распределительной хроматографии является бумажная и тонкослойная.

В тонкослойной -- разделение проводится на пластинках, покрытых тонким слоем окиси алюминия, силикагеля или другого сорбента, который удерживает неподвижный растворитель. Нижний край пластинки с нанесённой на неё пробой опускают в подвижный растворитель.

Хроматография на бумаге является разновидностью метода распределительной хроматографии, носителем для неподвижного растворителя служит при этом фильтровальная бумага, а не колонка с сорбентом. Разделение веществ происходит вследствие различия в распределении между двумя жидкими фазами, одна из которых подвижна (смесь органических растворителей), а другая -- неподвижная и представляет собой воду, находящуюся в волокнах фильтровальной бумаги.

Разделение смесей веществ или ионов с помощью хроматографии на бумаге основано на различной скорости движения компонентов, которые характеризуются коэффициентом движения R_f.

Величины коэффициентов ионов вычисляют по формуле:

R_f = = где: х -- скорость движения зоны иона на бумаге

h -- расстояние, пройденное зоной иона на бумаге

х₁ -- скорость движения фронта подвижного растворителя

h₁ -- расстояние, пройденное растворителем

Под фронтом растворителя понимают видимую границу распространения растворителя по бумаге.

Коэффициент движения каждого катиона -- постоянная величина, не зависит от концентрации анализируемого раствора, температуры, присутствия других катионов и природы аниона, с которым связан изучаемый катион.

Однако, коэффициент движения R_f зависит от состава и свойств используемого подвижного растворителя, а также от сорта хроматографической бумаги.

Чем больше величина R_f, тем быстрее и дальше продвигается катион по бумаге и тем лучше отделяется он от другого катиона с низким значением R_f.

Например, у катионов Fe³⁺ и Cu²⁺ коэффициенты движения значительно отличаются по величине, поэтому они чётко разделяются.

Просто и удобно проводить разделение ионов с помощью круговых хроматограмм, полученных на обеззоленных фильтрах “синяя лента” с использованием в качестве хроматографической камеры-эксикатора. Для контакта с растворителем из фильтра вырезается полоска -- “фитиль”, который погружается в растворитель (а), или контакт с растворителем осуществляется с помощью конуса, сделанного из этой же фильтровальной бумаги и вставленного в середину отверстия, находящегося в середине фильтра-хроматограммы.



Конус бумажный

фитиль

растворитель

растворитель

Для расчёта R_f какого-то иона, например, Fе³⁺, на середине фильтра помещают 0,05 мл раствора, содержащего Fe³⁺, при этом этот процесс должен быть медленным, постепенным, чтоб происходило впитывание раствора за счёт капиллярных сил бумаги.

Образовавшееся пятно осторожно обводят простым карандашом, фиксируя его положение на бумаге, фильтр сушится и бритвой вырезается фитиль. После этого фильтр устанавливается над сосудом с растворителем, таким образом, чтоб контакт фильтра с ним осуществлялся через фитиль:

фильтр

фитиль

растворитель в тигле

Оставляют систему в таком виде на 2-3 часа, поместив её в эксикатор с крышкой (хроматографическую камеру) для размывания первичной хроматограммы, после этого вынимают фильтр из эксикатора и отмечают карандашом границы фронта растворителя, таким образом, получаем величины:

h -- расстояние, пройденное зоной иона на бумаге (для Fe³⁺ - экспериментально, 1,5 см)

h₁ -- расстояние, пройденное растворителем (экспериментально, для смеси 90 % С₂Н₅ОН и 10 % 5 н HCl, 4,8 см)

отсюда RFe³⁺ = = 0,31

Аналогично можно определить для любого иона (Rcu²⁺ = 0,45).

После этого можно провести хроматографическое разделение на бумаге смеси этих катионов. Причём, учитывая величины R_f , можно сделать заключение, что Cu²⁺ будет быстрее и дальше продвигаться по бумаге, т.к. имеет большую величину R_f, чем Fe³⁺.

Кроме круговых хроматограмм можно использовать бумажные полосы, помещённые в стеклянные камеры, эксикаторы, пробирки. Конец этих полос помещают в растворитель (восходящая хроматография, нисходящая хроматография).

а) Восходящая бумажная хроматография.

Исследуемое вещество наносят на линию старта, которая проводится на расстоянии 1-2 см от нижнего края ХР-бумаги.

Бумагу помещают в камеру с подвижным растворителем таким образом, чтобы линия старта была выше границы растворителя. (Камера закрыта крышкой). Под действием капиллярных сил подвижный растворитель поднимается вверх, захватывая компоненты анализируемой смеси. Так как компоненты обладают различной растворимостью в этом растворителе, то и двигаться они будут с различной скоростью. При этом происходит разделение смеси на компоненты.

Если смесь А и В (К_А > К_В), то В будет выше В.

Линия, до которой доходит подвижный растворитель -- называют линий фронта.

R_f = h -- путь, пройденный растворителем от линии старта до линии фронта

h₁ -- путь, пройденный веществом от линии старта до середины пятна.

б) Нисходящая бумажная хроматография.

В этом методе растворитель находится в верхней части камеры, линия старта находится в верхней части камеры, линия старта сверху. Растворитель движется вниз под действием силы тяжести, забирая с собой определяемое вещество, чем больше Кр вещества, тем ниже на бумаге будет находиться вещество.

Распределительная хроматография на бумаге, особенно с применением органических реактивов, является макроаналитическим методом, широко применимым в тех случаях, когда обычные химические методы малопригодны.

Например, для разделения близких по свойствам соединений -- аминокислот, пептидов, углеводов и т.д.

Хроматографию на бумаге используют для определения следов ФОВ в пищевых продуктах и на биологическом материале.

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография основана на явлении обмена ионов находящихся в растворе и ионов, адсорбируемых твёрдым адсорбентом. Образование хроматограмм в этом случае происходит вследствие неодинаковой способности к обмену различных ионов хроматографируемого раствора. В ионообменной хроматографии, также как и в адсорбционной, можно применять фронтальный, вытеснительный и проявительный (элюентный) метод анализа.

При фронтальном анализе исследуемую смесь непрерывно подают в верхнюю часть колонки и следят за появлением отдельных компонентов в вытекающем растворе, но полного разделения компонентов в этом методе не происходит и метод не пригоден для препаративного разделения и количественного определения веществ.

При вытеснительном методе анализа для вытеснения применяют растворы веществ, ионы которых сорбируются лучше, чем ионы компонентов хроматографической смеси, поэтому они вытесняют из сорбента ранее сорбированные ионы разделяемых веществ.

В проявительном (элюентном) методе промывание проводят чистым растворителем. Во всех видах ионообменной хроматографии имеет место многократное повторение процессов ионного обмена.

В зависимости от того происходит ли обменная сорбция положительно заряженных ионов (катионов) или отрицательно заряженных ионов (анионов) -- ионообменники делятся на катиониты и аниониты.

Существуют иониты, обладающие амфотерными свойствами..

а) Катионный обмен: RH + NaCl - RNa + HCl

б) Анионный обмен: ROH + NaCl > RCl + NaOH

R -- радикал, образующий элементарную ячейку ионита.

Качественная характеристика ионообмена зависит от природы ионита, хроматографируемого иона, растворителя, от условий опыта (tє, рН и др.).

Рассмотрим ионообменное равновесие на примере обмена на ионите двух одновалентных ионов А⁺ и В⁺.

RA + B⁺ - RB + A⁺

Согласно закона действия масс: Кр. = или = Кр.

Или = Кр. , где Кр. -- константа ионного обмена

[B⁺], [A⁺] -- концентрации ионов А и В в растворе

_ _

[B⁺], [A⁺] -- концентрация ионов В⁺ и А⁺ в твёрдой фазе

Аналогично для обмена двухвалентного иона на одновалентный

В²⁺ + 2RA > R₂B + 2A⁺

= Кр.

Константа равновесия (ионного обмена) позволяет количественно характеризовать сравнительную способность ионита к обмену.

Если Кравн. < 1 ион, находящийся в растворе, имеет большое сродство к иониту, чем ион, пришедший в раствор с твёрдой фазой -- на ионите. Обмен из раствора в этом случае будет протекать достаточно полно.

Если Кравн. > 1 ион раствора имеет меньшее сродство к иониту, чем ион, входящий в состав ионита, обмен в данном случае незначительный.

в) Сорбенты, применяемые в ионообменной хроматографии.

Вещества, применяемые в качестве ионообменных сорбентов, подразделяются на два основных класса: неорганические и органические сорбенты, которые могут быть естественного и искусственного происхождения.

Ионообменные сорбенты должны отвечать следующим требованиям:

Обладать максимально возможной поглотительной способностью;

Обладать избирательной сорбцией по отношению к веществам разделяемой смеси;

Быть однородными, иметь степень дисперсности, достаточную для обеспечения необходимой скорости адсорбции и равновесного прохождения раствора через колонку с требуемой скоростью;

Иметь ограниченную набухаемость, не растворяться в хроматографируемом растворе и той среде, в которой они используются, обладать механической прочностью;

Производство сорбентов должно быть экономически выгодным и основываться на применении отечественного сырья.

г) Минеральные иониты.

Сорбенты минерального происхождения -- слабокислотные китиониты или слабоосновные аниониты.

Наиболее распространены -- оксид алюминия, природные алюмосиликаты, фосфат циркония, применяемые как катиониты.

В качестве анионитов -- оксид Al, гидроксид Zr и др.

Органические иониты -- являются продуктами химической переработки угля и лигнина, их называют ионообменными смолами.

д) Органические иониты.

Катиониты содержат в своих формулах сульфогруппы -- SO₃H, фосфогруппы РО(ОН)₂, карбоксильные -- СООН -- (фенолформальдегидные, полистирольные катиониты).

Органические аниониты -- полиамины, т.к. содержат NH₂R⁺, NHR₂⁺ и т.д. Аминоформальдегидные, полиаминовые, полистирольные аниониты.

Использованные иониты можно вернуть в исходную форму, пропуская через него соответствующий раствор, этот процесс называется регенерацией.

Оксид алюминия проявляет амфотерные свойства и может играть роль как катионита, так и анионита.

Al₂O₃ -- катионит Al + NaOH + CO₂ > Al₂O₃

На поверхности Al₂O₃ адсорбируется NaAlO₂, образуя соединение (Al₂O₃)_mNaAlO₂, появляются подвижные ионы Na⁺

[(Al₂O₃)_mNaAlO₂^-]Na⁺ + Me⁺An > [(Al₂O₃)_mAlO₂^-]Me + NaAn

AlO₂^- Na AlO₂

Или (Al₂O₃)_m + MeAn₂ > (Al₂O₃)_m Me + 2NaAn

AlO₂^- Na AlO₂

Al₂O₃ -- анион (перед использованием промывают азотной кислотой, в результате чего на поверхности Al₂O₃ появляется подвижный анион -- NO₃).

[(Al₂O₃)_mAlO₂]Na + 2HNO₃ > [(Al₂O₃)_mAlO⁺]NO₃ + NaNO₃ + H₂O

[(Al₂O₃)_mAlO⁺]NO₃ + MeAn > [Al₂O₃)_nAlO⁺]An + MeNO₃

По способности поглощать ионы для каждого ионита существуют адсорбционные ряды по способности замещать друг друга (для Al₂O₃):

H⁺ > As³⁺ > Sb³⁺ > Bi³⁺ = Fe²⁺ + Hg²⁺ = UO₂ > Pb²⁺ > Cu²⁺ > Zn²⁺ > Co²⁺ = Ni²⁺ = Cd²⁺ > Mn²⁺

Т.е. на Al₂O₃ легче адсорбируется Н⁺, хуже Mn²⁺.

Реакции на органическом ионите (ионнообменной смоле) происходят по схеме:

2R - SO₃H + CuSO₄ > (RSO₃)₂Cu + H₂SO₄

Основные качества ионита определяются сорбционной ёмкостью, физическими свойствами и химической стойкостью.

Ёмкость сорбента условно характеризуется количеством растворённого электролита, поглощённым единицей веса или объёма сорбента.

К показателям физических свойств ионита следует отнести величину насыпаемого веса, влагостойкость и механическую прочность.

Химическая стойкость сорбента определяется по тем рабочим средам, в которых должна проходить сорбция и регенерация.

Мерой стойкости служит степень потери веса сорбента и степени потери ёмкости.

Многие сорбенты постепенно окисляются под влиянием кислорода воздуха, теряют прочность, снижается содержание активных групп, появляются водорастворимые фракции.

е) Получение хроматограммы на колонке и её анализ.

Раствор анализируемой смеси пропускают через хроматографическую колонку.

Вследствие различной адсорбируемости компонентов смеси в колонке образуются зоны. Однако, полного разделения смеси при этом не произойдёт, только первая, самая нижняя зона будет содержать в чистом виде один наименее адсорбируемый компонент, вторая -- будет состоять из смеси двух компонентов, третья -- из смеси трёх и т.д.

Таким образом, при получении первичной хроматограммы можно получить в чистом виде лишь одно из смеси веществ.

Для полного разделения компонентов смеси используют операцию вытеснения (элюирования). Она заключается в том, что после получения первичной или промытой хроматограммы, через колонку пропускают растворитель, способный вытеснять все или некоторые адсорбированные компоненты смеси. При этом компоненты смеси, вытесняя друг друга, располагаются в колонке в виде отдельных чистых зон в соответствии с их способностью к адсорбируемости, а продолжительным пропусканием раствора через колонку достигают последовательного вытеснения из колонки компонентов смеси.

Например, пропуская через колонку с анионитом солянокислый раствор ионов Fe³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺ и Bi³⁺ получают первичную хроматограмму этих ионов, сорбируемых на анионите.

Затем последовательно промывают колонку 2,5 н и 0,02 н HCl, а затем 2 н H₂SO₄.

При этом:

а) 2,5 н HCl разрушает менее прочные солянокислые комплексы Fe³⁺ и Cu²⁺ и они уходят в фильтрат;

б) 0,02 н HCl разрушает солянокислые комплексы цинка и свинца, вытесняя их из колонки;

в) 2 н H₂SO₄ разрушает комплекс висмута и также вытесняет его из колонки.

Собирая отдельные фракции вытеснения, проводят определение компонентов в них любым физико-химическим методом -- спектрометрическим, полярографическим и т.п.

Для выбора условий проведения хроматографического анализа, т.е. для изучения сорбции и десорбции каждого элемента в отдельности, строят выходные кривые. Полное разделение компонентов возможно, если между пиками концентраций имеет место чистая зона растворителя.

На приведённой кривой чёткое разделение между Cu²⁺, Pb²⁺, Bi³⁺, железо отделяется хуже.

Заключительной стадией хроматографического анализа смеси веществ является качественный и количественный анализ полученной хроматограммы.

Хроматограмма, полученная на адсорбенте белого цвета, представляет собой серию цветных зон, расположенных в определённом порядке.

Выявление бесцветных зон осуществляется методом проявления хроматограммы, обрабатывая зоны соответствующими реактивами или индикаторами.

Количественный анализ проводится лишь в том случае, когда осуществлено полное разделение смеси и хроматограмма состоит из отдельных неперекрывающихся зон, анализ сводится к определению вещества в каждой зоне. Широко применяется способ химического и радиохимического анализа отдельных зон, вырезанных из колонок.

При фронтальном анализе собирают последовательно порции фильтрата в отдельные приёмники и подвергают их количественному анализу химическими и физико-химическими методами.

Последовательность их распределения на колонке будет соответствовать величинам их ПР:

в верхней зоне расположится жёлтый осадок иодида серебра (ПРAgJ = 1,1·10^-16);

в средней части -- голубовато-серый бромида серебра (ПРAgBr = 6·10^-13);

в нижней части белый осадок хлорида серебра (ПРAgCl = 1,8·10^-10).

В качестве носителя используют чистые вещества, обладающие хорошей фильтрующей способностью (Al₂O₃, силикагель) -- высокодисперсные, (BaSO₄) -- гидродисперсные.

Носитель может быть индиферентным по отношению к осадителю, хроматографируемым веществам, к образующимся осадкам.

Желательно, чтобы носитель имел светлую окраску.

Осадитель -- это реагент, образующий с определяемыми ионами труднорастворимые осадки.

Осадитель должен быть индиферентным к носителю и хорошо адсорбироваться на носителе.

Осадочная хроматография может проводиться на колонке, на бумаге и на тонком слое.