Действия врачей-наркологов, проводящих медицинское освидетельствование на состояние опьянения

При курении за 72 часа выводится в виде метаболитов 50% дозы, остальные 50% распределяются в организме и в течение нескольких дней выводятся с мочой и калом.

Кинетика выхода ТГК из системы кровообращения практически одинакова при ингаляционном и внутривенном введении.

Депонируемые количества ТГК в тканях организма при длительном употреблении марихуаны и других ТГК-содержащих продуктов, приводят к постоянному поступлению ТГК в кровь и дальнейшему метаболизму.

При регулярном курении 2-3 раза в неделю положительный результат в моче может наблюдаться до 25-40 дней.

В случае пассивного курения (при длительном присутствии в замкнутом невентилируемом помещении с курящим) также возможно обнаружение ТГК и ТГК-СООН, выявленная концентрация при этом значительно ниже достоверного порога обнаружения.

6. Предварительные методы исследования ПАВ

Индикаторы и измерители алкоголя в выдыхаемом воздухе и биологических жидкостях (кровь, моча, слюна)

Определение алкоголя в выдыхаемом воздухе согласно нормативным документам Минздрава России и Минздрава СССР является обязательной процедурой при медицинском освидетельствовании на состояние опьянения.

При медицинском освидетельствовании, поскольку оно входит в перечень мер обеспечения производства по делу об административном правонарушении, т.е. имеет юридическую силу, допускается использование только тех изделий и приборов, которые разрешены к применению в медицинской практике в установленном порядке.

В системе лабораторной диагностики различают предварительные (качественные, скрининговые) и подтверждающие (в отношении алкоголя - количественные) методы исследования. Предварительные методы могут применяться сотрудниками ГИБДД для решения вопроса о необходимости направления на медицинское освидетельствование, в ходе которого, как правило, используются подтверждающие (количественные) методы исследования. Приказом Минздравсоцразвития России от 10.01.2006 г. №1 предварительные методы индикации наличия алкоголя в выдыхаемом воздухе, наряду с подтверждающими (количественными) методами, разрешены к использованию при проведении медицинского освидетельствования.

Медицинские изделия для скринингового (предварительного) определения алкоголя в выдыхаемом воздухе, разрешенные для медицинского применения

Набор трубок индикаторных для контроля трезвости

Метод основан на реакции окисления этанола бихроматом калия (K₂Cr₂O₇) в присутствии концентрированной серной кислоты, известной как реакция Раппопорта-Архангеловой. При окислении молекул этанола ионы хрома со степенью окисления -6 восстанавливаются до степени окисления -3, в связи с чем желтый или оранжевый цвет реагентов меняется на зеленый. Реактивами (раствор хромового ангидрида в концентрированной серной кислоте) импрегнированы гранулы силикагеля, засыпанного в запаянную стеклянную трубку с насечками с обоих концов. При использовании концы трубки обламываются в месте насечек и через нее освидетельствуемый продувает выдыхаемый воздух. Изменение цвета, соответствующее количеству содержащегося в выдыхаемом воздухе этанола, оценивается визуально. Метод удобен и прост в использовании (порог обнаружения составляет 0,2 ‰), однако обладает существенным недостатком - неизбирательностью, поскольку сходным с этанолом редуцирующим действием обладает большой круг веществ. Так, окраска реагентов изменяется на зеленую под действием помимо этанола метанола, эфиров, ацетона (что особенно важно, если испытуемый страдает диабетом), альдегидов, сероводорода, а при действии бензина, скипидара, уксусной кислоты, камфары, фенола, дихлорэтана реагент приобретает коричневую окраску, что не позволяет выявить наличие этанола. В связи этим большой процент результатов, полученных с помощью этого метода, оказывается ложноположительным или ложноотрицательным.

Сигнализатор пороговый паров этанола «Lion Alcoblow»

Принцип работы тот же, что и у цифровых приборов для количественного определения алкоголя в выдыхаемом воздухе, производимых фирмой «Lion», однако бесконтактный выдох обеспечивает в этом случае лишь предварительный качественный результат. Чувствительность (0,1 ‰) вполне достаточна для выявления даже факта употребления алкоголя, ложноположительные результаты отсутствуют. Удобен в работе, т.к. не требует сменных стерильных мундштуков.

Многие современные модификации цифровых приборов для количественного анализа имеют в качестве дополнительного режима скрининговый, основанный на бесконтактном выдохе и используемый в качестве предварительного. В случае положительной реакции прибор автоматически переходит в режим количественного анализа. Такая система тестирования позволяет экономить время и сменные мундштуки.

Приборы для измерения количества (концентрации) алкоголя, разрешенные к применению в медицинской практике

В настоящее время выпускаются приборы с тремя различными принципами детекции.

Полупроводниковая хемосорбция. При прохождении содержащего пары этанола воздуха через камеру детектора молекулы этанола адсорбируются чувствительным слоем детектора, в результате чего меняется его сопротивление и, следовательно, сила проходящего через этот слой электрического тока. Эти изменения прямо пропорциональны количеству молекул этанола, проходящих через детектор. Примером применения полупроводникового детектора является анализатор Alert J4X (Канада).

Электрохимическая детекция - основана на процессе окисления-восстановления молекул спиртов на платиновых электродах при прохождении через них электрического тока. Такие детекторы избирательны, поскольку реагируют только на спирты и не дают ложноположительных результатов с другими летучими соединениями, обладают высокой чувствительностью и надежностью. Электрохимические детекторы являются дорогостоящими, однако широко распространены в мире. Ими оснащены анализаторы серии Lion Alcometer (S-D2, SD-400, SD400P, 500) (Великобритания), серии Alcotest (Германия) и серии Alco-Sensor IV (США). В последнее время появилась также модификация прибора Alert J4Xec, который снабжен электрохимическим детектором.

Спектроскопия в инфракрасном свете (ИК-спектроскопия). Детектор включает источник ИК-излучения, фокусирующую линзу, узкополосные светофильтры, высокочувствительный фотоэлемент. Анализатор Lion Intoxilyzer 8000 (Великобритания) использует три длины волны: 3,80, 3,38 и 3,39 мкм; Lion Intoxilyzer 8000 - две: 3,4 и 9,36 мкм; прибор АКПЭ-1 (Фирма МЕТА, Жигулевск, Россия) - только одну (3,4 мкм).

Другой важнейшей характеристикой детектора является его чувствительность. Порог достоверно определяемой концентрации этанола указан в инструкциях к каждому прибору. Для подтверждения диагноза «алкогольное опьянение» низкий порог чувствительности прибора не обязателен, т.к., в большинстве случаев, клинические признаки опьянения появляются при концентрации этанола выше 0,5%, однако, для подтверждения факта употребления алкоголя, что предусмотрено при проведении медицинского освидетельствования в ряде случаев, не связанных с вождением транспорта, важно выявление более низких концентраций.

При этом следует иметь в виду, что у приборов Lion Alcometer и Lion Intoxilyzer пороговая концентрация этанола составляет 0,5 ‰.

Наконец, важнейшими характеристиками приборов являются их стабильность и линейность, т.е. прямая пропорциональность сигнала детектора количеству поступившего этанола во всем диапазоне измеряемых концентраций. Эти параметры характеризуются коэффициентом вариации. Высокие значения коэффициента вариации характерны для прибора Alert J4X.

Наиболее стабильные результаты обнаруживает прибор Lion Intoxilyzer, оснащенный собственной системой термостатирования. Вполне удовлетворительные результаты в отношении линейности и стабильности дают приборы с электрохимическим детектором - Lion Alcometer и Alco-Sensor IV.

Примечание: приведенные в настоящем разделе изделия медицинского назначения и методы не являются исчерпывающим списком разрешенных к применению приборов и методов.

Методики проведения исследований выдыхаемого воздуха и биологических жидкостей на алкоголь с помощью технических средств. Оценка результатов.

Факторы, влияющие на достоверность результатов (помимо характеристик детектора)

Соотношение концентраций кровь / воздух

Целесообразность определения этанола в выдыхаемом воздухе обусловлена наличием прямой пропорциональной зависимости между концентрациями этанола в крови альвеолярных капилляров и альвеолярном воздухе, т.к. молекулы этанола свободно диффундируют через клеточные мембраны по градиенту концентраций. Разность уровней этанола в крови и воздухе связана с разностью плотностей этих сред и является, следовательно, величиной постоянной, равной, как считается в большинстве стран мира, 2100.

Фаза выдоха

Из сказанного выше ясно, что именно в воздухе альвеол наступает равновесие уровня этанола с уровнем в крови. В воздухе верхних дыхательных путей содержание этанола тем меньше, чем больше расстояние от альвеол легких. Эмпирически установлено, чтобы подвергнуть анализу именно порцию легочного воздуха необходимо сбросить 5 объемов мертвого пространства, составляющего примерно 150 мл, т.е. первые 750 мл воздуха анализу не подвергаются. Все современные приборы оснащены измерительными датчиками, позволяющими оценивать объем проходящего через них воздуха, и автоматически включают процесс анализа лишь после сброса определенного объема воздуха из верхних дыхательных путей.

Этанол, адсорбированный в полости рта

Хорошо известно, что этанол, адсорбированный слизистой оболочкой ротовой полости, обуславливает завышение результатов анализа выдыхаемого воздуха (а также слюны) в течение 10 - 20 минут. С этим связано требование повтора анализа выдыхаемого воздуха через 20 минут. Наличие адсорбированного этанола может быть следствием не только употребления спиртных напитков, но и минимальных количеств спиртосодержащих лекарств, что иногда случается в условиях, предшествующих медицинскому освидетельствованию.

В первые 2 минуты после употребления алкоголя (в том числе спиртосодержащих лекарственных средств), концентрация этанола в выдыхаемом воздухе может достигать максимально высоких для измерительных приборов значений, что никак не коррелирует с опьянением. Некоторые модели современных анализаторов позволяют выявлять присутствие этанола, адсорбированного на слизистой ротовой полости, по крутизне нарастания уровня этанола по мере выдоха.

Интерпретация результатов анализа выдыхаемого воздуха при диагностике алкогольного опьянения

Как отмечено выше, состояние опьянения вызывается воздействием этанола на ЦНС и выраженность клинических симптомов опьянения прямо зависит от концентрации этанола в мозге. Уровень этанола в органах, интенсивно снабжаемых кровью (мозг, легкие, почки) в наибольшей степени соответствует его уровню в артериальной крови. С этой точки зрения анализ выдыхаемого воздуха, показывающий содержание этанола в крови альвеолярных капилляров, более информативен, чем непосредственный анализ доступной крови (венозной или капиллярной).

Следует иметь в виду, что все ориентировочные данные по концентрации этанола в крови, рассчитаны для венозной, а не артериальной крови. Артериально-венозное соотношение концентраций непостоянно и зависит от кинетической фазы этанола, во время которой происходит отбор биопроб. Выраженность клинической симптоматики благодаря эффекту повышенной толерантности также зависит от кинетической фазы. Кроме того, стресс (нередкое явление в условиях медицинского освидетельствования) часто маскирует клинические признаки опьянения.

Методы скрининга на наркотические средства и психотропные вещества. Их характеристика и оценка результатов.

Анализ психоактивных веществ имеет некоторые специфические особенности, его целью является установление факта их присутствия и (или) употребления, т.е. имеет место судебно-правовая направленность.

В соответствии с требованиями надежности, достоверности и доказательности, предъявляемыми к результатам анализов, лабораторное исследование при этом должно состоять из двух этапов - предварительного (или так называемого скринингового исследования) и подтверждающего.

Таким образом, лабораторное исследование на наличие психоактивных веществ состоит из двух этапов:

1) предварительный анализ - различными иммунохимическими методами, методом тонкослойной хроматографии;

2) подтверждающий анализ, чаще всего на основе хромато-масс - спектрометрии, реже - газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предварительные или скрининговые методы просты, не требуют сложной пробоподготовки, большого затрата времени. Их назначение - выявление отрицательных проб, которые исключаются из дальнейшего анализа. Положительные пробы подлежат дальнейшему исследованию с помощью подтверждающих методов.

В настоящее время наибольшее распространение в химико-токсикологическом анализе при скрининговых исследованиях получили иммунохроматографический анализ (ИХА) на тест-полосках, поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА) и иммуноферментный анализ (ИФА).

Современные иммунохимические методы отличаются высокой чувствительностью, простотой и экспрессностью исполнения, одновременно позволяют анализировать большое число проб, не требуя дополнительной или специальной очистки пробы или ее концентрирования и поэтому удобны для скрининг-диагностики.

При получении положительного результата, т.е. когда концентрация психоактивного вещества превышает пороговую, требуется провести дальнейшее исследование образца мочи подтверждающими альтернативными методами.

При отрицательном результате не требуется проведения дальнейшего исследования на анализируемое соединение или группу веществ.

1. Иммунохимические методы анализа.

Современные иммунохимические методы анализа основаны на конкуренции между антигеном в исследуемом образце и меченым антигеном за ограниченное число мест связывания на специфических антителах. Иммунохимические методы имеют ряд преимуществ перед физико-химическими методами: достаточно малое количество образца на анализ, быстрота и простота выполнения, высокая чувствительность, практически отсутствует стадия пробоподготовки.

Все пробы, поступающие в химико-токсикологическую лабораторию, должны подвергаться предварительному иммунохимическому исследованию на основные группы исследуемых веществ, - чаще всего опиаты, амфетамины, каннабиноиды. При этом используются соответствующие наборы реагентов. Кроме того, при необходимости и по возможности может проводиться исследование и на другие группы или вещества: бензодиазепины, барбитураты, метадон, кокаин, фенциклидин, экстази, трициклические антидепрессанты. Для анализа этих веществ выпускаются соответствующие тест-полоски и иммунохимические наборы реагентов для различных анализаторов.

Применение общедоступных тест-систем, получивших в последнее время широкое распространение для диагностики употребления психоактивных веществ, расширяет возможности скрининговых исследований в лабораторной практике.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) на тест-полосках

Достаточно большое распространение получил иммунохроматографический анализ, или так называемые тест-полоски, тест-системы, которые позволяют в течение 5-10 минут выявить прием психоактивных веществ и (или) их метаболитов в моче человека. На предварительном этапе такая быстрая и простая диагностика, не требующая дополнительного оборудования, реактивов и специальных навыков, может быть полезна в качестве вспомогательного скринингового метода. Тест-полоски не предназначены для определения количественного уровня психоактивных веществ в моче и не являются подтверждающим методом исследования.

Исследуемая моча за счет капиллярных сил мигрирует вдоль тест-полоски. При наличии в образце искомого психоактивного вещества или его метаболитов в концентрации, превышающей установленный для тест-полосок пороговый уровень, исследуемые соединения вступают в реакцию со специфическими антителами, мечеными частицами коллоидного золота, образуя комплекс антиген-антитело. Этот комплекс вступает в реакцию конкурентного связывания с антигеном, иммобилизованном в тест-зоне стрип-полоски, при этом образование цветной полосы окрашивания в тест-зоне не происходит. Такой результат расценивается как положительный.

При отсутствии искомого вещества или когда его концентрация меньше порогового значения, несвязанные меченые антитела связываются с иммобилизованным антигеном в тест-зоне стрип-полоски с образованием цветной полосы в этой зоне. Такой результат имеет отрицательное значение.

В контрольной зоне тест-полоски цветная полоса образуется всегда и служит контролем, что указывает на правильность проведения процедуры теста и работоспособность его компонентов.

Постановка анализа.

1. Все компоненты теста и образца мочи перед проведением анализа должны быть согреты до комнатной температуры.

2. Моча собирается в чистую сухую пластиковую или стеклянную посуду

3. Вскрывается упаковка тест-полоски вдоль прорези, не касаясь рабочей поверхности мембраны.

4. Извлекается полоска и погружается вертикально в мочу до уровня ограничительной линии на 30-60 сек.

5. Полоска извлекается из мочи и помещается на горизонтальную поверхность, через 5 минут определяется результат анализа.

Интерпретация результатов

Выявление двух полос розового цвета любой четкости и интенсивности окраски в тестовой и контрольной зоне свидетельствует, что в анализируемом образце мочи соответствующие искомые психоактивные вещества отсутствуют или их концентрация ниже порогового значения.

Выявление в контрольной зоне одной полосы розового цвета любой четкости и интенсивности и полное отсутствие второй полосы в тестовой зоне свидетельствует о наличии в анализируемом образце мочи соответствующего психоактивного вещества.

Если в течение 5 минут полосы не выявляются или появляется полоса на уровне тестовой зоны, результат не оценивается и тестирование повторяется с помощью новой тест-полоски.

Некоторые производители тест-полосок указывают о 100% достоверности анализа. Это не соответствует действительности, так как известны случаи получения ложноположительных результатов при применении тест-полосок.

Исходно иммунохроматографические тесты в медицинской диагностике предлагались ориентированными на минимальные манипуляции и качественную бесприборную регистрацию результатов как альтернативные сложным стационарным методам анализа.

При проведении скрининговых исследований с помощью тест-полосок необходимо четкое протоколирование результатов тестирования с отражением объективно регистрируемых данных. Объективизация оценки результатов исследования может быть обеспечена использованием отечественного рефлектометрического анализатора «Рефлеком» с программным обеспечением «Видеотест» для компьютера, в котором могут сохраняться регистрационные данные иммунохроматографического анализа. Использование фотометрической регистрирующей техники исключает при оценке результатов анализа элемент субъективности, позволяет сохранять результаты тестирования в виде как первичного документа (изображения тест-полоски), так и обработанных на компьютере данных, повышает производительность регистрации результатов анализа.

Иммунохроматографические экспресс-тесты (тест-полоски) выпускаются для выявления содержания в моче человека морфина (опиатов), амфетамина, метамфетамина, каннабиноидов, кокаина (бензоилэкгонина), метадона, фенциклидина, бензодиазепинов, барбитуратов, экстази, трициклических антидепрессантов. Выпускаются также мульти-тест-системы для одновременного выявления 2-х, 3-х, 5-и, 6-и видов психоактивных веществ.

Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА)

Одним из самых перспективных на сегодняшний день разновидностей иммуноанализа является его гомогенный вариант - количественный (полуколичественный) метод ПФИА, в основу которого положен принцип конкуренции определяемого антигена и антигена, меченого флуоресцентной меткой связывания с антителами. Образование иммунокомплекса устанавливается путем измерения поляризации флуоресценции, которая возрастает при связывании меченого антигена с антителами. Обнаружение исследуемой группы психоактивных веществ проводится на уровне установленной пороговой концентрации (Cut-off), т.е. достоверно определяе-мой концентрации. Количественное определение проводится суммарное (как нативных соединений, так и метаболитов) по отношению к концентрации вещества, используемого в качестве стандартного образца сравнения.

Метод ПФИА - это экспрессный, точный и легко воспроизводимый гомогенный иммуноанализ, коэффициент вариации обычно не превышает 3% и который по чувствительности лишь немногим уступает ИФА. Позволяет определять в течение нескольких минут концентрацию анализируемого вещества в объеме пробы от 50 до 100 мкл с пределом детекции 10-50 нг/мл и пороговой концентрацией 25-300 нг/мл. Анализ проводится в автоматическом режиме на ТДх, FLх-анализаторах фирмы «Abbott» (США).

Фирмой «Abbott» выпускается около 20 различных видов наборов для определения различных веществ и (или) их метаболитов в моче и сыворотке крови: опиаты, амфетамин / метамфетамин, каннабиноиды, кокаина метаболит (бензоилэкгонин), фенциклидин, метадон, барбитураты, бензодиазепины, трициклические антидепрессанты, нортриптилин, пропоксифен, фенобарбитал, амитриптилин, дезипрамин, имипрамин, карбамазепин, этанол.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

В нашей стране нашли применение гетерогенные методы ИФА, использующие для выявления образующих специфических иммунокомплексов меченые антитела и антивидовые антитела. В методе используются иммобилизованные (за счет сорбции) на поверхности твердых носителей антигены с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и выявлении образовавшихся иммунокомплексов.

Формирование иммуноспецифического комплекса проходит на твердой подложке. Преимущество твердофазного варианта ИФА - высокая специфичность и чувствительность, сопоставимая с хромато-масс-спектрометрией.

Детекция результатов исследования иммуноферментных методов проводится визуально или с использованием аппаратных комплексов для измерения оптической плотности растворов (вертикальные ридеры).

В настоящее время выпускаются готовые реагенты ИФА, позволяющие выявлять следующие основные вещества и группы веществ: опиаты, каннабиноиды, амфетамины, кокаин (бензоилэкгонин), бен-зодиазепины, фенобарбитал, фенциклидин, фентанил / триметилфентанил, клофелин.

Целесообразно применение таких ИФА тест-систем для анализа нетрадиционных биологических объектов: слюна, волосы, ногти.

2. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) в основном используется в качестве предварительного метода исследования, но может использоваться и как подтверждающий в сочетании с исследованием иммунохимическим методом.

Принцип ТСХ - физико-химические процессы, основанные на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества или группы веществ при перемещении их в составе подвижной фазы вдоль неподвижной фазы, в результате чего происходит формирование концентрационных зон веществ. При тонкослойной хроматографии несколько микролитров экстракта, полученного при пробоподготовке, помещается на линию старта пластинки (твердая подложка с нанесенным на нее тонким слоем сорбента). Хроматографическая пластинка помещается в герметически закрытую камеру, содержащую на дне смесь растворителей, называемой системой растворителей. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты анализируемой смеси, что и приводит к их разделению. Концентрационные зоны формируются в виде круглых пятен. Визуализация осуществляется путем обработки пластинки хромогенными реагентами. Идентификация компонентов смеси осуществляется сравнением длины пробега вещества (Rf) с таковым значением вещества сравнения («метчика»).

Основными достоинствами метода тонкослойной хроматографии являются универсальность хроматографической системы, возможность визуально оценить полученное разделение, а поскольку компоненты образца остаются в слое сорбента имеется возможность разделения многих образцов на одной пластинке, что обуславливает малую стоимость анализа. Имеются и некоторые недостатки: ограниченная разрешающая способность из-за малой протяженности разделяющего участка, недостаточная чувствительность определения, зависимость результатов от окружающей среды.

Результаты хроматографического исследования необходимо подтверждать другими методами или использовать по крайней мере 2 разных метода исследования, например, ПФИА и ИХА.

7. Направление на лабораторное (химико-токсикологическое) исследование

Направление проб мочи и других биологических объектов в химико-токсикологическую лабораторию регламентируется приказом Минздрава России от 14 июля 2003 года №308 «О медицинском освидетельствовании на состояние опьянения» с изменениями, внесенными в него приказом Минздравсоцразвития России от 10 января 2006 года №1, а также приказом Минздравсоцразвития России от 27 января 2006 года №40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ».

Среди рекомендуемых для ведение документов, следует назвать:

- «Журнал регистрации отбора биологических объектов» (учетная форма №450/у-06),

- Бланк «Направление на химико-токсикологические исследования» (учетная форма №452/у-06),

Порядок отбора, консервирования, маркировки биологических проб. Условия хранения и транспортировки.

Приложение №2 к приказу Минздравсоцразвития России от 27 января 2006 года №40 содержит рекомендации по организации работы по отбору, транспортировке и хранению биологических объектов для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов.

Поскольку это приложение в целом носит рекомендательный характер, то и нижеприведенные способы отбора биопроб обязательными для исполнения не являются.

В химико-токсикологическом анализе могут использоваться следующие биологические объекты: моча, кровь, слюна, волосы, ногти, потожировые выделения.

Биологический объект	Искомые средства (вещества)	Примечание
Моча	Наркотические средства, психотропные вещества и их метаболиты
	Алкоголь и его суррогаты
Кровь	Алкоголь и его суррогаты	Используется при ургентных состояниях
Слюна	Алкоголь и его суррогаты
Волосы	Наркотические средства, психотропные вещества	Возможно установление факта употребления в течение нескольких месяцев
Ногти	Наркотические средства, психотропные вещества	Возможно установление факта употребления в течение нескольких месяцев
Потожировые выделения	Наркотические средства, психотропные вещества

1. Рекомендации по отбору мочи.

Отбор мочи производится в условиях, исключающих возможность замены или фальсификации биологического объекта.

Моча собирается освидетельствуемым в стеклянный или пластмассовый градуированный сосуд с широким горлом объемом до 200 мл в количестве до 100 мл, но не менее 30 мл.

Для исключения факта подмены мочи желательно в течение первых 5 минут провести предварительное исследование мочи, включающее определение следующих показателей (или некоторых из них):

- температуры стеклянным ртутным термометром (в норме температура находится в пределах 32,5-37,7 ⁰С);

- рН с помощью универсальной индикаторной бумаги для определения рН мочи (в норме рН мочи в интервале 4-8 ед. рН);

- относительной плотности (в норме относительная плотность в пределах 1.008-1.025);

- содержания креатинина методом иммунной хроматографии - иммунохроматографическими тестами (в норме содержание креатинина 4,4-17,7 ммоль/сут).

Несоответствие указанных показателей их нормам, как правило, свидетельствует о подмене мочи.

После проведения предварительных исследований мочу делят на две части (1/3 и 2/3 общего объема) и помещают их в два стеклянных или пластмассовых герметично закрывающихся контейнера объемом 100 мл каждый. Первый контейнер с меньшим количеством мочи хранится как контрольный образец. Второй (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований.

Для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и других психоактивных веществ и их метаболитов моча с сопроводительной документацией доставляется в ХТЛ не позднее двух суток после отбора, до отправки в ХТЛ моча хранится в холодильнике при температуре 0 - минус 2 ⁰С.

2. Рекомендации по отбору крови.

Отбор крови у освидетельствуемого проводится на рабочем месте, которое оборудуется в соответствии с требованиями, предъявляемыми к оборудованию процедурного кабинета. Отбор крови проводится в резиновых перчатках, с соблюдением правил асептики, обработкой перчаток перед каждым отбором дезинфицирующим раствором, не содержащим спирт (раствор фурациллина или этакридина).

Перед проколом кожа освидетельствуемого обрабатывается стерильным тампоном (шариком из ваты), смоченным не содержащим спирт дезинфицирующим раствором.

Кровь для проведения химико-токсикологических исследований отбирается из поверхностной вены одним из следующих способов:

Самотеком в сухой флакон с раствором гепарина (3-5 капель на каждые 10 мл крови). Отбирается 15 мл крови в два флакона объемами 10 и 5 мл. Флаконы закрываются стандартной резиновой пробкой, которая фиксируется алюминиевым колпачком. Содержимое флаконов сразу же перемешивается встряхиванием. Флаконы опечатываются и направляются в ХТЛ для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и других психоактивных веществ, и их метаболитов. Флакон с 5 мл крови хранится как контрольный образец. Второй флакон с 10 мл крови (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований.

С использованием вакуумных пробирок (одноразовых устройств для ускоренного взятия крови с содержанием гепарина и иглами с двух концов). Игла одного из концов пробирки вводится в вену, иглой другого конца прокалывается резиновая мембрана пробирки. Отбирается 15 мл крови в две вакуумные пробирки по 5 мл и 10 мл (контрольный и анализируемый образцы), пробирки опечатываются. На практике наиболее удобно использование вакуумных пробирок на 2 мл с ЭДТА или гепарином в качестве антикоагулянтов. Объем крови 2 мл в каждой их 2-х таких пробирок вполне достаточен, так как на анализ алкоголя и его суррогатов обычно достаточно 0,25-0,5 мл крови. Для анализа алкоголя крайне важно, чтобы объем отобранной крови составлял не менее ѕ объема пробирки, а также ее герметичность. Для химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, других психоактивных веществ и их метаболитов обеспечивается доставка образцов крови в ХТЛ не позднее двух суток после отбора. Кровь после отбора до момента отправки в ХТЛ хранится в холодильнике при температуре 0 - минус 2 ⁰С.

3. Рекомендации по отбору жидкости полости рта.

Отбор жидкости полости рта (далее - слюна) проводится с использованием коллекторов, содержащих хлопковый тампон из стоматологической (хирургической) ваты. Хлопковый тампон, помещается под язык на 10 минут без стимуляции слюноотделения. После того, как тампон пропитается слюной, он помещается в коллектор, закрытый герметично пластмассовой пробкой, коллектор опечатывается и направляется с сопроводительной документацией в ХТЛ в специальном контейнере в сумке-холодильнике.

4. Рекомендации по отбору волос:

Волосы срезаются ближе к коже ножницами с закругленными концами отдельно с лобной, теменной, затылочной, правой и левой височных областей волосистой части головы. При невозможности отбора волос с волосистой части головы (облысение), волосы срезаются с подмышечных впадин или лобковой области.

Для проведения химико-токсикологических исследований отбирается не менее 300 мг волос. Отобранные образцы волос делятся на две равные части, заворачиваются в фольгу, каждая часть помещается в отдельный конверт с соответствующими надписями: контрольный и анализируемый образцы. Конверты опечатываются и хранятся в сухом месте при температуре плюс 20-25 ⁰С до отправки в ХТЛ.

5. Рекомендации по отбору ногтей.

Ногти обрезаются ножницами с закругленными концами с рук или ног ближе к коже. Отобранные образцы ногтей упаковываются и отправляются в ХТЛ аналогично образцам волос.

6. Рекомендации по отбору потожировых выделений.

Отбор смывов с поверхности кожи для проведения химико-токсикологических исследований на наличие каннабиноидов производится ватным тампоном, смоченным спиртом. Вес тампона - 400-500 мг при расходе этанола до 1 мл. Тампоном тщательно протираются поверхности рук и лица (главным образом вокруг рта), после чего тампон высушивается на воздухе. После высушенный тампон упаковывается в отдельный полиэтиленовый пакет. Все полученные пакеты с объектами помещаются в один общий конверт, который опечатывается.

Рекомендации по подготовке биологических объектов и документации к транспортировке в ХТЛ и их передаче в ХТЛ

Наиболее надежным средством опечатывания емкостей с биологическими пробами являются специальные самоклеющиеся учетные номерные этикетки, которые при отрывании разрушаются.

Этикетка крепится к флакону (пробирке, контейнеру и пр.) таким образом, что бы исключить возможность подмены содержимого флакона без нарушения целостности этикетки.

В ХТЛ осуществляется наружный осмотр целостности упаковки и соответствие биологических объектов их сопроводительной документации.

Контрольные образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ сразу же помещаются на хранение в холодильные шкафы и хранятся при температуре не менее минус 18 ⁰С. Срок хранения контрольного образца - 2 месяца со дня поступления в ХТЛ. Если в течение этого срока отсутствовала необходимость в повторных химико-токсикологических исследованиях, то по истечении 2-х месяцев контрольный образец биологического объекта уничтожается.

Анализируемые образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ хранятся в течение первых двух суток при температуре 0 - минус 2⁰С, далее до проведения исследования при минус 18 градусов С.

Ведение журнала регистрации учета направлений на химико - токсикологическое исследование

В Приложениях №5 и 6 к приказу Минздравсоцразвития России от 27 января 2006 года №40 соответственно приводится учетная форма №450/у-06 «Журнал регистрации отбора биологических объектов» и Инструкция по его заполнению.

Журнал рекомендуется вести в структурных подразделениях медицинских организаций, в которых проводится медицинское освидетельствование на состояние опьянения и (или) диагностика факта употребления алкоголя и его суррогатов, других психоактивных веществ, и их метаболитов.

Журнал пронумеровывается, прошнуровывается и скрепляется печатью медицинской организации.

Графы 1-13, 15 Журнала заполняются работником подразделения, производящего отбор биологического объекта.

Графы 4, 5 и 6 заполняются со слов освидетельствуемого. В графе 8 указывается предварительный диагноз, основанный на результатах медицинского осмотра освидетельствуемого. В случае, предусмотренном пунктом 12 Инструкции по проведению медицинского освидетельствования на состояние опьянение лица, которое управляет транспортным средством, и заполнению учетной формы 307/у-05 «Акт медицинского освидетельствования лица, которое управляет транспортным средством, утвержденной приказом Минздравсоцразвития России от 10 января 2006 года №1, предварительный диагноз может не указываться.

Графа 9 заполняется только в случае, если биологическим объектом является моча.

В графу 13 вносятся дополнительные сведения об освидетельствуемом: сведения о лекарствах или наркотических средствах, принятых освидетельствуемым за последние три дня; другая информация, которую сочтет нужным сообщить о себе освидетельствуемый.

8. Основные принципы аналитической диагностики ПАВ

Для анализа психоактивных веществ используются различные методы. Системный анализ предполагает использование предварительных и доказательных методов. Основные методы химико-токсикологического анализа приведены в разделе 3.3.

Краткая характеристика подтверждающих методов. Газовая хроматография / масс-спектрометрия (ГХ/МС)

Метод ГХ/МС является основным подтверждающим методом химико-токсикологического исследования. Этот метод, как наиболее информативный, высокоспецифичный, чувствительный и достаточно быстрый, получил широкое применение для идентификации неизвестных ядов, психоактивных веществ и (или) их метаболитов. Он незаменим при идентификации следовых количеств психоактивных веществ, а также для веществ, анализ которых другими подтверждающими методами невозможен или крайне затруднителен. Это особенно важно при обнаружении каннабиноидов, бензоилэкгонина и метилэкгонина (метаболитов кокаина), 6-моноацетилморфина (метаболита героина), фенциклидина, триметилфентанила, буторфанола (стадола), декстрометорфана, доксиламина (донормила), кетамина, коаксила, клофелина и многих других психоактивных веществ.

Надежность идентификации обеспечивается сочетанием в этом методе двух физико-химических методов: газо-жидкостная микроколоночная хроматография позволяет разделить и идентифицировать компоненты по временам удерживания, масс-спектрометр дает возможность получить индивидуальные масс-спектры вещества, его специфической характеристики, что является доказательством присутствия того или иного психоактивного вещества в биопробе.

Современная комбинированная система ГХ/МС позволяет проводить анализ одной сложной пробы из 30-50 и более веществ за 30-40 минут. За короткое время исследователь получает качественную и количественную информацию об анализируемой смеси. Полученный в результате анализа масс-спектр вещества может быть сопоставлен с масс-спектром из библиотеки спектров, хранящейся в базе данных. Система обработки данных позволяет сравнить стандартный спектр известного соединения с неизвестным спектром.

В химико-токсикологическом исследовании психоактивных веществ используется в основном ГХ/МС-система фирмы «Agilent techn.» с масс-селективным детектором Agilent 6850/5973N.

Масс-спектрометры выпускают только в комплекте с компьютером. Большую помощь при идентификации оказывает банк масс-спектральных данных, который заказчик получает вместе с прибором. По мере выполнения масс-спектрометрических анализов новые результаты непрерывно вводятся в память компьютера, пополняя банк данных.

Газовая хроматография.

Газовая хроматография - динамический метод разделения смеси веществ, основанный на многократно повторяющемся процессе перераспределения компонентов между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых является неподвижной, а другая - подвижной (газ).

Неподвижной фазой для газовой хроматографии может быть:

- твердый адсорбент;

- слой жидкости, нанесенный на поверхность твердого носителя.

Если неподвижная фаза твердый адсорбент, это вариант газоадсорб-ционной хроматографии, если в качестве неподвижной фазы используется слой жидкости, нанесенный на поверхность твердого носителя - это вариант газо-жидкостной хроматографии.

Наибольшее распространение в аналитических целях, в том числе в химико-токсикологическом анализе, имеет газо-жидкостная хроматография.

Принцип метода: в газо-жидкостной хроматографии компоненты разделяемой смеси перемещаются по колонке с потоком инертного газа (газ-носитель), разделяемая смесь распределяется между газом-носителем и неподвижной фазой, нанесенной на твердый носитель.

Вследствие специфических различий, зависящих от физико-химических свойств веществ, при движении через слой неподвижной фазы компоненты смеси при распределении между двумя фазами образуют отдельные полосы или зоны в газе-носителе, которые выносятся из колонки с потоком газа-носителя и регистрируются специальным устройством, называемом детектором, в виде сигналов, зависящих от времени их выхода.

Время выхода компонентов от момента ввода пробы до регистрации вершины пика дают качественную характеристику анализируемых веществ, площадь пика (или его высота) используется для количественной характеристики.

Основными преимуществами метода газо-жидкостной хроматографии являются:

- высокая разделительная способность, позволяющая анализировать сложные смеси;

- универсальность метода, огромное количество искомых веществ; - высокая чувствительность метода - возможное разделение для количественного анализа с высокой точностью 10^-8 - 10^-9 мг/мл;

- экспрессность - малое время анализа;

- высокая точность;

- возможность комбинирования с другими современными методами.

Детекторы предназначены для обнаружения и количественного определения выходящих из колонки в потоке газа-носителя компонентов анализируемой смеси в результате преобразования изменений физико-химических свойств газового потока в электрический сигнал. Современный хроматограф обычно снабжается несколькими детекторами, основными являются пламенно-ионизационный детектор, детектор по теплопроводности, детектор электронного захвата, термоионный и др.

Кабинеты медицинского освидетельствования на состояние опьянения (кабинеты экспертизы) наркологической клинической больницы №17 для исследования мочи на наличие алкоголя оснащены новыми малогабаритными газовыми хроматографами производства НИИХРОМ (Москва). Эти приборы удобны в эксплуатации, предназначены специально для алкилнитритного метода газовой хроматографии, имеют минимум настраиваемых узлов, что повышает их надежность и облегчает работу оператора. Использованные ранее регистраторы сигнала хроматографа заменены на компьютеры, снабженные преобразователями сигнала. Программа, установленная на компьютерах, производит автоматическую обработку принятых хроматограмм согласно рассчитанным на калибровке коэффициентам, что облегчает работу операторов.

Спектральные методы

Спектральные методы используют свойство молекул или атомов веществ поглощать или испускать излучения определенной длины волны. Характер спектра специфичен для каждого соединения, т.к. является его физико-химической характеристикой.

По физической природе используемого излучения выделяют следующие методы: фотоколориметрия, УФ-спектрофотометрия, в том числе с диодной матрицей, ИК-спектроскопия, атомно-адсорбционная спектроскопия, масс-спектрометрия, флуоресцентная спектрофотометрия и др.

Среди спектральных методов особо необходимо выделить масс-спектрометрию (МС), поскольку этот метод часто используется в качестве детектирующей системы для таких разделительных методов, как газожидкостная (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная (ВЭЖХ) хроматографии, атомно-адсорбционная спектрометрия (ААС). Методы ГХ/МС, ВЭЖХ/МС, ААС считаются наиболее надежными подтверждающими методами.

Хроматографические методы

Хроматографические методы часто используются в практике работы ХТЛ.

Хроматографию можно определить как физико-химические процессы, основанные на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества или группы веществ при перемещении их в составе подвижной фазы вдоль неподвижной фазы, в результате чего происходит формирование концентрационных зон веществ.

Газовая хроматография в анализе наркотических средств используется в своем газо-жидкостном варианте (ГЖХ), когда анализируемая смесь принудительно движется вдоль тонкой пленки жидкости, нанесенный на твердый носитель. В ХТА широко используются набивные стеклянные и металлические колонки.

Значительно эффективнее разделение происходит на капиллярных колонках. Детектирование в ГЖХ осуществляется самыми различными типами аналитических устройств, основанными на различных способах (физических принципах) фиксации веществ. Различают детекторы по теплопроводности (ДТП, катарометр), плазменно-ионизационный (ДИП), термоионный (ДТИ), детектор по захвату электронов (ДЭЗ), масс-селективный (МС) и др. Широкий выбор детекторов позволяет решать самые разнообразные задачи. Минимальный обнаруживаемый уровень колеблется от 400 пг/мл (катарометр) до 0,1 пг/мл (ДЭЗ).

ГЖХ является как качественным, так и количественным методом анализа. Количественный анализ может быть осуществлен методом абсолютной градуировки с использованием внешнего или внутреннего стандарта по измерению площади или высоты пика.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) существует в нескольких вариантах - нормально-фазовая (НФХ): жидкая неполярная фаза, состоящая из смеси неполярных растворителей, движется вдоль полярной неподвижной фазы - силикагеля; обращенно-фазовая (ОФХ): жидкая полярная фаза, состоящая из смеси воды и полярных растворителей, движется вдоль неполярной неподвижной фазы - модифицированного силикагеля с химически привитыми углеродными цепями или другими привитыми группами; ионообменная хроматография (ИОХ): полярная подвижная фаза движется вдоль неподвижной фазы, состоящей из катионо-обменной или анионо-обменной смолы; существуют и другие разновидности ВЭЖХ.

Основное преимущество ВЭЖХ перед другими хроматографическими методами состоит в том, что разделение происходит при комнатной температуре, в отличие, например, от ГЖХ, где анализируемую смесь необходимо с помощью нагревания переводить в газообразное состояние, что может привести к термодеструкции некоторых термолабильных веществ. Автоматизированная система ВЭЖХ Remedi при анализе биожидкостей может принять на себя функции пробоподготовки, очистки, концентрирования образца и хроматографического разделения, что позволяет непосредственно вводить в прибор пробу биожидкости.

Широкий набор детекторов - УФ, химический, ИК и, особенно МС, делает ВЭЖХ надежным методом качественного и количественного обнаружения психоактивных веществ.

ТСХ

Метод тонкослойной хроматографии является неспецифичным, недостаточно селективным для идентификации психоактивных веществ, мало чувствительным, хотя и позволяет предположительно идентифицировать конкретные соединения.

Исследование методом тонкослойной хроматографии не позволяет обнаружить все имеющиеся группы наркотических средств, выявить новые, еще мало изученные психоактивные вещества, ассортимент которых может меняться очень быстро. Так, например, ТСХ не выявляет кокаин, ЛСД, клофелин, декстрометарфан, оксибутират натрия, доксиламин.

Кроме того, чувствительность этого метода в 50 и более раз ниже, чем подтверждающего хромато-масс-спектрометрического анализа, из-за чего низкие концентрации искомых веществ не идентифицируются.

Подробное описание метода ТСХ дано в разделе 3.2.

Интерпретация результатов химико-токсикологических исследований

Интерпретация результатов химико-токсикологических исследований представляет зачастую сложную задачу. Это связано со следующими моментами:

- об употреблении того или иного психоактивного вещества может свидетельствовать присутствие метаболитов, которые могут быть одинаковыми у разных веществ, а исходное соединение может обнаруживаться в очень низких количествах или вообще отсутствовать;

- отрицательный результат может быть следствием того, что проба была взята слишком поздно после приема наркотика;

- пороговая чувствительность метода исследования может превышать порог возможного выявления вещества;

- состав пробы может быть изменен, фальсифицирован при заборе;

- иногда невозможно отличить запрещенные к легальному обороту соединения и разрешенные лекарственные средства из-за схожести структуры веществ и т.д.

При интерпретации полученных данных необходимо учитывать время введения (употребления) психоактивного вещества, кинетику его распределения, способ введения (внутривенно, перорально, ингаляционно), дозу, частоту приема. Хотя такую информацию не всегда удается собрать, можно высказать следующие положения:

1. Чем выше введенная доза, тем больше вероятность обнаружения. Высокие дозы обычно дают более высокие концентрации в плазме и моче.

2. Выведение наркотиков в моче зависит от объема мочи и ее рН.

3. Разные вещества сохраняется в организме разное время. Так, обычная доза кокаина может быть детектирована в течение дня и менее, поэтому отбор пробы мочи должен производиться как можно быстрее после приема наркотика. Ежедневное употребление кокаина в течение длительного периода позволяет детектировать его употребление в течение двух-трех дней после окончания употребления. Чем чаще прием психоактивных веществ, тем больше вероятность их обнаружения.

Компоненты гашиша медленно выводятся из организма и могут быть детектированы в течение нескольких дней после последнего приема, поэтому время отбора мочи не имеет решающего значения.

4. Окончательный вывод о присутствии / отсутствии психоактивного вещества должен быть сделан на основе оценки правильности использования предварительных и подтверждающих методов.

Проводящий исследование специалист должен знать и учитывать практически все возможные случаи, затрудняющие интерпретацию результатов исследования, пределы возможности используемых для ХТА методов.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты анализов.

При исследовании предварительными (скрининговыми) методами могут быть получены ложноположительные и ложноотрицательные результаты на определяемое вещество или группу веществ.

Ложноотрицательные результаты могут быть в случаях, когда пороговая чувствительность метода исследования превышает порог возможного выявления веществ; когда измененный состав пробы или эндогенные ее компоненты маскируют наличие определяемого психоактивного вещества в процессе проведения анализа пробы. Например, прием аспирина внутрь и его наличие в моче могут искажать результаты иммунохимического анализа и потенциально приводить к ложноотрицательным результатам скринингового анализа на содержание психоактивных веществ.

В лабораторных условиях результат считается ложноположительным в том случае, если при анализе биологической пробы, в которой не содержится искомое вещество, получен положительный ответ. Результаты лабораторного исследования могут искажаться вследствие артефактов или из-за наличия соединений со сходной с определяемым веществом химической структурой, как правило, это бывает при низкой специфичности метода.

Неправильная клиническая интерпретация данных скринингового иммуннохимического анализа - распространенный источник получения ложноотрицательных результатов. Данные иммунного анализа, как измерительной методики, обычно в наибольшей степени подвержены искажениям под воздействием соединений, сходных по химической структуре с определяемым веществом, поскольку с помощью этого исследования, как правило, распознаются психоактивные вещества, принадлежащие к одному классу, а также их метаболиты. Например, положительный результат анализа на наличие опиатов может указывать на присутствие различного количества опиатоподобных веществ; псевдоэфедрин структурно сходен с амфетамином и т.п.