Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПРЕДИСЛОВИЕ

Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды, биохимия пищеварения, обмен углеводов, белков, молекулярной патологии и особенно в разделе исследований биологических жидкостей.

Практикум содержит лабораторные работы разной степени сложности, позволяющие студентам приобрести навыки самостоятельного биохимического анализа материала. Ряд работ можно использовать при проведении студентами учебно-исследовательской и научной работы.

Каждый раздел имеет краткое введение и ссылки на учебник Е.А.Строева «Биологическая химия».

В начале каждой работы приведен перечень реактивов, оборудования и материалов, требуемых для ее выполнения. Прописи приготовления некоторых многокомпонентных реактивов, буферных растворов и перечень биохимических констант вынесены в приложение.

В практикуме представлено значительное число унифицированных методов, применяемых в клинике для диагностики заболеваний, приведены скрининг-тесты, для выявления молекулярных болезней, биохимические методы анализа лекарственного растительного сырья и биогенных препаратов. Кроме того, при описании лабораторных работ кратко излагается практическое использование данного метода в медицинской, фармацевтической и биохимических исследованиях.

При переработке практикума авторы руководствовались опытом преподавания биохимии на лечебном, фармацевтическом факультетах Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова.

ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

Биохимические исследования проводятся для получения информации о многочисленных химических и физико-химических процессах, протекающих в клетках и тканях живых организмов в норме и при патологии.

В зависимости от цели исследования используются специальные приемы обработки биологического материала и соответствующие физико-химические методы, которыми студенты овладевают при выполнении биохимического практикума. Однако прежде чем приступить к изучению конкретных методик исследования, необходимо познакомиться с некоторыми общими положениями и приемами практической биохимии.

I. Материал и его подготовка для биохимических исследований

Объект биохимических исследований. В экспериментальных условиях можно получить любой биологический материал для биохимических исследований. В клинике такие возможности ограничены. Для клинико-биохимических анализов используют:

а) биологические жидкости внутренних сред организма - плазму (или сыворотку) крови, спинно-мозговую жидкость, лимфу, амниотическую, внутрисуставную и внутриглазную жидкости, а также эксудат и транссудат;

б) биологические выделения (экскреты) - мочу, желчь, слюну, желудочный и кишечный соки, кал, пот, слезную жидкость, женское молоко и молозиво, семенную жидкость, слизистые выделения.

Получение этих жидкостей и экскретов относительно несложно и безвредно. В то же время изучение биохимических процессов непосредственно в клетках, тканях и органах человека сопряжено с большими трудностями. Прижизненное взятие кусочков тканей и органов - биопсия - осуществляется во время операции или с помощью специального инструментария, что позволяет получить материал для исследований - биоптат. Ввиду сложности, а порой и небезвредности получения биоптатов их используют для биохимических анализов в клинике относительно редко. Лишь клетки крови, процедура получения которых проста, все чаще служат объектом обстоятельных клинико-биохимических лабораторных исследований. В судебно-медицинских целях и для более обстоятельного изучения причин и исхода болезни проводятся посмертные биохимические анализы тканей и органов.

Объектом биохимических исследований в фармацевтической практике служит биологический материал животных и сами лекарственные препараты. Взятие для анализа биологического материала экспериментальных животных используется при стандартизации и контроле качества лекарств. Например, по концентрации глюкозы в крови проводится стандартизация и контроль качества препаратов инсулина. В то же время анализ таких биологических препаратов, как ферментные, проводится только биохимическими методами.

Получение и хранение проб для биохимических исследований. Точность биохимического анализа зависит от правильного отбора и при необходимости хранения проб биологического материала. Остановимся на ряде общих положений этого раздела.

Моча чаще всего исследуется в клинико-биохимических лабораториях. Для этой цели, как правило, собирают в стеклянную или полиэтиленовую бутыль суточную мочу (для специальных случаев собирают ее порционно) и хранят в холодильнике. Иногда анализируют отдельно ночную и дневную порции мочи. Бактериальные загрязнения обычно мало влияют на результаты исследования мочи, но если необходимо задержать рост микроорганизмов, то добавляют консервант, например, толуол. При некоторых специальных исследованиях, например, при определении стероидных гормонов и их метаболитов, в мочу добавляют концентрированную HCl (из расчета 10мл на 1 л мочи) и т.д. При определении ферментов целесообразно проводить анализ свежевыпущенной мочи.

Для сбора мочи у мелких лабораторных животных (белые крысы или мыши) их помещают в стеклянные выделительные воронки (рис.1), обычно на 12 или 24 ч. Моча через стеклянную воронку для фильтрования, в отверстие которой вставлен стеклянный «гвоздик» (для задержки фекалий), стекает в мерный цилиндр.

Кровь для исследования берут утром натощак.

Капиллярную кровь получают чаще всего из пальца руки, у маленьких детей ее берут путем прокола мочки уха, большого пальца ноги или пятки. На лабораторных занятиях обычно используется для биохимических исследований капиллярная кровь.

Техника взятия крови из пальца для лабораторного анализа. Как правило, кровь берут из безымянного пальца левой руки. Если по каким-то причинам это сделать невозможно, то ее получают из любого другого пальца. Сначала участок кожи пальца обследуемого очищают ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, а затем эфиром. Левой рукой захватывают безымянный палец левой руки обследуемого и слегка сдавливают мякоть пальца в месте предполагаемого укола. Наиболее удобно делать укол в мякоть пальца слева от срединной линии, несколько отступя от ногтя. Прокол кожи производят стерильной иглой одноразового пользования, причем иглу располагают строго перпендикулярно относительно места укола и вводят почти на всю длину ее острия, рассекая кожу поперек папиллярных линий (это способствует большему зиянию ранки и более длительному кровотечению). Появившуюся каплю крови удаляют ватным тампоном. Затем кровь, свободно выделяющуюся из ранки или после легкого надавливания на мякоть пальца, берут для анализа с помощью микропипетки, обычно предварительно смоченной антикоагулянтом (противосвертывающим веществом). Кончиком микропипетки следует касаться капель выступающей крови, избегая попадания в нее пузырьков воздуха. Кончик микропипетки, куда забирают кровь, должен располагаться несколько выше, чем другой ее конец, что помогает лучшему поступлению крови в микропипетку. После того как кровь будет взята, к ранке прикладывают ватный тампон, смоченный настойкой иода, и прижимают палец к ладони до остановки кровотечения.

Для получения большого количества крови ее берут из локтевой вены (у маленьких детей из подкожных вен головы) обязательно с соблюдением необходимых мер предосторожности. В зависимости от целей биохимическому исследованию может подвергаться цельная кровь или ее составные части - форменные элементы (клетки), плазма или сыворотка. Если для анализа необходимы плазма и клетки крови, то взятую из вены кровь смешивают в пробирке с подходящим антикоагулянтом, который предотвращает ее свертывание. В качестве антикоагулянта обычно используют раствор оксалата или цитрата натрия (концентрации 0,1 моль/л), который связывает ионы кальция в крови и не дает ей свернуться. В тех же целях применяется и гепарин, которого добавляют около 2 мг на 10 лмл крови. Благодаря большому отрицательному заряду он взаимодействует с белками, участвующими в свертывании крови, и препятствует образованию сгустка. Взятую цельную кровь с добавлением антикоагулянтов используют для получения плазмы и форменных элементов путем центрифугирования.

Для получения сыворотки кровь собирают в сухую пробирку без антикоагулянта и оставляют свертываться, помещая пробирку в холодильник на ночь. Выделившуюся после образования сгустка сыворотку отсасывают пипеткой и используют для анализа. Сыворотка отличается от плазмы тем, что в ней отсутствуют фибриноген и другие белки крови, участвующие в ее свертывании и вошедшие в сгусток. Взятую кровь хранят в холодильнике.

Другие биологические жидкости и экскреты берут, как правило, с помощью специального инструментария и хранят в холодильнике.

Биоптаты получают с помощью скальпеля или специальных игл для биопсии, или с помощью специальной эндоскопической техники, снабженной инструментом для взятия кусочков ткани. Хранить ткани можно в замороженном состоянии при -20С. Перед исследованием их размораживают.

Обработка биологического материала. В зависимости от вида биохимического исследования полученный биологический материал обычно подвергают предварительной обработке. Как правило, при проведении исследования требуется определить содержание какого-нибудь нормального или патологического компонента в биологическом материале или изучить отдельные биохимические реакции, катализируемые ферментами.

Плазма или сыворотка крови и другие биологические жидкости (включая экскреты) представляют собой смесь различных природных веществ, растворенных в водной среде. При определении ферментов биологическую жидкость используют для исследования целиком, не подвергая какой-либо обработке. Лишь при высокой концентрации фермента в средах их перед определением разводят. В то же время присутствие ферментов часто мешает определению в биологических жидкостях тех веществ, превращение которых они катализируют. Поэтому полученный материал сразу обрабатывают реактивом, прекращающим действие ферментов, и осаждающим как ферментные, так и любые другие белки. Для осаждения используют трихлоруксусную, хлорную, азотную, фосфорно-вольфрамовую, серную и другие кислоты, гидроксид бария с сульфатом цинка или просто термическую обработку биологического материала.

При биохимическом исследовании клеток, тканей и органов приемы их обработки усложняются, поскольку изучаемый компонент может быть локализован в каком-либо органоиде или даже его части, например, в мембране. Поэтому сначала клетки или ткань подвергают разрушению различными способами. Чаще всего применяют механическое разрушение ткани с помощью гомогенизатора. Он представляет собой стеклянный стакан, форма которого и размеры могут быть различны. В этот стакан помещают кусочек ткани, измельченный ножницами, и соответствующую жидкую среду (обычно раствор сахарозы, хлорида калия), позволяющую сохранить интактность выделяемых структурных образований клетки.

Растирание ткани осуществляется при движении вверх и вниз вращающегося в стакане гомогенизатора пестика, который соединен через привод с осью электромоторчика. На время гомогенизации стакан гомогенизатора помещают в лед, чтобы избежать нагревания и повреждения субклеточных структур.

В простейшем случае гомогенат получают, растирая ткань с толченым стеклом или кварцевым песком в фарфоровой ступке.

Возможно также разрушение ткани и клеток высокочастотными ультразвуковыми колебаниями и с помощью «осмотического шока». Последний метод используют при разрушении эритроцитов и других клеток крови. Он заключается в том, что при добавлении дистиллированной воды мембрана клеток разрывается от избыточного внутриклеточного осмотического давления.

Гомогенизация ткани и разрушение клеток - стадия обработки, предшествующая разделению клеточных компонентов.

2. Основные методы разделения и выделения веществ при биохимиеских иследованиях

Гомогенаты представляют собой сложную смесь частиц, отличающихся по размеру, форме и химическому составу. Для разделения и выделения этих частиц, а также молекул, содержащихся в биологическом материале, используются различные методы, которые суммированы в табл.1.

Таблица 1. Основные методы разделения и выделения веществ, применяемые при биохимических исследованиях (по В.В.Меньшикову, с дополнениями)

Свойство, используемое для разделения	Методы разделения и выделения
Различие температур перехода	1.Перегонка (дистилляция)
веществ из одного состояния в другое	2.Микродиффузия (изотермическая дистилляция)
	3.Озоление
	4.Выпаривание (высушивание)
	5.Лиофилизация
Различие растворимости веществ	6.Экстракция
	7.Противоточное распределение
	8.Фракционное осаждение (по видам осаждающих агентов и средств):
	8.1.Нейтральными солями (высаливание)
	8.2.Кислотами
	8.3.Гидрофильными органическими растворителями
	8.4.Водорастворимыми недиссоциирующими высокомолекулярными полимерами
	8.5.Тяжелыми металлами и их гидроксидами
	8.6.Органическими катионами
	8.7.Анионами и полианионами
	8.8.Иммунопреципитацией
Различие скорости седиментации	9.Седиментационный анализ:
(осаждения)	9.1.Центрифугирование
	9.2.Ультрацентрифугирование
Различие в размерах молекул	10.Диализ:
	10.1.При равном давлении
	10.2.При повышенном давлении
	10.3.При пониженном давлении (ультрафильтрация)
	10.4.Электродиализ
Различие распределения между подвижной и неподвижной фазами, основанное на неодинаковой растворимости, сорбируемости,	11.Хроматография (по технике осуществления подразделяется на колоночную, тонкослойную и бумажную):
на разнице в значениях электрического заряда, в размерах молекул	11.1.Адсорбционная (жидкостно-адсорбционная, ионообменная, газо-адсорбционная)
	11.2.Распределительная (жидкостно-жидкостная, газо-жидкостная)
	11.3.Гель-хроматография и гель-фильтрация
	11.4.Аффинная (биоспецифическая) хроматография
Различие в электрическом заряде молекул	12.Электрофорез:
	12.1.Свободный
	12.2.На носителях: а) на бумаге (простой и высоковольтный) б) на гелях (агар, агароза, крахмал, полиакриламид) в) на пленке (ацетилцеллюлоза)
	13.Комбинированный электрофорез:
	13.1.Электрофорез+иммунодиффузия (иммуноэлектрофорез)
	13.2.Электрофорез+хроматография (техника «отпечатков пальцев»)
Различие в электрическом заряде молекул при определенном рН	14.Изоэлектрическое фокусирование в градиенте рН:
	14.1.Свободное
	14.2.Зональное
	14.3.В геле
	14.4.Иммуноэлектрофокусирование

3. Основные приборы, используемые в практикуме

При проведении биохимических исследований используются различные приборы и оборудование, позволяющие выделить изучаемое вещество и определить его содержание в биологическом материале.

Фотометрические приборы

Фотометрия (абсорбциометрия) - метод качественного и количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока.

Светопоглощение или экстинкция, согласно закону фотометрии Ламберта-Бугера-Бера прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту экстинкции (Е). Последний представляет собой поглощение раствора вещества концентрацией 1моль/л, помещенного в кювету с толщиной слоя 1см, и измеряется в л·моль-1·см-1.

Рис. 1. Общий вид колориметра фотоэлектрического концентрационного

1 - гальваномер; 2 - крышка кюветного отделения; 3 - ручка установки «грубо»; 4 - ручка установки «точно»; 5 - ручка чувствительности; 6 - ручка кюветодержателя; 7 - переключатель светофильров.

Часто используют и другой показатель - удельный коэффициент экстинкции Е1см1%, т.е. поглощение света 1%-ным раствором вещества в кювете с толщиной слоя 1см. Для определения содержания какого-либо компонента биологического материала строят калибровочный график, отражающий зависимость между экстинкцией (Е) и концентрацией (С) этого вещества в растворе и представляющий собой прямую линию в прямоугольной системе координат.

Для фотометрического анализа используют фотоэлектроколориметры, фотоэлектроколориметры-нефелометры и спектрофотометры.

Фотоэлектроколориметры (ФЭК) различных моделей применяют для анализа светопоглощения окрашенных растворов веществ в видимой области спектра (рис.1).

Фотоэлектроколориметры-нефелометры применяют для измерения интенсивности светорассеивания или ослабления светового потока изучаемых веществ в мутных средах.

Колориметр фотоэлектрический концентрационный позволяет благодаря большому набору узкополосных светофильтров проводить измерения в определенной области спектра в диапазоне длин волн 315-980 нм. Этот прибор используют для определения светопоглощения веществ, а также коэффициент пропускания рассеивающих взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. Порядок работы изложен в инструкции.

Рис. 2. Общий вид спектрофотометра

Спектрофотометры (рис.2) используют для изучения строения, качественного и количественного анализа вещества по интенсивности поглощения его в монохроматическом свете. В клинико-биохимических и научных исследованиях широко применяются спектрофотометры СФ-16, СФ-26, СФ-46 и их современные модификации, работающие в области спектра от 186 до 1100 нм.

Правила работы на спектрофотометре изложены в инструкциях к прибору.

Флуориметрические приборы

Для качественного и количественного анализа веществ, которые, поглощая энергию, способны к люминисценции (флуоресценции) применяются флуороскопы и флуориметры.

Флуороскоп позволяет проводить полуколичественный анализ путем визуального сравнения интенсивности флуоресценции опытного раствора со стандартным, где концентрация вещества известна.

Флуориметры позволяют проводить количественный анализ. В этих приборах выделение области спектра, необходимого для возбуждения данного вещества, осуществляется первичными светофильтрами, а пропускание характерного для него участка излучения (свечения) - с помощью вторичных светофильтров.

Центрифуги

Центрифугирование - метод разделения смеси компонентов жидких сред под действием центробежной силы. Его используют для отделения форменных элементов крови от плазмы, для осаждения и выделения клеток из мочи, спинно-мозговой жидкости и других сред организма, а также для отделения осадков от жидкой фазы (надосадочная жидкость, или супернатант). В клинико-биохимических лабораториях для этой цели используют малогабаритные центрифуги общего назначения. Они дают максимальную скорость около 6000 об·мин-1.

Для специальных биохимических исследований применяют ультрацентрифуги с охлаждением (рефрижераторные), например ЦР-2-25, УЦП-1-75 и др. Они позволяют проводить дифференциальное центрифугирование, т.е. разделение частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью.

Скорость осаждения частиц определяется центробежным ускорением, которое обычно выражают в единицах g (гравитационная постоянная, равная 980 см·с-2). Величину g обозначают как относительное центробежное ускорение. Она зависит от скорости вращения ротора (п, об·мин-1) и расстояния (r, см) от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке и определяется по формуле

g = 1,11•10-5n2r

На практике g устанавливают по номограмме, прилагаемой к инструкции для каждой ультрацентрифуги. С помощью дифференциального центрифугирования выделяют субклеточные частицы - ядра, митохондрии, лизосомы, микросомы и др.

Приборы для электрофореза

Электрофорез - метод разделения заряженных частиц под действием внешнего электрического поля. Электрофорез проводят в специальных аппаратах разной конструкции (рис.3). Поддерживающий материал располагается в них на лотках, специальных кюветах, стеклянных трубочках, стеклах и может находиться в горизонтальном (горизонтальный электрофорез) или вертикальном (вертикальный электрофорез) положении. Для электрофоретического разделения используют пористый поддерживающий материал (фильтровальная бумага, ацетилцеллюлоза), различные гели (агар, крахмал, полиакриламид, декстран) и т.д. Перед помещением в камеру аппарата для электрофореза бумагу смачивают буферным раствором, а гель заранее готовят на нем. Смесь веществ, наносимая микропипетками на горизонтально расположенный материал или на столбик геля, разделяется при электрофорезе на фракции. Условия электрофореза зависят от целей разделения и подбираются заранее.

Рис. 3. Прибор (а) и камера (б) для электрофореза:

1 - верхняя камера; 2 - нижняя камера; 3 - уплотнительные кольца;

4 - трубочка с гелем; 5 - анод; 6 - катод

Электрофореграммы фиксируют, окрашивают специальными красителями для выявления локализации на них разделенных веществ. Если вещество флуоресцирует, то его положение устанавливают при просмотре фореграммы в ультрафиолетовом свете. Количественное определение производят по содержанию красителя, связавшегося с разными фракциями веществ на электрофореграмме, или путем прямого измерения светопоглощения этих зон на специальных приборах - денситометрах.

4. Применение единиц СИ для выражения результатов клинико-биохимических исследований

Общие положения

В биохимии и клинической химии используются основные и производные единицы СИ.

Основные единицы СИ. К основным единицам относятся семь единиц СИ: метр, килограмм, секунда, моль, ампер, кельвин и кандела (табл.2).

Таблица 2. Основные единицы СИ.

Величина	Наименование единицы	Обозначение единицы
Длина	Метр	м
Масса	Килограмм	кг
Время	Секунда	с
Количество вещества	Моль	моль
Термодинамическая температура	Кельвин	К
Сила света	Кандела	кд

Первые четыре из них широко применяются в клинической химии.

Производные единицы СИ представляют собой сочетание основных единиц (табл.3). Например, производной единицей является скорость химической (ферментативной) реакции. Так, активность фермента выражается в единицах количества вещества, превращенного (имеется в виду убыль субстрата или накопление продукта реакции) в единицу времени.

Таблица 3. Производные единицы СИ

Величина	Наименование единицы	Обозначение единицы
Площадь	Квадратный метр	м2
Объем, вместимость	Кубический метр	м3
Давление (парциальное осмотическое)	Паскаль	Па
Плотность	Килограмм на кубический метр	кг/м3
Массовая концентрация компонента	Килограмм на кубический метр	кг/м3
Молярная концентрация компонента	Моль на кубический метр	моль/м3
Активность компонента	Моль превращенного вещества в секунду	моль/с
Скорость химической (ферментативной) реакции	Моль превращенного вещества в секунду на кубический метр	моль/(с·м3)

Кратные и дольные значения единиц СИ. Довольно часто выражение результатов клинико-биохимических исследований в единицах СИ оказывается неудобным, потому что получаемые значения бывают либо очень малы, либо велики. Для этого система СИ предусматривает использование кратных и дольных значений единиц СИ. Их названия образуют от исходных названий единиц СИ, добавляя к ним соответствующие приставки (табл.4). Например, одна тысячная доля моля (10-3 моль) называется миллимоль и обозначается ммоль.

Единицы, допустимые к применению наравне с единицами СИ. Некоторые единицы хотя и не относятся к единицам СИ, но используются наравне с ними. Из них для выражения результатов биохимических исследований особенно важны единица объема - литр (л) и единицы времени - минута (мин), час (ч), сутки (сут), которые используются при выражении результатов биохимических исследований.

Таблица 4. Множители и приставки, применяемые для обозначения десятичных кратных и дольных единиц СИ

Множитель	Приставка	Обозначение приставки (символ)	Множитель	Приставка	Обозначение приставки (символ)
1012	гера	Т	10-3	милли	м
109	гига	Г	10-6	микро	мк
106	мега	М	10-9	нано	н
103	кило	к	10-12	пико	п
10-1	деци	д	10-15	фемто	ф
10-2	санти	с

Некоторые рекомендации по применению единиц СИ в клинико биохимических исследованиях

Выражение концентрации вещества. Концентрацию веществ, молекулярная масса которых известна (например, концентрацию глюкозы, мочевины, мочевой кислоты в биологических жидкостях), выражают в единицах молярной, но не массовой концентрации (т.е. в молях на литр или в дольных единицах - миллимоль на литр, микромоль на литр и т.д.).

Вещества, у которых не установлена или точно не известна молекулярная масса, выражаются в единицах массовой концентрации или в массовых долях. Так, массовая концентрация может быть выражена в кг/л, г/л, мг/л, мкг/л и т.д. В этих единицах выражаются результаты определения содержания белков (альбумин, фибриноген, общий белок, гаптоглобин), общих липидов, так называемого сахара (под которым понимается сумма восстанавливающих моно- и дисахаридов) и других компонентов в биологических жидкостях (плазме крови, спинно-мозговой жидкости, моче и др.). Хотя для некоторых белков плазмы крови, например, для гаптоглобина, церулоплазмина, альбумина, известна относительная молекулярная масса, тем не менее пока сохраняется правило выражать содержание всех белков в единицах концентрации (по массе) или в массовых долях. Содержание гемоглобина, согласно рекомендации международного комитета по стандартизации в гематологии, также пока выражают не в миллимолях на литр (ммоль/л), а в граммах на литр (г/л).

Содержание веществ в тканях. При биохимических исследованиях в клинике требуется иногда определить содержание тех или иных веществ в биоптатах. Результаты определения также выражаются в единицах массы (если молекулярная масса неизвестна) и в молях (если молекулярная масса известна) в расчете на 1 кг сырой или высушенной ткани, т.е. в г/кг, мг/кг, мкг/кг или в моль/кг, ммоль/кг, мкмоль/кг.

Не рекомендуется:

а) выражать результаты на единицы объема, дольные от литра: на миллилитр, микролитр и т.д., а также на единицы массы, дольные от килограмма: грамм, миллиграмм и т.д., т.е. нельзя использовать такие единицы, как мг/мл, мкг/мл или мг/г, мкг/г и т.д.;

б) использовать понятие «миллиграмм-процент» для выражения концентрации веществ, поскольку оно отражает отношение разнородных величин;

в) применять качественную или полуколичественную оценку результатов знаками «+» или «-» (в некоторых случаях, например, при оценке проб на коллоидную устойчивость белков плазмы - проба Вельтмана, тимоловая проба, можно пользоваться числовыми значениями: 0, 1, 2, 3 и т.д.).

Концентрация ионов водорода. Концентрацию ионов водорода в биологических жидкостях можно выражать двояко: через молярную концентрацию веществ (моль/л) или через шкалу рН.

Парциальное давление газов. При исследовании парциального давления газов, например ро2 и рсо2, в крови следует выражать результаты в килопаскалях (кПа). При исследовании кислотно-щелочного равновесия парциальное давление газов тоже должно выражаться в кПа.

Результаты анализа мочи. Содержание веществ в моче (точнее выделение веществ с мочой) выражают в молях на сутки или, если неизвестна молекулярная масса, в единицах массы на сутки.

Результаты исследования ферментов. При исследовании ферментов активность ферментов рекомендуется выражать в моль/с (или моль·с-1), а также в моль/мин. моль/ч. При определении активности учитывается конкретно используемый субстрат, превращенный в ходе реакции. Поэтому в результатах определения активности ферментов следует давать ссылку на использованный метод определения.

Практически при определении в биологических жидкостях активность ферментов относят к единице объема - литру (напомним, что на дольные единицы литра выражать результаты нельзя). Так, активность ферментов выражают в молях в секунду на литр (моль·с-1·л-1). Для удобства выражения результатов в каждом конкретном случае применяют дольные единицы моля (ммоль, мкмоль, нмоль) или другие единицы времени (минута, час).

В тех случаях, когда молекулярная масса субстрата неизвестна (например, при использовании белка как субстрата при определении активности протеолитических ферментов или крахмала при определении активности б-амилазы), активность фермента выражают в единицах массы превращенного субстрата. Например, активность б-амилазы выражают в мг/(ч·л).

По рекомендации комиссии по ферментам Международного биохимического союза вводится единица активности ферментов, получившая название катал, сокращенно кат. Она соответствует скорости превращения 1 моль субстрата за 1 с, а также может быть выражена в дробных единицах: миллимолях (10-3)- милликатал, микромолях (10-6)- микрокатал, наномолях (10-9)- нанокатал, пикомолях (10-12)- пикокатал и т.д. Однако пока эти рекомендации не получили широкого распространения.

БЕЛКИ

Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, состоящие из аминокислот, соединенных пептидными связями, и имеющие сложную структурную организацию.

Белки делятся на две группы: простые, или протеины, и сложные, или протеиды. Протеины состоят только из аминокислот, связанных в полипептидную цепь пептидными связями, а протеиды содержат кроме аминокислот небелковый компонент, или простетическую группу (углевод, липид, нуклеиновую кислоту, кофактор и т.д.). Белки имеют несколько уровней структурной организации: первичный, вторичный, третичный и в большинстве случаев четвертичный.

1. Химическая природа простых белков

Присутствие веществ белковой природы в биологическом материале и лекарственных препаратах можно обнаружить с помощью качественных реакций на структурные компоненты белка и его функциональные группы. Все известные реакции выявления белков и пептидов можно разделить на три типа.

Реакция на пептидную группу, характерную для полипетидной цепи и нетипичную для прочих биологических веществ. Она специфична для белков и пептидов.

Реакции на концевые б-амино- или б-карбоксильные группы. Эти реакции дают также свободные б-аминокислоты и некоторые другие соединения.

Реакции на отдельные боковые радикалы или группы аминокислот, входящих в полипептиды. Эти реакции специфичны также и для свободных б-аминокислот и других веществ, содержащих соответствующую функциональную группу в молекуле.

Работа 1. Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот

Реактивы. Биуретовый реактив* (содержит NaOH и ионы Cu2+) Здесь и далее звездочкой отмечены реактивы, приготовление которых описано в приложении., нингидрин, 0,5%-ный водный раствор; азотная кислота, конц.; гидроксид натрия, 20%-ный раствор; реактив Миллона*; уксусная кислота, ледяная; серная кислота, конц.; ацетат свинца, 5%-ный раствор; нитропруссид натрия, 5%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с простыми пробирками; капельницы; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня.

Материалы для исследования.

Раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 20-кратном объеме дистиллированной воды, фильтруют через несколько слоев марли и хранят в холодильнике).

Неразбавленный свежий яичный белок.

1%-ные растворы глицина, глицилглицина, б-аланина, в-аланина.

0,1%-ные растворы фенилаланина, тирозина, триптофана, гистидина, цистеина гидрохлорида, метионина.

а. Биуретовая реакция на пептидную группу (реакция Пиотровского). Метод основан на способности пептидной группы белков и полипептидов образовывать в щелочной среде с ионами Cu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке.

Биуретовая реакция положительна с белками и пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей ( - С -NH - ). С ди- и трипептидами она неустойчива.

¦

О

Биуретовую реакцию дают небелковые вещества, содержащие не менее двух пептидных групп, например, производное мочевины - биурет

H2N - C - NH -C - NH2

давший название этой реакции, и некоторые

¦ ¦

O О

другие. В сильнощелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионом Cu2+, образуя окрашенный биуретовый комплекс примерно следующего строения:

На свободные аминокислоты биуретовая реакция обычно отрицательна. Исключение составляют гистидин, серин, треонин, аспарагин, которые при больших концентрациях в растворе могут образовывать окрашенный биуретовый комплекс Cu2+.

Ход определения. В одну пробирку вносят 5 капель ратсвора яичного белка, в другую - глицилглицина и в третью - глицина.

Добавляют в каждую пробирку по две капли биуретового реактива, слегка сбалтывают и наблюдают за появлением окрашивания.

б. Нингидриновая реакция на б-аминогруппу. Метод основан на взаимодействии нингидрина с б-аминогруппой аминокислот, пептидов, белков с образованием окрашенного комплекса синего или сине-фиолетового цвета.

При нагревании в присутствии нингидрина происходит окислительное дезаминирование б-аминогрупп аминокислот и пептидов, а молекула нингидрина при этом восстанавливается:

Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина, в результате образуется окрашенное соединение (сине-фиолетовый комплекс Руэмана):

Пролин и оксипролин дают с нингидрином окрашенный продукт желтого цвета. Нингидриновая реакция может быть положительна с некоторыми аминами, амидами кислот и некоторыми другими соединениями.

Ход определения. В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую -б-аланина и в третью - в-аланина.

Добавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора нингидрина, нагревают до кипения и через 1-3 мин наблюдают появление окрашивания.

в. Ксантопотеиновая реакция на ароматическое кольцо циклических аминокислот (реакция Мульдера). Метод основан на способности аминокислот и аминокислотных остатков полипептидов, содержащих ароматическое кольцо, образовывать при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой динитропроизводные соединения желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры, имеющие оранжевое окрашивание.

Ксантопротеиновая реакция характерна для фенилаланина, тирозина и триптофана, имеющих ароматическое (бензольное) кольцо. Эти аминокислоты или содержащие их белки при нагревании с концентрированной азотной кислотой дают нитросоединения желтого цвета.

Например, в реакции с тирозином образуется динитротирозин; добавление гидроксида натрия приводит к образованию натриевой соли хиноидной структуры динитротирозина.

белок сыворотка кровь биохимический



Ксантопротеиновая реакция положительна со многими ароматическими соединениями (бензол, фенол и др.).

Ход определения. 1.В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую - фенилаланина, в третью - тирозина и в четвертую - гистидина.

В каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты, нагревают до кипения (осторожно! В защитных очках!) и наблюдают за появлением окрашивания.

Содержимое пробирок охлаждают под струей водопроводной воды, затем в каждую по каплям добавляют раствор гидроксида натрия, пока не начнется переход окраски.

г. Реакция Миллона на тирозин. Метод основан на способности тирозина (как свободного, так и входящего в состав белка) при нагревании с реактивом Миллона образовывать ртутную соль нитротирозина, окрашенную в пурпурно-красный цвет

Эта реакция положительна также для фенольных соединений.

Ход определения. В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую - тирозина и в третью - фенилаланина. В каждую из них добавляют по 3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают на водяной бане (не выше 50?С), наблюдая за появлением окрашивания.

д. Реакция Адамкевича на триптофан. Метод основан на способности триптофана в кислой среде реагировать с глиоксиловой кислотой с образованием соединения, окрашенного в красно-фиолетовый цвет.

При нагревании две молекулы триптофана взаимодействуют с глиоксиловой кислотой с образованием окрашенного соединения



Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, в которой как примесь содержится глиоксиловая кислота. В качестве водоотнимающего средства в реакции используется концентрированная серная кислота.

Ход определения. В одну пробирку вносят 2 капли неразбавленного свежего яичного белка, а в другую - раствор триптофана.

Добавляют в каждую из них по 10 капель ледяной уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка белка в первой пробирке, после чего содержимое ее охлаждают.

Очень осторожно, по стенке, наклонив пробирку, подслаивают в каждую из пипетки около 1 мл концентрированной серной кислоты, следя за тем, чтобы жидкости не смешались. На границе двух слоев возникает характерное окрашенное кольцо, которое постепенно распространяется на весь раствор.

е. Реакция Фоля на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу (цистеин, цистин). Метод основан на способности белков, в состав которых входят серусодержащие аминокислоты (цистеин, цистин), в щелочной среде при нагревании образовывать сульфид натрия, который с плюмбитом натрия дает черный или бурый осадок сульфида свинца:

CH2 - SH CH2 - OH

¦ ¦

CH - NH2 + 2NaOH > CH - NH2 + Na2S + H2O

¦ ¦

COOH COOH

Pb(CH3COO)2 + 2 NaOH > Pb(OH)2 + 2CH3COONa

Pb(OH)2 + 2 NaOH > Na2PbO2 + 2H2O

Na2S + Na2PbO2 + H2O > PbSv + 4NaOH

Ход определения. В три пробирки наливают по 10 капель раствора ацетата свинца и по каплям в каждую из них прибавляют раствор гидроксида натрия до растворения первоначально образующегося осадка. В одну пробирку добавляют 5 капель раствора яичного белка, в другую - цистеина, в третью - метионина, смеси кипятят 1-2 мин и наблюдают за изменением их цвета и выпадением осадка.

ж. Нитропруссидная реакция на серусодержащие аминокислоты. Метод основан на способности сульфида натрия, образующегося щелочном гидролизе серусодержащих аминокислот, давать с нитропруссидом натрия окрашенное комплексное соединение красно-фиолетового цвета:

H2C - SH H2C - OH

¦ кипячение ¦

HC - NH2 + 2NaOH H C - NH2 + 2Na2S + H2O

¦ ¦

COOH COOH

цистеин серин

Na2S + Na2[Fe(CN)5NO] > Na4[Fe(CN)5NOS]

нитропруссид окрашенный натрия комплекс

Ход определения. В одну пробирку вносят 5 капель неразбавленного свежего яичного белка, в другую - раствор цистеина, в третью - метионина. Добавляют в каждую пробирку по 10 капель раствора гидроксида натрия, кипятят 3 мин и затем охлаждают их содержимое.

В каждую пробирку прибавляют 2-3 капли раствора нитропруссида натрия и наблюдают за появлением окрашивания.

Оформление работы. После каждой реакции сделать вывод о ее специфичности для исследуемого вещества и присутствии соответствующих функциональных групп в яичном белке. Результаты оформить в виде таблицы, отмечая знаками «плюс» или «минус» результат реакции.

№№п/п	Исследуемый материал	Реакция
		Биуретовая	Нингидриновая	Ксантопротеиновая	Фоля	Миллона	Адамкевича	Нитропруссидная

Практическое значение работы. Качественные реактивы (или, как их часто называют, цветные реакции) используются в клинико-биохимических лабораториях, фармацевтической практике и биохимических исследованиях для обнаружения присутствия белка и аминокислот в биологических средах, качественного анализа белковых лекарственных средств, препаратов гидролизатов белков и аминокислот, пептидов и белков на хроматограммах и электрофореграммах. Многие качественные реакции положены в основу методов количественного определения белков и аминокислот.

Работа 2. Качественный анализ некоторых белковых препаратов

Реактивы и оборудование те же, что и в работе 1.

Материалы.

Аминопептид или другой гидролизат белков - препарат для парентерального питания.

Желатиноль (препарат из пищевого желатина) или желатин, 1%-ный раствор.

Метод анализа основан на использовании качественных реакций, рассмотренных в предыдущей работе, для выявления присутствия отдельных аминокислот в составе белковых препаратов.

Ход определения. С белковыми препаратами проводят качественные реакции - биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, Миллона, Фоля, Адамкевича и нитропруссидную. Для проведения каждой реакции используют по 5 капель гидролизата белков и препарата желатина.

Оформление работы. Полученные данные оформить в виде таблицы, приведенной в работе 1.

В выводе показать наличие, согласно проведенному анализу, отдельных аминокислот и сравнительную полноценность исследуемых белковых препаратов.

Практическое значение работы. Состав аминокислот определяет не только свойства белка, но и его питательную и лекарственную ценность. Биологически полноценными считаются белки, содержащие все незаменимые аминокислоты. Поэтому представляет интерес наличие именно этих аминокислот в белковых гидролизатах. Гидролизаты белков различной природы используются в медицине как лекарственные препараты для парентерального обмена. В лечебных целях применяются различные белки плазмы крови, желатина и др.

В практике контроль качества и количественный анализ таких лекарственных средств, как гидролизаты белков и препаратов, содержащих смеси аминокислот или отдельные аминокислоты, основываются на качественном и количественном анализе конкретных аминокислот. Так, одним из основных показателей качества гидролизатов белков является содержание триптофана, которое составляет в аминопептиде и в фибриносоле около 0,5 г/л, а в растворах гидролизина и гидролизата казеина не менее 0,15 г/л.

Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот

Хроматография - один из эффективных и широко применяемых в биохимических исследованиях методов разделения аминокислот. Наиболее простой и доступной является распределительная хроматография на бумаге. Для проведения ее используют систему растворителей, составляющих подвижную и неподвижную фазы, от правильного подбора которых зависит эффективность разделения аминокислот. В частности, применяют фенол, насыщенный водой. При обработке хроматографической бумаги этой смесью растворителей вода с небольшим количеством фенола впитывается в бумагу и образует неподвижную фазу, а фенол, насыщенный водой, служит подвижной фазой.

В зависимости от направления фронта передвижения растворителя различают следующие виды хроматографии: восходящую, нисходящую, одномерную, двухмерную и радиальную. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления хроматограмм. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и затем нагревают ее в сушильном шкафу при 100°С, т.е. проводится качественная нингидриновая реакция на аминокислоты, находящиеся на бумаге.

Скорость перемещения аминокислот выражают коэффициентом Rf, который представляет собой отношение расстояния, пройденного данной аминокислотой, к пути, пройденному фронтом растворителя:

Rf = a/b,

где a - расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот (линия старта) до центра пятна конкретной аминокислоты;

b - путь, пройденный растворителем от линии старта до его фронта окончания хроматографии, мм.

Для каждой аминокислоты характерно свое значение Rf, которое зависит от сорта хроматографической бумаги, системы растворителей, температуры, рН среды и т.д.

Реактивы. Фенол, насыщенный водой*; нингидрин, 0,2%-ный раствор в ацетоне.

Оборудование. Термостат, отрегулированный на температуру 37-38°С; сушильный шкаф, отрегулированный на температуру 100-105°С и имеющий перекладины с крючками для подвешивания хроматограмм; большие пробирки (диаметр 2,0-2,5 см, длина 18-20 см) с плотно подогнанными пробками и штатив для них; полоски хроматографической бумаги (ленинградская, лучше марки «быстрая», 12х150 мм); простой карандаш и линейка; игла с ниткой; микропипетка; чашка Петри или пульверизатор; пинцет; ножницы; пипетка вместимостью 5 мл.

Материалы. Раствор смеси L-аланина, лейцина и глутаминовой кислоты, 0,04 моль/л.

Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот по бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (вода с примесью фенола) и подвижной (фенол, насыщенный водой) фазами растворителя.

Ход определения. Берут пинцетом за конец полоску бумаги (не касаться бумаги пальцами!), прокалывают его иглой с ниткой, которую завязывают петлей длиной 5-6 см. На противоположном конце полоски, отступив от края 2 см, проводят простым карандашом линию старта и в центре ее очерчивают кружок диаметром 3-4 мм для нанесения раствора смеси аминокислот.

Полоску укладывают на лежащие стеклянные пробирки и наносят 0,2 мл раствора смеси аминокислот, но не сразу, а порциями. После нанесения каждой порции пятно подсушивают, чтобы оно не расплывалось за пределы очерченного карандашом кружка.

В сухую пробирку с помощью пипетки вносят 2 мл фенола, насыщенного водой (при работе с фенолом соблюдать осторожность: вызывает ожоги! Не насасывать его в пипетку ртом!), следя за тем, чтобы не смочить стенки пробирки.

Ставят пробирку в штатив строго вертикально. Осторожно, держа за нитку, опускают в пробирку полоску бумаги, погружая ее нижний конец в растворитель не более чем на 2-3 мм, и закрепляют ее в висячем положении, прижав петлю плотно закрытой пробкой (рис.4).

Помещают штатив с пробиркой в термостат (при 37-38°С) на 1,5 ч.

Рис. 4. Прибор для хроматографии (а) и хроматограмма аминокислот (б)

Затем вынимают полоску, подвешивают ее за петлю в сушильном шкафу и выдерживают при 100-105°С в течение 10 мин.

Для проявления хроматограммы полоску переносят в чашку Петри, в которую налито 15 мл раствора нингидрина, держа ее пинцетом, проводят через раствор и вновь помещают в сушильный шкаф на 5 мин при той же температуре.

Оформление работы. Зарисовать в рабочем состоянии прибор, отметив положение аминокислот на хроматограмме. Измерить линейкой расстояния (в мм) a и b для каждой аминокислоты и рассчитать их Rf. В выводе отметить возможность разделения хроматографией на бумаге разных аминокислот.

Практическое значение работы. Хроматографический анализ свободных аминокислот в сыворотке крови, моче и других жидких средах применяется в клинике для диагностики наследственных заболеваний обмена аминокислот, патологии печени, почек, а также при оценке степени тяжести сахарного диабета: в фармации - для контроля качества белковых гидролизатов и препаратов смеси аминокислот, а в научных экспериментах - для изучения аминокислотного состава гидролизатов очищенных белков.

2. Исследование физико-химических свойств белков

Физико-химические свойства белка определяются особенностями его структурной организации, которая придает ему новые качества, отсутствующие у составляющих полипептидную цепь мономеров. Особенности физико-химических свойств белка лежат в основе многих приемов и методов, применяемых в клинико-биохимических лабораториях, фармацевтической практике и в экспериментальной биохимии для его выделения и очистки, качественного и количественного анализа.

Работа 4. Диализ белков

Диализ демонстрирует макромолекулярную природу белка. Как и все высокомолекулярные соединения, белок не проникает через искусственные (например, целлофан, пергамент и др.) и биологические мембраны, что позволяет использовать диализ как метод очистки белка от низкомолекулярных органических и неорганических примесей. С этой целью применяется специальный прибор - диализатор (или электродиализатор). Простейший из них представляет собой сделанный из целлофана или другого подобного ему материала мешочек, наполненный раствором очищаемого белка и погруженный в стакан с дистиллированной водой.

Реактивы. Сульфат аммония, насыщенный раствор; хлорид бария, 5%-ный раствор; биуретовый реактив*.

Оборудование. Целлофан, предварительно разрезанный на куски размером 125х125 мм (можно применять заводской диализаторный материал); стакан с дистиллированной водой; стеклянные палочки; резиновые колечки; штатив с пробирками; пипетки.

Материал. Раствор яичного белка (приготовление см. работу 1) или сыворотка крови.

Метод основан на способности мембран задерживать макромолекулы белка и пропускать неорганические ионы.

Ход определения. К 5 мл раствора яичного белка (или сыворотки крови) добавляют каплю насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Отбирают в две пробирки по 10 капель раствора и проделывают в одной из них биуретовую реакцию, а в другой - пробу на сульфаты. При проведении пробы на сульфаты добавляют 2-3 капли раствора хлорида бария.

Целлофану, предварительно замоченному в дистиллированной воде, придают форму мешочка, который примерно на 1/3 заполняют исследуемым раствором белка. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, которые прижимают друг к другу с помощью надетых с двух концов резиновых колечек.

Мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой, положив зажимающие его стеклянные палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке не должен быть выше уровня жидкости в стакане (рис.5).



Рис. 5. Диализатор в рабочем состоянии

Через час после начала диализа берут две пробы (по 10 капель) наружной жидкости (диализат). С одной стороны из них проводят биуретовую реакцию на белок, а с другой - реакцию на сульфаты, добавляя 2-3 капли хлорида бария.

Проделывают пробы на белок и сульфаты с жидкостью внутри мешочка.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отметив знаками «плюс» или «минус» наличие реакции:

Определяемые компоненты	До диализа	После диализа
	внешняя жидкость	внутренняя жидкость	внешняя жидкость	внутренняя жидкость
Белок SO42-

В выводах отметить, какое свойство белка демонстрирует метод диализа и возможность его применения.

Практическое значение работы. Метод анализа используется для отделения низкомолекулярных органических примесей и неорганических ионов при очистке белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.д. в биохимических исследованиях или при получении лечебных препаратов (например, белковых). Способ диализа положен в основу работы аппарата «искусственная почка», который применяется для очищения крови от природных низкомолекулярных «шлаков» и токсических соединений.

Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка

Белок как амфотерный полиэлектролит содержит положительные и отрицательные заряды, соотношение которых определяется количеством кислых и основных аминокислот в его макромолекуле. Заряженность молекулы белка является одним из факторов его устойчивости в растворах, так как мешает слипанию белковых частиц и выпадению их в осадок. На общий заряд макромолекулы белка влияет рН среды. Для каждого белка существует значение рН, при котором сумма положительных и отрицательных зарядов его равна нулю. Это состояние белка называется изоэлектрическим, а соответствующее такому состоянию значение рН называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ растворы белков неустойчивы и белки легко выпадают в осадок особенно в присутствии водоотнимающих веществ (этиловый спирт, ацетон и т.д.).

Реактивы. Уксусная кислота, 0,2 М раствор; ацетат натрия, 0,2 М раствор; этиловый спирт, 96%-ный.

Оборудование. Пипетки вместимостью 1 и 2 мл; штатив с пробирками.

Материал. Казеин, 0,1%-ный раствор.

Метод основан на способности растворенного белка (казеина) в изоэлектрической точке переходить в неустойчивое состояние и выпадать в осадок, что проявляется в выраженном помутнении раствора. При добавлении этилового спирта (водоотнимающее средство) процесс осаждения белка ускоряется.

Ход определения. В шести пронумерованных пробирках готовят буферные смеси с разным значением рН. Содержимое пробирок взбалтывают и в каждую добавляют по 0,5 мл раствора казеина.