Приготовление буферных систем для определения ИЭТ казеина

№ пробирки	Состав буферной смеси, мл	рН смеси
	0,2 М CH3COOH	0,2 М CH3COONa
1	1,9	0,1	3,4
2	1,8	0,2	3,8
3	1,4	0,6	4,4
4	1,0	1,0	4,7
5	0,6	1,4	5,1
6	0,2	1,8	5,7

После этого смесь в пробирках снова встряхивают и отмечают помутнение раствора. В каждую пробирку добавляют по 2 мл этилового спирта и оценивают степень мутности проб.

Оформление работы.

Результаты оформить в виде таблицы, отмечая степень мутности раствора до и после добавления этилового спирта по пятибальной шкале: 1 - отсутствие помутнения, 2 - слабое, 3 - умеренное, 4 - сильное, 5 - очень сильное.

рН	Степень мутности раствора казеина
	до добавления спирта	после добавления спирта
3,4
3,8
4,4
4,7
5,1
5,7

В выводе отметить ИЭТ казеина и возможность ее практического использования для выделения этого белка.

Практическое значение работы. Нахождение изоэлектрической точки для индивидуальных белков позволяет подобрать условия для осаждения их из биологических экстрактов, содержащих смесь разных белков, и при очистке белковых препаратов в фармации.

Работа 6. Исследование денатурации белков

Вещества, нарушающие структурную организацию белковой молекулы (т.е. четвертичную, третичную и даже вторичную структуры), приводят к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Это явление называется денатурацией.

Денатурирующие факторы делятся на химические, физические и биологические. Наиболее обширны группы химических факторов (кислоты, тяжелые металлы, алкалоиды, поверхностно-активные вещества и т.д.) и физических факторов (температура, ионизирующая радиация, ультразвук и т.д.). Биологическую денатурацию могут вызвать протеолитические ферменты (например, трипсин), которые разрушают высшие уровни организации молекулы белка перед тем, как гидролизовать ее пептидные связи.

Денатурация изменяет физико-химические свойства белка, в частности, его растворимость. При этом белок становится менее гидрофильным и легко осаждается. Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев удаление денатурирующих агентов приводит к восстановлению исходной конформации молекулы белка и его природных свойств - ренатурация.

Реактивы. Азотная кислота, конц.; сульфат меди, 5%-ный раствор; сульфат свинца, 5%-ный раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; хлорная кислота, 10%-ный раствор; этиловый спирт, 96%-ный; ацетон.

Оборудование. Штатив с простыми пробирками; пипетки; водяная баня.

Материал. Раствор яичного белка (приготовление см. работу 1).

а. Денатурация белка концентрированными минеральными кислотами. Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит к его денатурации и осаждению.

Ход определения. В пробирку наливают 10 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно, держа пробирку под углом 45?, наслаивают на кислоту 5 капель раствора яичного белка. Отметить изменения на границе двух слоев жидкостей (кольцо денатурированного белка).

б. Денатурация белка органическими кислотами. Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка.

Ход определения. В две пробирки наливают по 10 капель раствора яичного белка. Добавляют в одну из них 2 капли трихлоруксусной кислоты, а в другую - 2 капли хлорной кислоты, отмечают произошедшие изменения.

в. Денатурация белка солями тяжелых металлов. Метод основан на связывании ионов тяжелых металлов с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекулу белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO3 и HgCl2) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за адсорбции иона металла и приобретении вследствие этого белковой молекулой положительного заряда.

Ход определения. В две пробирки вносят по 10 капель раствора яичного белка. В первую из них добавляют 1-2 капли раствора сульфата меди, а во вторую - 1-2 капли раствора ацетат свинца. Наблюдают за выпадением осадка белка. Прибавляют в каждую из пробирок по несколько капель соответствующего осадителя и наблюдают за растворением осадка.

г. Денатурация белка органическими растворителями. Метод основан на способности органических растворителей (спирт, хлороформ) нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка.

Ход определения. В три пробирки наливают по 10 капель раствора белка и добавляют равные объемы органических растворителей: в первую - этиловый спирт, во вторую - ацетон, в третью - хлороформ. Наблюдают за выпадением белка.

Оформление работы. Особенности действия денатурирующих веществ указать в протоколах по каждой реакции осаждения. В выводах отметить причину денатурации белка.

Практическое значение работы. Явление денатурации белков используется в клинике, фармации и биохимических исследованиях:

а) для осаждения белка в изучаемом биологическом материале с целью дальнейшего определения в нем низкомолекулярных субстратов;

б) для выявления присутствия белка в различных биологических экстрактах и жидкостях и количественного его анализа (в частности, качественное и количественное определение белка в моче основано на реакции денатурации белка азотной кислотой);

в) для связывания солей тяжелых металлов белком при лечении отравлений или их профилактике на производстве;

г) для обеззараживания отходов в санитарно практике;

д) для дезинфекции кожи и слизистых покровов.

Работа 7. Исследование высаливания белков (на примере белков сыворотки крови)

Высаливание - процесс осаждения белков солями щелочных и щелочно-земельных металлов, который является обратимым и сохраняет нативные свойства белков. Высаливание можно проводить не только солями щелочных и щелочно-земельных металлов (Na2SO4, NaCl, KCl, MgSO4, MgCl2 и др.), но и нейтральными солями, например (NH4)2SO4. Все вещества этого типа нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к осаждению белка. При растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств.

Белки отличаются друг от друга зарядом и гидрофильностью, поэтому можно разделить белки, используя для их осаждения разные концентрации солей или органических растворителей в среде.

Реактивы. Сульфат аммония, насыщенный раствор; сульфат аммония, кристаллический, тонко измельченный; биуретовый реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки; воронки для фильтрования; бумажные фильтры.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности сульфата аммония нейтрализовывать заряд молекул белков и вызывать их дегидратацию, что приводит к осаждению белка (высаливанию); при полунасыщении осаждаются глобулины, а при полном насыщении - альбумины сыворотки крови. Это связано с тем, что глобулины менее гидрофильны и имеют большую молекулярную массу, чем альбумины.

Ход определения. В пробирку вносят 20 капель сыворотки крови и добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (получается полунасыщенный раствор). Выпадает осадок глобулинов. Через 5 мин осадок отфильтровывают.

К фильтрату прибавляют тонко измельченный порошок сульфата аммония до тех пор, пока он не перестает растворяться (полное насыщение). Выпадает осадок альбуминов. Осадок отфильтровывают. Фильтрат проверяют на отсутствие белка, проделывая биуретовую реакцию (см. работу 1).

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы

Высаливающее вещество	Степень насыщения раствора сульфатом аммония	Осаждаемая фракция белков сыворотки крови

В выводе указать на возможность разделения белков методом высаливания, принцип его и отличия от осаждения путем денатурации.

Практическое значение работы. Метод высаливания используют в клинических лабораториях для разделения альбуминов и глобулинов и определения их соотношения в сыворотке крови. Осажденную фракцию белка можно отделить центрифугированием, растворить и количественно определить содержание ее с помощью различных методов. В норме соотношение альбумин/глобулин в сыворотке крови человека колеблется в пределах 1,5-2,3 и может меняться при патологии, например, при воспалительных заболеваниях, когда увеличивается содержание глобулинов.

Высаливание применяют также для очистки и получения кристаллических препаратов белков.

3. Количественный анализ белков

Для количественного определения белков в биологическом материале или лекарственных препаратах чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия, фотонефелометрия и спектрофотометрия.

Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. Поскольку белки содержат в среднем 16% азота, то найденное количество его умножают на 6,25 (так как 100:16=6,25) и получают содержание белка в пробе. Эти методы (к ним относится классический метод Кьельдаля и его модификации) очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19.

Фотоколориметрические методы основаны на так называемых «цветных» реакциях на функциональные группы белков. Среди них наибольшее применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот (тирозин, триптофан). Биуретовый метод более специфичен, так как пептидные связи имеются только в белках и пептидах. Он широко применяется в клинико-биохимических исследованиях. Метод Лоури, основанный на реакции Фолина, высокочувствительный, но малоспецифичный, поскольку сходную окраску дают свободные ароматические аминокислоты и многие другие соединения, содержащие фенольную группу.

Фотонефелометрические методы определения содержания белка основываются на оценке степени мутности его взвеси в растворах. Эти методы не получили широкого распространения.

Спектрофотометрические методы делятся на прямые и косвенные. Последние представляют собой боле чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка.

Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в ультрафиолетовой области при 200-220 нм (в этой области абсорбируют пептидные группы белка) и при 280 нм (зона поглощения ароматических радикалов аминокислот, в основном триптофана и тирозина).

Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов.

Более специфична спектрофотометрия при 200-220 нм, чем при 280 нм, так как в последнем случае мешает светопоглощение различных низкомолекулярных ароматических соединений, содержащихся в биологическом материале.

Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови

Реактивы. Биуретовый реактив*; хлорид натрия, 0,9%-ный раствор.

Оборудование. Микропипетки и пипетки вместимостью 1 и 5 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; фотоэлектроколориметр (ФЭК); спектрофотометр (СФ).

Материалы. Сыворотка крови; альбумин, 10%-ный раствор.

а. Биуретовый метод определения содержания белка в сыворотке крови.

Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu2+ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде.

Ход определения.

Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график.

Для этого применяют стандартный белок - кристаллический альбумин сыворотки крови.

Схема разведения альбумина для построения калибровочного графика приведена в таблице

№ пробирки	Стандартный 10%-ный раствор альбумина, мл	0,9%-ный раствор хлорида натрия, мл	Концентрация белка, г/л	Экстинкция
1	0,4	0,6	40
2	0,6	0,4	60
3	0,8	0,2	80
4	1,0	-	100

Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый).

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс - концентрацию белка.

Берут 2 пробирки - в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) - 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой.

б. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%.

Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой.

Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн - 260 и 280 нм.

Расчет можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику):

х = 1,45Е280 - 0,74Е260,

где х - концентрация белка в растворе, г/л.

Оформление работы. По калибровочной кривой рассчитать содержание белка. Сравнить результаты, полученные биуретовым методом и спектрофотометрическим. Сделать вывод о наличии отклонения концентрации белка в исследуемой сыворотке крови от нормы и о возможных его причинах.

Практическое значение работы. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическим свойствам (более 100 различных белков плазмы крови). Нормальное содержание белка в сыворотке крови (нормопротеинемия) составляет 65-85 г/л. Определение общего белка в сыворотке крови находит широкое применение в практической медицине, так как по изменению его нормального содержания можно судить о различных нарушениях в организме. Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) относительно редко: при сгущении крови из-за потери жидкости (длительная рвота, усиленное потоотделение, холера, тяжелые ожоги и т.п.), при некоторых хронических воспалительных процессах вследствие образования антител (ревматизм, полиартрит). Пониженное содержание белка в крови (гипопротеинемия): при недостаточном поступлении белка с пищей (голодание, нарушение проходимости кишечного тракта), при нарушении образования белка в органах (при поражении печени химическими веществами, опухолями, микроорганизмами и т.д.), при потере белка организмом (кровотечения, повышенная проницаемость сосудов, заболевания почек, беременность и т.д.).

В фармацевтической практике количественные методы определения белка необходимы для контроля белковых лекарственных средств (вакцин, сывороток, г-глобулина, белковых препаратов крови и т.д.).

4. Состав и свойства сложных белков

Сложные белки являются представителями смешанных макромолекул, которые содержат как минимум два разных химических компонента, соединенных ковалентными или слабыми (ионными, водородными, вандерваальсовыми) связями. К сложным белкам относят кофакторпротеиды (гемпротеиды, хлорофиллпротеиды, флавопротеиды и др.), гликопротеиды и протеогликаны, липопротеиды и протеолипиды, металлопротеиды, фосфопротеиды и нуклеопротеиды.

Особенность строения этих макромолекул позволяет использовать при обнаружении и количественном определении их в биологическом материале методы анализа как на белковый фрагмент молекулы, так и на простетическую группу. Поскольку последняя специфична для каждого класса сложных белков, реакции на нее применяются чаще.

Работа 9. Химическая природа гемпротеидов

К гемпротеидам относят гемоглобин, миоглобин, цитохромы и ферменты - каталазу и пероксидазу. Они состоят из белковой части и гема, представляющего собой тетрапиррольное соединение, связанное с атомом железа (II).

При действии на гемоглобин концентрированной уксусной кислоты в присутствии NaCl гем переходит в гемин, в котором железо трехвалентно и его третья валентность связана с хлором. При действии на гемоглобин щелочей гем переходит в гематин, в котором атом железа также трехвалентен, и третья его валентность связана с гидроксильной группой.

Гем, входящий в гемоглобин, ускоряет реакцию окисления субстратов (S·H2) пероксидом водорода, т.е. действует подобно ферменту пероксидазе: S·H2 + H2O2 - S + 2H2O. Это объясняется сходством строения простетических групп гемоглобина и пероксидазы. Однако в отличие от фермента гемоглобин сохраняет каталитические свойства при кипячении и действии сильных кислот, которые вызывают денатурацию белка.

Если в исследуемом материале содержится кровь, то ее присутствие можно обнаружить по способности геминовой группы катализировать окисление подходящих субстратов (бензидин, гвояковая смола) пероксидом водорода.

Реактивы. Пероксид водорода, 3%-ный свежеприготовленный раствор; бензидин, 5%-ный свежеприготовленный раствор в ледяной уксусной кислоте; гваяковая смоляная кислота, 1%-ный раствор на 95%-ном этиловом спирте, свежеприготовленный; азотная кислота, конц.; соляная кислота, не содержащая железа, 10%-ный раствор; гексацианоферрат (II) калия, 2,5%-ный раствор; роданид аммония, 1%-ный раствор; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; биуретовый реактив*; ацетон, подкисленный соляной кислотой (3 мл 2 М раствора HCl на 1 л ацетона, рН?2), охлажденный в холодильнике.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги шириной 1 см; глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 и 10 мл; штатив; простые и центрифужные пробирки; водяная и песчаная бани; центрифуга с центрифужными весами; тигель фарфоровый и тигельные щипцы.

Материал.

Цельная кровь, разведенная в 5000 раз дистиллированной водой.

Кровь дефибринированная.

Гемоглобин кристаллический, 1%-ный водный раствор.

а. Бензидиновая проба на геминовую группу гемоглобина. Метод основан на способности геминовой группы гемоглобина катализировать реакцию окисления бензидина в дифенохинондиимин пероксидом водорода

Дифенохинондиимин конденсируется с молекулой неокисленного бензидина с образованием окрашенного комплекса сине-зеленого цвета.

В пробирку наливают 1 мл цельной крови, разведенной в 5000 раз, кипятят несколько минут на водяной бане, охлаждают и добавляют по 2 капли раствора бензидина и пероксида водорода. Отмечают появление окрашивания.

б. Гваяковая проба на геминовую группу гемоглобина. Метод основан на способности геминовой группы гемоглобина катализировать реакцию окисления гваяковой смоляной кислоты пероксидом водорода до ее озонида, окрашенного в синий цвет.

Ход определения. В пробирку вносят несколько капель цельной крови (разведенной в 5000 раз) и кипятят ее в течение 1 мин на водяной бане. После охлаждения приливают к пробе 1-2 капли спиртового раствора гваяковой смоляной кислоты и 3 капли раствора пероксида водорода. Отмечают развитие окрашивания.

в. Проба с гексацианоферратом (II) калия и роданидом аммония на железо гемоглобина. Метод основан на способности железа, входящего в гемоглобин, образовывать с гексацианоферратом (II) калия в присутствии соляной кислоты сине-зеленое комплексное соединение - берлинскую лазурь:

4FeCl3 + 3K4[Fe(CN)6] > Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ,

гексацианоферрат (II) берлинская калия лазурь

а с роданидами - роданид железа розового или красного цвета

FeCl3 + 3NH4CNS > Fe(CNS)3 + 3KCl

роданид роданид аммония железа

Ход определения. Несколько капель дефибринированной крови помещают в фарфоровую чашечку (тигель) и выпаривают досуха на песчаной бане. Сухой остаток озоляют, добавляют 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и продолжают нагревание (под тягой). При этом железо гемоглобина переходит в состав золы.

Сухой остаток переносят в пробирку, добавляют 10 капель раствора соляной кислоты до растворения золы. Разливают содержимое примерно поровну в две пробирки. В одну из них добавляют 2 капли раствора гексацианоферрата (II) калия. Наблюдают за появлением характерного окрашивания. Во вторую пробирку приливают 2 капли раствора роданида аммония и отмечают развитие специфического окрашивания.

г. Разделение гемоглобина на гем и глобин. Метод основан на способности ацетона, подкисленного соляной кислотой, разрывать связи между гемом и глобином, причем отщепившийся гем растворяется в ацетоне, а глобин выпадает в осадок.

Ход определения. В пробирку наливают 10 мл подкисленного ацетона и медленно добавляют 10 капель раствора гемоглобина. Наблюдают появление беловатой взвеси (глобин), которая постепенно оседает. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, переливают в центрифужные пробирки и центрифугирую при 1500 об/мин в течение 5 мин.

После центрифугирования в верхний слой (ацетоновый) осторожно опускают две полоски фильтровальной бумаги и проделывают реакции на наличие геминовой группировки. Для этого на одну полоску наносят по капле бензидина и раствора пероксида водорода (бензидиновая проба), на вторую -по две капли спиртового раствора гваяковой смоляной кислоты и раствора пероксида водорода (гваяковая проба). Отмечают постепенное появление характерного окрашивания на обеих полосках бумаги.

Верхний слой жидкости осторожно сливают, а к оставшемуся осадку добавляют 1 мл 3%-ного раствора гидроксида натрия. Перемешивают содержимое и добавляют 10 капель биуретового реактива. Наблюдают появление характерного окрашивания.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

Компонент гемоглобина	Вид реакции	Характер окрашивания

В выводах указать на возможность обнаружения гемоглобина в исследуемом материале с помощью проделанных качественных реакций и разделения его компонентов действием кислых растворов ацетона; отметить значение реакций для практики.

Практическое значение работы. Основная часть гемпротеидов крови находится в виде гемоглобина эритроцитов. В сыворотке или плазме крови содержится лишь незначительное количество гемпротеидов, появляющихся при значительном распаде эритроцитов (гемолизе). В сыворотке крови железо находится в виде ферротрансферина, являющегося сложным белком (металлопротеидом), который переносит железо между тканями и органами.

Качественные реакции на простетические группы протеидов позволяют выявить структурные компоненты: геминовую группировку и входящее в состав гема железо. Для обнаружения следов крови очень чувствительные бензидиновая и гваяковые пробы используются в клинике и судебно-медицинских исследованиях.

Работа 10. Выявление углеводного компонента гликопротеидов

Гликопротеиды - это сложные белки, содержащие углеводный компонент. Он составляет, как правило, примерно 10-20% от массы всей макромолекулы. Исключение представляют так называемые вещества групп крови, содержащиеся в эритроцитах. У этих гликопротеидов углеводная часть составляет до 80% от массы макромолекулы.

В гликопротеидах углевод с белком соединен ковалентной связью. В состав небелкового фрагмента гликопротеидов входят разнообразные моносахариды и их производные: глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза, арабиноза, фукоза, рамноза, глюкозамин, ацетилглюкозамин, нейраминовая кислота, глюкуроновая кислота и др.

Гликопротеиды широко распространены в организме человека и животных и выполняют многочисленные биологические функции. Например, гликопротеидами являются транспортные белки плазмы (гаптоглобин, трансферрин, транскортин и др.), факторы свертывания крови (протромбин, фибриноген), иммуноглобулины, ферменты (холинэстераза, рибонуклеаза В), гормоны (гонадотропины, кортикотропин). Эта группа сложных белков содержится во внутрисуставной жидкости, где они выполняют механическую функцию. Гликопротеиды входят в состав слизистых секретов - слюны, желудочного и кишечного соков, облегчая движение пищи по кишечнику.

Особенность моносахаридного состава углеводной части гликопротеидов определяет методы их качественного и количественного анализа.

Реактивы. Уксусная кислота, конц.; б-нафтол, 1%-ный спиртовой раствор; серная кислота, конц.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки; пипетки вместимостью 5 мл; стеклянные палочки; фильтровальная бумага.

Материал.

Слюна (для получения слюны прополаскивают ротовую полость водой, затем набирают в рот 10 мл дистиллированной воды и держат ее около 2 мин, смешивая с выделяющейся слюной. Жидкость выпускают в стаканчик, профильтровывают через марлю и используют для исследования).

Кортикотропин, во флаконах.

Хорионический гонадотропин, в ампулах.

Метод основан на способности гидроксиметилфурфурола, образующегося из гексоз гликопротеидов под влиянием концентрированной серной кислоты, давать с б-нафтолом продукт конденсации красно-фиолетового цвета:

Ход определения. В пробирку вносят 2 мл слюны и прибавляют по каплям половинный объем концентрированной уксусной кислоты, помешивая содержимое стеклянной палочкой. Муцин слюны осаждается в виде комочка. Жидкость осторожно сливают, придерживая комочек муцина стеклянной палочкой. Обсушивают сгусток полоской фильтровальной бумаги.

К муцину добавляют 10-20 капель спиртового раствора б-нафтола и по стенке пробирки, наклонив ее, осторожно наслаивают 20 капель концентрированной серной кислоты. Образуется окрашенное кольцо. При осторожном встряхивании пробирки постепенно окрашивается ее содержимое.

Ту же реакцию, что и с муцином, проделывают с препаратами кортикотропина и хорионического гонадотропина, используя для этих целей по 5 капель исследуемых веществ.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

Вещество	Реакция	Наличие окраски

В выводе отметить наличие соответствующих простетических групп в изучаемых объектах.

Практическое значение работы. Качественные реакции на простетическую группу гликопротеидов используются для выявления их в различном биологическом материале и лекарственных препаратах. Эти реакции лежат в основе методов количественного определения гликопротеидов.

Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды (на примере казеина молока)

Простетической группой фосфопротеидов является остаток фосфорной кислоты, который эфирной связью соединен с гидроксилом серина или треонина белковой части. Фосфорная кислота составляет 0,4-0,9% от массы молекулы фосфопротеида. К фосфопротеидам относятся казеиноген (казеин) молока, вителлин, вителленин и витин яичных желтков, ферменты - фосфорилаза, фосфоглюкомутаза и многие другие.

Казеиноген является полноценным белком, содержащим все незаменимые аминокислоты. В молоке он связан не только с остатком фосфорной кислоты, но и с ионами кальция. Свертывание молока при подкислении объясняется выпадением осадка казеиногена. Под действием пищеварительных ферментов (пепсин, химозин) казеиноген превращается в казеин, что сопровождается свертыванием (створаживанием) молока.

Присутствие фосфопротеидов в материале можно обнаружить реакциями на фосфаты.

Реактивы. Биуретовый реактив*; молибдат аммония в азотной кислоте*; азотная кислота, конц.; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 1 М растворе соляной кислоты.

Оборудование. Весы аптечные с разновесом; штатив с пробирками; стеклянные палочки; пипетки вместимостью 5 мл; водяная баня.

Материал. Казеин, сухой порошок.

Метод основан на обнаружении в гидролизатах казеина белкового компонента по биуретовой реакции, а фосфорной кислоты - по реакции с молибдатом аммония, в результате которой образуется фосфомолибденовый комплекс:

H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 > (NH4)3(PO4•12MoO3) + 21NH4NO3 + 12H2O

Под действием восстановителей (аскорбиновая кислота) фосфомолибдат аммония переходит в молибденовую синь.

Ход определения. В пробирку отвешивают 0,1 г сухого порошка казеина. Добавляют 5 мл раствора гидроксида натрия и ставят в кипящую водяную баню на 30 мин.

После охлаждения отбирают в пробирку 10 капель гидролизата и проводят реакцию с биуретовым реактивом, добавляя его 3-5 капель. Отмечают появление характерного окрашивания.

В другую пробирку вносят 20 капель гидролизата и нейтрализуют его, прибавляя по каплям концентрированную азотную кислоту до слабой реакции (по лакмусовой бумаге, кусочек которой заранее помещают в пробирку). Затем добавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое встряхиванием и наливают 10 капель раствора аскорбиновой кислоты. Вновь перемешивают и оставляют стоять пробы до развития специфического окрашивания.

Оформление работы. Отметить результат проведенных качественных реакций, в выводе указать химическую природу казеина молока.

Практическое значение работы. Качественные реакции на фосфатную группу используются для обнаружения фосфопротеидов в исследуемых образцах.

Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса

Реактивы. Раствор трихлоруксусной кислоты, 10%-ный раствор; уксусно-сернокислый реактив (95 мл ледяной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1,0; 5,0; центрифуга; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности нейраминовой кислоты, освобождающейся при гидролизе сывороточных гликопротеидов, образовывать окрашенные соединения при нагревании с уксусно-сернокислым реактивом.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1,0 мл сыворотки крови и добавляют 1,0 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку помещают в кипящую водяную баню точно (!) на 5 минут. Охлаждают под струей воды в течение 5 минут. Встряхивают и центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин. Отбирают 0,4 мл надосадочной жидкости, переносят в пробирку, наливают 5,0 мл уксусно-сернокислого реактива и помещают на 30 минут в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры и интенсивность окраски определяют на ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной 10 мм против контроля. Контролем служит уксусно-сернокислый реактив.

Расчет. Определите количество сиаловых кислот по калибровочному графику и рассчитайте содержание по формуле:

а•5•100

Х = ---------- ,

1000•1000

где а - содержание сиаловых кислот в исследуемой пробе в мкг, найденное по калибровочному графику;

5 - расчет на 1 мл сыворотки;

1000 (в числителе) - для перевода на 1 л сыворотки;

1000 (в знаменателе) - для пересчета в мг и г.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкций сделать расчет содержания сиаловых кислот в г/л. Пересчитать их содержание в ммоль/л согласно формуле:

а•103

Х = -------- ,

309

где а - количество сиаловых кислот в г/л;

103 - перевод г в мг;

309 - молекулярный вес сиаловых кислот.

Практическое значение работы. В норме содержание сиаловых кислот в сыворотке крови колеблется от 2,0 до 2,36 ммоль/л (0,62-0,73 г/л). Их количество значительно возрастает при заболеваниях, связанных с деструкцией соединительной ткани, при туберкулезе, инфаркте миокарда, опухоли головного мозга. Снижение содержания отмечается при пернициозной анемии, болезни Вильсона, дегенеративных процессах центральной нервной системы.

Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов

Нуклеиновые кислоты присутствуют во всех клетках (за исключением эритроцитов) организма человека в виде комплекса с белками, т.е. образуют нуклеопротеиды. Они в большом количестве содержатся в селезенке, зобной железе, печени и других органах и тканях, богатых ядрами. Из этих органов проще выделять и изучать нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты. Нуклеопротеиды делятся на дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП) и рибонуклеопротеиды (РНП), в которых фосфатные группы ДНК или РНК электростатически взаимодействуют с белками. Нуклеиновые кислоты - высокомолекулярные соединения, состоящие из мононуклеотидов, соединенных 3', 5'- фосфодиэфирными связями. Они плохо растворимы в воде, образуя вязкие гелеподобные растворы. Хорошо растворимы в щелочах, растворах минеральных кислот и солей.

Реактивы. Хлорид натрия, 5%-ный раствор, содержащий 0,04% трехзамещенного цитрата натрия; гидроксид натрия, 0,4%-ный раствор; дифениламиновый реактив*; биуретовый реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; ступка с пестиком; стеклянный порошок; пипетки; мерные цилиндры вместимостью 50 и 300 мл; пипетки вместимостью 1 мл; кристаллизатор; деревянные палочки с насечками; водяная баня; круглодонная колба с обратным холодильником; марля для фильтрования.

Материал.

Селезенка, свежая или замороженная.

Выделенный из селезенки дезоксирибонуклеопротеид.

РНК дрожжевая, свежеприготовленный 0,1%-ный раствор.

а. Выделение дезоксирибонуклеопротеида из ткани селезенки. Метод основан на способности дезоксирибонуклеопротеидов растворяться в солевых растворах большой ионной силы и выпадать в осадок при снижении их концентрации.

Ход определения. 2/3 г ткани селезенки тщательно растирают в ступке со стеклянным порошком, приливая постепенно небольшими порциями 35-40 мл раствора хлорида натрия. Полученный вязкий раствор фильтруют через 2 слоя марли в малый кристаллизатор.

Отмеряют цилиндром шестикратный (по отношению к фильтру) объем дистиллированной воды и медленно выливают ее в фильтрат. Образовавшиеся нити дезоксинуклеопротеида осторожно наматывают на деревянную палочку, переносят в пробирку для использования в последующей работе.

б. Качественная реакция на ДНК (реакция Дише). Метод основан на способности дезоксирибозы, входящей в ДНК дезоксирибонуклеопротеида, образовывать соединение синего цвета с дифениламином при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной и концентрированной серной кислот. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание.

Ход определения. К ? части осадка дезоксирибонуклеопротеида приливают 1 мл 0,4%-ного раствора гидроксида натрия (до растворения). Добавляют 0,5 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 15-20 мин.

Аналогичную реакцию выполняют в другой пробирке с 1 мл раствора РНК. Отмечают характерное окрашивание в пробах.

в. Выявление белкового компонента дезоксирибонуклеопротеида (ДНП). Метод основан на биуретовой реакции (описана в работе 1).

Ход определения. Переносят часть полученных ранее нитей ДНП в пробирку, добавляют 0,5 мл раствора гидроксида натрия до растворения нитей и 5 капель биуретового реактива. Наблюдают за появлением окрашивания.

г. Гидролиз дезоксирибонуклеопротеидов.

Ход определения. Оставшуюся часть осадка дезоксирибонуклеопротеидов, полученных из ткани селезенки, помещают в колбочку для гидролиза, добавляют 30-40 мл 5%-ного раствора серной кислоты.

Закрывают колбочку пробкой с обратным холодильником и осторожно кипятят содержимое на асбестовой сетке на медленном огне в течение 30-40 мин. Полученный гидролизат охлаждают и используют для определения составных компонентов ДНК в последующей работе (гидролизат хранить в холодильнике).

Оформление работы. В выводе отметить возможность выделения нуклеопротеидов с помощью солевых растворов и их идентификации с помощью реакций на нуклеиновый компонент.

Практическое значение работы. Выделение и очистку дезоксирибонуклеопротеидов из гомогенатов и ядер клеток с помощью растворов хлорида натрия разной концентрации используют в экспериментальной биохимии. Дифениламиновая проба лежит в основе методов качественного и количественного определения нуклеопротеидов и нуклеиновых кислот в биологическом материале. В клинической цитологии эти реакции применяют при нативной окраске нуклеиновых кислот, например, в мазках клеток крови.

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

При гидролизе нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты распадаются на составные части. Обнаружение и методы количественного определения нуклеиновых кислот и их мономеров (нуклеотидов) в биологическом материале и препаратах основаны на особенностях химической природы этих соединений.

1. Исследование химической природы нуклеиновых кислот

ДНК и РНК, имея сходство в строении, несколько отличаются по составным компонентам: в ДНК содержится тимин, а в РНК - урацил. Кроме того, углеводная часть в ДНК представлена дезоксирибозой, а в РНК - рибозой. Поэтому по специфическим реакциям на эти моносахариды можно выявить соответствующие нуклеиновые кислоты и нуклеотиды.

Работа 14. Качественные реакции на компоненты нуклеиновых кислот

Реактивы. Нитрат серебра, 2%-ный аммиачный раствор*; раствор аммиака, конц.; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор; молибдат аммония, раствор в азотной кислоте*; орциновый реактив*; дифениламиновый реактив*.

Оборудование. Глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 мл; штатив с пробирками; водяная баня.

Материал.

Гидролизат дезоксирибонуклеопротеида (см. работу 13, г).

Лекарственные препараты нуклеотидной природы: фосфаден (аденозинмонофосфат), 2%-ный раствор в ампулах, и аденозинтрифосфат натрия, 1%-ный раствор в ампулах.

а. Проба на пуриновые основания. Метод основан на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором нитрата серебра образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в светло-коричневый цвет.

Ход определения. В пробирку вносят 10 капель гидролизата, помещают в него кусочек лакмусовой бумаги и приливают по каплям примерно 10 капель концентрированного раствора аммиака до щелочной реакции по лакмусу. Добавляют 10 капель аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии образуется осадок с характерной окраской.

б. Дифениламиновая проба на пентозы. Принцип метода см. работу 13, б.

Ход определения. Для определения берут 5 капель гидролизата и проделывают реакцию, как описано в работе 13, б.

в. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. Принцип метода см. работу 11.

Ход определения. Берут 10 капель гидролизата и проделывают реакцию, как описано в работе 11.

г. Качественные реакции на лекарственные препараты нуклеотидной природы. Метод основан на обнаружении рибозы в препаратах нуклеотидной природы с помощью дифениламиновой реакции и пробы с орциновым реактивом. Последняя состоит в том, что фурфурол, образующийся из рибозы при нагревании в среде с соляной кислотой, дает с орцином окрашенное соединение зеленого цвета.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 5 капель соответственно раствора фосфадена и аденозинтрифосфата натрия. К ним приливают по 10 капель дифениламинового реактива, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отмечают результат реакции.

В две другие пробирки вносят по 5 капель тех же веществ и добавляют по 5 капель орцинового реактива. Нагревают в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Отмечают результат реакции.

Оформление работы. По результатам работы сделать вывод о возможности использования реакции для обнаружения компонентов нуклеиновых кислот и нуклеотидов и их применения в практике. Данные оформить в виде таблицы.

Материал	Выявляемый компонент	Реакция	Результат реакции

Практическое значение работы. Реакции на компоненты нуклеиновых кислот и нуклеотиды могут применяться для их идентификации и количественного анализа в биохимических исследованиях, а в фармации - для контроля качества препаратов нуклеотидной и нуклеозидной природы.

2. Количественные методы определения нуклеиновых кислот

Для количественного определения нуклеиновых кислот используют методы, основанные на регистрации их светопоглощения или на специфических реакциях на отдельные компоненты этих соединений. Нуклеиновые кислоты имеют максимум поглощения света при 260 нм, который обусловлен присутствием в них азотистых оснований. Все основания полинуклеотидов обладают тем же максимумом абсорбции, за исключением цитозина, зона наибольшего поглощения которого находится при 270 нм. Поэтому по интенсивности светопоглощения азотистых оснований нуклеотидов можно определить содержание нуклеиновой кислоты в экстрактах из биологического материала или растворах. Однако светопоглощение природной ДНК на 40-50% ниже, чем составляющих ее нуклеотидов. Этот так называемый «гипохромный эффект» связан с двуспиральной структурой природной ДНК. Гипохромный эффект характерен также и для РНК, содержащих спиральные участки или петли.

Учитывая эти особенности нуклеиновых кислот, А.С.Спирин разработал метод измерения светопоглощения гидрализатов ДНК и РНК при двух длинах волн - 270 и 290 нм, поскольку при этих условиях на определение концентрации нуклеиновых кислот практически не влияют различия в их нуклеотидном составе.

Количество нуклеиновых кислот в пробах можно измерить, используя реакции на пентозы с дифениламином и орцином. Однако следует учитывать, что при кислотном гидролизе ДНК разрушается N-гликозидная связь в пуриннуклеотидах, но не в пиримидиннуклеотидах. Поэтому только часть дезоксирибозы становится реакционноспособной, причем величина ее определяется нуклеотидным составом (отношением пуринов к пиримидинам) ДНК.

Практическое значение работ по количественному определению нуклеиновых кислот. Количественное определение нуклеиновых кислот, выделяемых при биохимических исследованиях тканей и клеток, можно проводить прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовой области или с помощью специфических реакций на пентозы: дифениламиновой - на дезоксирибозу, а с орциновой - на рибозу. Эти же методы можно использовать и при хроматографическом разделении пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов или нуклеотидов. Количественные методы определения нуклеиновых кислот применяются в экспериментальной и клинической биохимии, а также для количественного анализа лекарственных средств нуклеотидной или нуклеозидной природы в контрольно-аналитических лабораториях.

Работа 15. Спектрофотометрический метод количественного определения нуклеиновых кислот по А.С. Спирину

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками и капельницами; пипетки вместимостью 2 мл; водяная баня; спектрофотометр.

Материал.

Гидролизат дезоксирибонуклеопротеидов ткани селезенки (полученный в работе 13, г).

РНК дрожжевая, свежеприготовленный раствор.

Метод основан на измерении светопоглощения нуклеиновых кислот при 270 и 290 нм, интенсивность которого пропорциональна их количеству в пробах.

Ход определения. В одну пробирку вносят 1,0 мл гидролизата ДНК, в другую - тот же объем раствора РНК и доводят дистиллированной водой до 1,5 мл.

Добавляют в каждую пробу по 1,5 мл раствора хлорной кислоты, закрывают пробирки капельницами и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 20 мин. Гидролизаты охлаждают. Определяют экстинкцию содержимого каждой пробы на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при 270 и 290 нм.

Расчет. Содержание ДНК рассчитывают по формуле

(Е270 - Е290) · 10,1

х1 = -------------------- ,

0,19

а РНК - по формуле

(Е270 - Е290) · 10,5

х2 = -------------------- ,

0,19

где х1 и х2 - концентрации ДНК и РНК, мг/л;

Е270 - экстинкция исследуемого гидролизата при 270 нм;

Е290 - экстинкция исследуемого гидролизата при 290 нм;

0,19 - удельная экстинкция фосфора нуклеиновых кислот в концентрации 1 мг/л;

10,1 и 10,5 - коэффициенты пересчета содержания фосфора на концентрацию нуклеиновых кислот исходя из теоретического содержания фосфора в ДНК 9,9% и в РНК 9,5%.

Примечание. Предварительно проверяют чистоту образца. Для этого измеряют экстинкцию исследуемых растворов ДНК и РНК при 260, 270 и 290 нм. Отношение Е260/Е270 не должно быть выше 1,2, а отношение Е270/Е290 не меньше 2,0. Если эти условия не соблюдаются, то пробы содержат примеси нуклеиновой природы.

Оформление работы. По результатам измерений отметить чистоту образцов нуклеиновых кислот, рассчитать их концентрацию в исследуемых пробах. В выводе указать возможности данного метода определения содержания нуклеиновых кислот.

Работа 16. Фотоколориметрические методы количественного определения нуклеиновых кислот

Реактивы. Хлорная кислота, 1 М раствор; дифениламиновый реактив*; орциновый реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал.

Гидролизат ДНК ткани селезенки (см. работу 13, г).

ДНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

РНК дрожжевая, опытный раствор.

РНК, стандартный свежеприготовленный раствор концентрации 1 г/л.

а. Определение содержания ДНК (по Дише). Метод основан на образовании окрашенного комплекса дезоксирибозы с дифениламином (см. работу 13, б), интенсивность которого пропорциональна концентрации этой пентозы в гидролизатах ДНК.

Ход определения. В пробирку наливают 0,5 мл стандартного раствора ДНК и равный объем раствора хлорной кислоты. Ставят пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охлаждают содержимое.

Во вторую пробирку вносят 1 мл гидролизата ДНК ткани селезенки (опытная проба), затем прибавляют в обе пробирки по 2 мл дифениламинового реактива Дише. Пробы перемешивают стеклянной палочкой и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 10 мин для развития окраски. Затем содержимое пробирок охлаждают.

Опытную и стандартные пробы фотометрируют против контрольной пробы на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 595 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольную пробу готовят перед фотометрией. Она содержит 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл раствора хлорной кислоты, 2 мл реактива Дише. Кипятят содержимое пробирки в течение 10 мин на водяной бане. Охлаждают.

Расчет. Содержание ДНК в опытной пробе х (г/л) рассчитывают по формуле

Еоп

х = --------

Ест

где Еоп - экстинкция опытной пробы против контрольной;

Ест - экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать концентрацию опытного образца ДНК, указать в выводе возможность использования дифениламиновой реакции для количественного определения ДНК.

б. Определение содержания РНК. Метод основан на образовании окрашенного комплекса рибозы, входящей в состав РНК, с орцином. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации РНК в растворе.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 2 мл соответственно исследуемого (опытного) и стандартного растворов РНК, приливают по 2 мл орцинового реактива и нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. Пробы охлаждают.

Фотометрию опытной и стандартной проб проводят против контрольной на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 670 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Контрольная проба обрабатывается так же, только вместо раствора РНК используется такое же количество дистиллированной воды.

Расчет. Концентрацию РНК в опытном образце х (г/л) рассчитывают по формуле

Еоп

х = ------------

Ест

где Еоп - экстинкция опытной пробы против контрольной;

Ест - экстинкция стандартной пробы против контрольной.

Оформление работы. По экстинкциям рассчитать концентрацию опытного образца РНК, указать в выводе возможность количественного определения РНК по орциновой реакции на пентозы.

ЛИПИДЫ

Липиды - разнородная по химическому строению группа органических веществ биологического происхождения, практически нерастворимых в воде и легко растворимых в органических неполярных (хлороформ, эфир, бензол, дихлорэтан и др.) и полярных (этанол, метанол, ацетон и др.) жидкостях. Разнообразие химического строения липидов затрудняет их классификацию. Эту группу веществ можно разделить на липидные мономеры (жирные кислоты, высшие алифатические и аминоспирты и др.), простые липиды (ацилглицерины, воска, диольные липиды), сложные липиды (фосфолипиды и гликолипиды) и стероиды (наиболее распространенный из них - холестерин и его эфиры). Биологические функции липидов в живых организмах многообразны. Они содержатся в жидких средах и входят в состав биологических мембран клеток организма. Ввиду плохой растворимости в воде липиды образуют соединения с гидрофильными молекулами - белками, углеводами. Образование липид-белковых комплексов (липопротеидов) придает липидам растворимость в воде и позволяет транспортироваться с кровью и лимфой в организме. Своеобразие растворимости используется при исследовании липидов, поскольку позволяет отделить их от других веществ, которые находятся в биологическом материале. Поэтому подбор растворителей в ходе извлечения липидов из образцов имеет большое значение при их анализе.

Для обнаружения и количественного определения отдельных представителей липидов, экстрагированных из биологического материала, существуют различные физико-химические методы и реакции на функциональные группы. Анализ липидов проводят путем постановки специфических реакций на составные части в целой молекуле или после ее гидролиза.

Работа 17. Исследование фосфолипидов

Фосфолипиды содержат высшие насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и их альдегиды, которые соединены эфирной связью с глицерином или сфингозином, фосфорную кислоту и остаточный спирт (холин, этаноламин, серин, инозит). В зависимости от строения различают фосфатидилхолины, фосфатидилинозиты, ацетальфосфатиды, кардиолипин и сфингофосфатиды. Особенно богаты фосфолипидами нервная ткань, желток яиц.

Реактивы. Этиловый спирт; 96%-ный; сульфат кальция (гипс, порошок); ацетон; хлорид калия, насыщенный раствор в 96%-ном этаноле; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; соляная кислота, 10%-ный раствор; гидросульфит калия, безводный порошок; реактив молибдата аммония*; нитрат калия, порошок; карбонат калия, порошок; азотная кислота, 10%-ный раствор; лакмусовая бумага.

Оборудование. Весы аптечные; ступка с пестиком; стеклянные пластинки (100х50 мм); стеклянные палочки; скальпель; глазные пипетки; пипетки вместимостью 2 и 5 мл; воронки с бумажными фильтрами; водяная баня; тигли; сушильный шкаф, отрегулированный на 60?С.

Материал. Головной мозг лабораторного животного.

а. Извлечение фосфатидилхолинов из ткани мозга. Метод основан на экстракции горячим этанолом фосфатидилхолинов из мозга, осаждении их ацетоном и гидролизе в среде с гидроксидом натрия на составные части (жирные кислоты, глицерин, холин и фосфорная кислота).

Ход определения. Помещают навеску 1 г ткани мозга в ступку и тщательно растирают с 2-3 г гипса до получения густой кашицы. Кашицу распределяют тонким слоем на стеклянной пластинке при помощи скальпеля и высушивают в сушильном шкафу при 60?С досуха.

Сухую массу соскабливают со стекла скальпелем в сухую ступку, растирают и затем переносят в сухую пробирку. Приливают 5 мл этанола, пробирку закрывают пробкой с обратным холодильником (стеклянная трубка длиной 70-80 см). Пробирку ставят в водяную баню и нагревают 10-15 мин при 70?С (для экстракции).