Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому

Фосфатазы - ферменты, отщепляющие фосфат от различных субстратов. Среди них имеются энзимы с неодинаковой специфичностью по отношению к субстратам. Щелочная фосфатаза действует в щелочной среде (чем отличается от фосфатаз, осуществляющих катализ в нейтральной или кислой средах) и является малоспецифичной.

Реактивы. в-Глицерофосфат, щелочной раствор на мединаловом буфере с рН 8,6*; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г KH2PO4, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочной кривой).

Оборудование. Штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на фотоколориметрическом определении неорганического фосфора, отщепляемого от в-глицерофосфата под действием фосфатазы сыворотки крови в щелочной среде:

СН2ОН СН2ОН

¦ Фосфатаза ¦

НСЇОЇРО3Н2 + Н2О НСЇОН + Н3РО4

¦ рН 8,6 ¦

СН2ОН СН2ОН

в-глицерофосфат глицерин

Неорганический фосфат определяют по образованию фосфомолибдата аммония с последующим восстановлением его в молибденовую синь аскорбиновой кислотой (см. работу 11).

Ход определения. В две пробирки вносят по 1 мл раствора в-глицерофосфата и помещают на 5 мин в водяную баню при 37?С. Затем в опытную пробирку добавляют 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и отмечают время начала инкубации в водяной бане.

Через 1 час приливают в обе пробирки по 1,8 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную - еще 0,2 мл сыворотки крови. Перемешивают пробы, оставляют стоять 5 мин для осаждения белка. Центрифугируют содержимое обеих проб в течение 5 мин при 3000 об/мин.

Отбирают в чистые пробирки по 1,5 мл надосадочной жидкости (для определения в ней неорганического фосфата Фн) и приливают по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб на ФЭКе, при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против раствора реактивов (1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1,5 мл дистиллированной воды).

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ пробы	Раствор KH2PO4, мл	Н2О, мл	Трихлоруксусн. кислота, мл	Молибдат аммония, мл	Аскорбиновая кислота, мл	Фн в пробе, мг	Активность фермента, ммоль/(ч•л)
1	0,1	0,9	0,5	1,0	1,0	0,001	0,32
2	0,2	0,8	0,5	1,0	1,0	0,002	0,64
3	0,4	0,6	0,5	1,0	1,0	0,004	1,29
4	0,6	0,4	0,5	1,0	1,0	0,006	1,93
5	1,0	-	0,5	1,0	1,0	0,010	3,22

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс - соответствующие единицы щелочной фосфатазы, выраженные в ммоль/(ч•л).

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови в основном у больных с поражениями костной ткани и печени, особенно с явлениями задержки оттока желчи. В норме активность фермента составляет 0,5-1,3 ммоль/(ч•л). Повышение активности в сыворотке крови наблюдается при рахите (гиповитаминозе D), опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механической желтухе, вирусном гепатите и т.д., а снижение - при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.

7. Исследование изоферментов

Изоферменты отличаются друг от друга несколькими физико-химическими признаками и, в частности, зарядом молекул, поэтому электрофорез издавна используется для их разделения. Изоферменты лактатдегидрогеназы были открыты одними из первых.

Различают пять типов изоферментов ЛДГ, которые в порядке подвижности к аноду обозначаются: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5.

Каждый из них представляет собой тетрамер, отличающийся составом субъединиц (см. учебник, с.226, 438).

Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано

Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.

Реактивы. Раствор № 1 для полимеризации геля с рН 8,9 (1,0 М соляная кислота - 48 мл, трис-основание - 36,6 г, N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин, или ТЕМЕД - 0,23 мл и дистиллированная вода до 100 мл); раствор № 2 (акриламид - 30,0 г, N,N-метиленбисакриламид - 0,8 г и дистиллированная вода до 100 мл); персульфат аммония, 0,14%-ный свежеприготовленный раствор; сахароза, 40%-ный раствор; электродный буфер с рН 8,9 (трис-основание - 6,0 г, глицин - 28,8 г, дистиллированная вода до 1 л; перед употреблением разводят в 10 раз); уксусная кислота, 7%-ный раствор; фосфатный буфер, 0,5 М с рН 7,4; лактат натрия, 1 М раствор; НАД, 10 г/л раствор; нитротетразолиевый синий (НС), 1 г/л раствор; феназинметасульфат (ФМС), 1 г/л раствор; хлорид магния, 0,005 М раствор; хлорид натрия, 0,1 М раствор.

Оборудование. Колба коническая вместимостью 25 мл; пипетки с оттянутым тонким концом; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,5 и 10 мл; резиновые колпачки; аппарат для электрофореза со стеклянными трубочками; источник постоянного напряжения; микроденситометр; спектрофотометр или ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.

Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов № 1, № 2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. Смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.

Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги.

Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0.1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки.

Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером.

Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний к катоду (см. рис. 3). В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2 мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4 мА. Длительность электрофореза около 90 мин.

Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида магния, НАД - по 1 мл, фосфатного буфера и НС - по 2,5 мл и ФМС- 0,25 мл. Перемешивают содержимое колбочки.

По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки.

Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8 мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющую жидкость. Пробирки ставят в термостат при 37?С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля.

По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте.

Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-85?С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида.

Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке.

Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:

ЕА100% Е100

х = ------------ , или, упрощенно, х = ------ ,

?Е ?Е

где Е - экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящаяся к данному изоферменту;

?Е - сумма экстинкций всех изоферментов;

А - активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л).

Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления.

Практическое значение работы. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментного спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом органов и тканей. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ1 и ЛДГ2 (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ3, а в скелетной мышце и печени - ЛДГ4 и ЛДГ5 (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ1 - 32, ЛДГ2 - 47, ЛДГ3 - 12, ЛДГ4 - 5, ЛДГ5 - 4. При инфаркте миокарда в сыворотке крови увеличивается доля ЛДГ1 и ЛДГ2 (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.

При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ4 и ЛДГ5. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.

При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ3 в сыворотке крови.

Работа 34. Определение активности г-глутамилтрансферазы в сыворотке крови

Реактивы. L-г-глутамил-п-нитроанилид; натрия хлорид; глицил- глицин*; субстратно-буферный раствор*; уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л; основной калибровочный раствор п-нитроанилида*.

Оборудование. Пипетки на 0,1; 1,0 и 5,0 мл; термостатирующая водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении п-нитроанилида, образующегося из L-г-глутамил-п-нитроанилида при ферментативном переносе L-г-глутамилового остатка на глицил-глицин.

ГТФ

г-глутамил-п-нитроанилид + глицил-глицин

г-глутамил-глицилглицид + п-нитроанилин

Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С. Через 5 минут приливают 0,05 мл сыворотки крови, содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 минут при температуре 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Контрольную пробу ставят также как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400-500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности г-глутамилтрансферазы в сыворотке крови в основном при заболеваниях печени и желчных путей. В норме активность составляет для мужчин 250-1767 нмоль/с·л (15-106 МЕ), для женщин - 167-1100 нмоль/с·л или 10-66 МЕ. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях желчных путей с явлениями обтурации, при гепатитах, опухолях и метастазах в печень. Следует отметить, что увеличение г-глутамилтрансферазы, как правило, увеличивается параллельно активности щелочной фосфатазы, но активность г-глутамилтрансферазы возрастает раньше, остается повышенной более длительное время и относительное увеличение активности фермента в несколько раз выше, чем щелочной фосфатазы. Следует отметить, что наркотики, седативные средства, этанол, стимулируют активность фермента, что используется для диагностики алкогольно-токсических заболеваний печени.

БИОХИМИЯ ПИЩЕВАРЕНИЯ

Пищеварение - это ферментативный гидролиз компонентов пищи. Для оценки его используются методы исследования активности ферментов и других компонентов пищеварительных соков, играющих вспомогательную роль в переваривании питательных веществ, например, соляная кислота, желчные кислоты, ионы кальция и т.д. Отклонения в составе пищеварительных соков или появление в них компонентов, не содержащихся в физиологических условиях, дают важную информацию о патологии пищеварения.

Работа 35. Исследование кислотных компонентов желудочного сока

Реактивы. Гидроксид натрия, 0,1 М раствор; n-диметиламиноазобензол, 0,5%-ный раствор в 36%-ном этаноле; фенолфталеин, 0,5%-ный раствор в 70%-ном этаноле; фенол, 1%-ный раствор; хлорид железа (III), 1%-ный раствор.

Оборудование. Колбы конические вместимостью 25 мл; микробюретка; пипетки вместимостью 1,5 и 10 мл; штатив с пробирками.

Материал. Желудочный сок нормальный и патологический*.

а. Определение содержания соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока. Метод основан на определении кислотных веществ желудочного сока путем титрования их раствором гидроксида натрия с использованием двух разных индикаторов: n-диметиламиноазобензола (имеющего зону перехода окраски при рН 2,3-4,2) и фенолфталеина (имеющего зону перехода окраски при рН 8,2-10,0). По изменению окраски (от красной к оранжевой) индикатора n-диметиламиноазобензола определяется свободная соляная кислота, а по переходу окраски фенолфталеина (от бесцветной к розовой) - общая кислотность желудочного сока.

Ход определения. В одну колбу для титрования вносят 5 мл исследуемого нормального, в другую - патологического желудочного сока. Добавляют 1-2 капли раствора n-диметиламиноазобензола и 2 капли раствора фенолфталеина.

Пробы оттитровывают раствором гидроксида натрия до появления оранжево-красной окраски и отмечают объем щелочи (в мл), пошедший на титрование свободной соляной кислоты (I пункт титрования).

Продолжают титрование до появления лимонно-желтой окраски (II пункт титрования) и снова отмечают объем щелочи, израсходованный с начала титрования до II пункта.

Затем титрование продолжают до появления розовой окраски (III пункт титрования) и отмечают количество щелочи, пошедшее на титрование от начала до III пункта.

Расчет. За единицу кислотности желудочного сока принимается объем 0,1 М раствора гидроксида натрия (в мл), пошедший на титрование 100 мл желудочного сока. Поэтому расчеты кислотности даются на 100 мл.

Например, на титрование 5 мл желудочного сока до I пункта пошло 1,5 мл раствора гидроксида натрия, тогда количество свободной соляной кислоты равно:

1,5 · 100

-------- = 30 ммоль/л, или 30 ед.

5

Для вычисления связанной соляной кислоты необходимо знать общую соляную кислоту. Последнюю определяют на основании данных титрования. Известно, что количество щелочи, необходимое для связывания всей соляной кислоты, равно среднему арифметическому количеству щелочи, пошедшему на титрование до II и III пунктов

Следовательно, если до II пункта титрования пошло, например, 2 мл, а до III - 3 мл щелочи, то среднее арифметическое равно

2+3

-------- = 2,5 мл.

2

Отсюда содержание общей соляной кислоты в 100 мл желудочного сока составит

2,5•100

---------- = 50 ед.

5

Связанная с белками соляная кислота определяется по разнице между количествами общей и свободной соляной кислоты:

50 ед. - 30 ед. = 20 ед.

Кроме того, III пункт титрования служит для определения общей кислотности. Если на титрование 5 мл желудочного сока пошло 3 мл раствора гидроксида натрия, то общая кислотность равна:

3•100

---------- = 60 ед.

5

б. Качественная реакция на молочную кислоту в желудочном соке (проба Уфельмана). Метод основан на способности молочной кислоты в присутствии фенолята железа (III) образовывать малодиссоциирующую соль лактата железа желто-зеленого цвета.

Ход определения. Для приготовления фенолята железа в пробирку вносят 10 мл раствора фенола и добавляют к нему 3 капли раствора хлорида железа FeCl3. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой (развивается фиолетовое окрашивание).

Берут еще две пробирки: в одну наливают 2 мл нормального желудочного сока, а в другую - такой же объем желудочного сока, взятого у больного. Приливают к содержимому обеих проб по 3 мл приготовленного фенолята железа и перемешивают их встряхиванием. Отмечают наличие характерного окрашивания в пробирках.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

Образцы желудочного сока	Индикатор	Количество NaOH, пошедшее на титрование	Пункты титрования	Окрашивание	Соляная кислота	Общая кислотность	Проба на молочную кислоту
					Свободная	Общая	Связанная
Нормальный
Патологический

Сделать вывод о характере изменений кислотности желудочного сока. Указать причины появления молочной кислоты в желудочном соке и практическое значение определения исследуемых веществ.

Практическое значение работы. Переваривание белков во многом зависит от кислотности желудочного сока. В норме общая кислотность равна 40-60 ед., содержание свободной соляной кислоты - 20-40 ед., связанной - 5-20 ед. При патологии кислотность желудочного сока может быть нулевой, повышенной или пониженной. Отсутствие соляной кислоты и пепсина (ахилия) часто наблюдается при злокачественных новообразованиях желудка. Пониженная кислотность (гипохлоргидрия) встречается при гипоацидном гастрите, иногда при язвенной болезни желудка. Повышенная кислотность (гиперхлоргидрия) имеет место при гиперацидном гастрите и часто сопровождается язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Присутствие молочной кислоты указывает обычно на гипоацидный гастрит или рак желудка. В связи с этим определение кислотности желудочного сока и наличие молочной кислоты в нем имеет важное значение для диагностики желудочно-кишечных заболеваний.

Работа 36. Определение кислотности желудочного сока диагностическим набором «Ацидотест»

Реактивы. 25% соляная кислота, набор «Ацидотест».

Оборудование. Штатив с пробирками (диаметр 11-13 мм), пипетки на 5 мл, мерные колбы на 200 мл.

Материал. Контрольная и опытная моча.

Метод основан на освобождении из принятого тест-драже красящего вещества, количество которого зависит от кислотности желудочного сока.

Ход определения. После опорожнения мочевого пузыря обследуемый принимает 1-2 таблетки кофеина, который повышает диурез и усиливает желудочную секрецию. Через 1 час проводится опорожнение мочевого пузыря и полученная моча обозначается как «контрольная». После этого с небольшим количеством воды, без разжевывания, принимается 3 тест-драже. Через 1,5 часа повторно следует опорожнение мочевого пузыря и моча обозначается как «1,5-часовая». Как контрольная моча, так и полученная через 1,5 часа, разбавляется водой до 200 мл. Разбавленную мочу (контрольная и опытная) вносят в количестве 5 мл, добавляют 5 мл 25% раствора соляной кислоты. В пробирке, содержащей 1,5-часовую мочу (опытная проба) в присутствии красящего вещества, появляется окрашивание алого цвета. Интенсивность окрашивания тут же сравнивают с цветной шкалой, т.к. при стоянии цвет изменяется.

Оценка результатов. Совпадение развившегося окрашивания разделению, обозначенному буквой «А» на цветной шкале указывает на наличие свободной соляной кислоты и нормальную кислотность желудочного сока, при более интенсивной окраске - гиперацидность, при окрашивании, соответствующему между разделениями «А» и «В» обозначает гипоацидность.

Оформление работы. Сопоставить развившееся окрашивание с цветной шкалой и сделать вывод о характере кислотности желудочного сока.

Работа 37. Гидролиз белка ферментами пищеварительного тракта

Переваривание белка происходит с участием протеолитических ферментов желудка (пепсин и гастриксин) и кишечника (трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы А и В, аминопептидаза, эластаза и др.). Каждый из ферментов специфически гидролизует пептидные связи, образуемые определенными аминокислотами в полипептидной цепи перевариваемого белка (см. учебник, с.178-181). Оптимум рН действия протеиназ желудка находится в кислой области и равен 1,5-2,0 для пепсина и 3,0-3,5 для гастриксина, в то время как протеолитическая активность ферментов кишечника максимальна при рН 7,6-8,5.

Исследование активности протеолитических ферментов проводится путем анализа скорости гидролиза добавленного белка или определения количества образующихся в ходе реакции пептидов и свободных аминокислот.

Реактивы. Фибрин*; соляная кислота, 0,05 и 0,1 М растворы; гидроксид натрия, 0,4%-ный раствор; карбонат натрия, 0,4%-ный раствор; лакмусовая бумага.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; термостат, отрегулированный на 38?С.

Материал.

Пепсин, свежеприготовленный 0,1%-ный раствор в 0,05 М соляной кислоте.

Трипсин, кристаллический препарат во флаконах, или панкреатин, порошок. Перед употреблением готовят 0,1%-ный раствор.

а. Демонстрация гидролиза белка под действием пепсина. Метод основан на визуальном наблюдении скорости гидролиза белка пепсином, определяемой по растворению кусочков фибрина.

Ход определения. Берут пять пробирок и вносят в первую 1 мл раствора пепсина, во вторую - предварительно прокипяченного раствора пепсина, в третью - раствора соляной кислоты (0,05 М), в четвертую и пятую предварительно нейтрализованного гидроксидом натрия раствора пепсина.

Во все пробирки, кроме пятой, помещают одинаковые небольшие кусочки фибрина и ставят пробы на 20-30 мин в термостат при 38?С, после чего отмечают изменения, произошедшие с волокнами фибрина в первых четырех пробирках.

Пятую пробирку охлаждают и нейтрализуют ее содержимое раствором соляной кислоты по лакмусовой бумажке. Затем приливают в пробирку 1 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и добавляют небольшой кусочек фибрина. Пробу вновь помещают в термостат при 38?С и через 20-30 мин отмечают изменения волокон фибрина.

б. Демонстрация гидролиза белка под действием трипсина. Основа метода та же, что и при изучении действия пепсина.

Ход определения. Берут три пробирки и наливают в одну из них 2 мл раствора карбоната натрия, в другую - дистиллированной воды и в третью - раствор соляной кислоты (0,1 моль/л). В первую и третью пробирки добавляют по 1 мл раствора трипсина (или панкреатина) и во вторую - 1 мл предварительно прокипяченного трипсина (или панкреатина). Перемешивают пробы встряхиванием.

В каждую пробирку помещают по одинаковому кусочку фибрина и ставят их в термостат при 38?С на 10 мин, следя за растворением фибрина. Отмечают изменения, происходящие с фибриновыми волокнами в ходе инкубации.

Оформление работы. Результаты опытов оформить в виде таблицы.

№ пробы	Препарат фермента	Субстрат	Условия опыта	Изменения фибрина
			рН среды	кипячение

В выводах указать оптимальные условия для действия изученных протеолитических ферментов и практическое значение исследований.

Практическое значение работы. Переваривание белка в желудочно-кишечном тракте зависит не только от количества образующихся протеолитических ферментов, но и от условий среды, в которых они действуют. При гипохлоргидрии или анацидном гастрите имеются неблагоприятные условия (недостаток соляной кислоты) для гидролиза пищевого белка пепсином. Применение щелочных растворов (питьевая сода) при данных патологических состояниях приводит к разрушению выделяющегося клетками желудка пепсина. Напротив, гиперхлоргидрия обусловливает более медленную нейтрализацию кислого желудочного содержимого, поступающего в кишечник, и как следствие этого менее эффективную активацию проферментов и переваривающего их действия на белки и пептиды пищи.

Работа 38. Изучение динамики гидролиза триацилглицеринов под действием панкреатической липазы

Основную часть пищевых липидов составляют триацилглицерины, поэтому в переваривании жира наиболее важны условия для действия панкреатической липазы (триацилглицерол-ацилгидролаза; КФ 3.1.1.3). Этот фермент гидролизует только эмульгированный жир в слабощелочной среде. Активатором фермента служат желчные кислоты. Липаза гидролизует преимущественно концевые ацилы молекулы триацилглицерина. Образующийся 2-моноацилглицерин расщепляется карбоксиэстеразой.

В качестве субстрата для изучения активности липазы используют приготовленную жировую эмульсию или молоко, в котором липиды находятся в эмульгированном состоянии.

Реактивы. Коровье молоко; желчь; гидроксид натрия, 0,1 М раствор; фенолфталеин, 0,5%-ный раствор в 76%-ном этаноле.

Оборудование. Колбы вместимостью 100 мл для титрования; микробюретка; водяная баня с лабораторным термометром.

Материал. Панкреатин, свежеприготовленный 5%-ный раствор на 1%-ном растворе гидрокарбоната натрия (рН?8,0).

Метод основан на титриметрическом определении с помощью гидроксида натрия жирных кислот, освобождающихся из триацилглицеринов молока в процессе их гидролиза панкреатической липазой в присутствии и в отсутствие желчи. Реакция протекает по уравнению

Количество образующихся жирных кислот определяется титрованием раствором гидроксида натрия с индикатором фенолфталеином.

Ход определения. В три колбы отмеряют цилиндром по 25 мл коровьего молока и добавляют в первую 2 мл дистиллированной воды, во вторую и третью по 2 мл раствора панкреатина. Кроме того, в третью колбу добавляют 5 капель желчи (1 мл).

Содержимое колб перемешивают и сразу отбирают по 5 мл в другие колбы для титрования (определяют исходный уровень свободных жирных кислот).

Колбы с оставшейся смесью помещают в водяную баню при 37?С и через каждые 15 мин берут по 5 мл их содержимого, переносят в колбы для титрования проб.

К отобранным 5 мл инкубационной смеси в колбы прибавляют по 10 мл дистиллированной воды и по 2 капли раствора фенолфталеина. Оттитровывают их содержимое 0,1 М раствором гидроксида натрия до слабо-розовой окраски жидкости. Отмечают объем гидроксида натрия, пошедший на титрование всех проб.

Оформление работы. Результаты оформить графически: по оси ординат отложить объем раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование всех проб, а по оси абсцисс - время. По полученным на графике трем кривым (1 - без липазы; 2 - с липазой; 3 - липаза и желчь) сделать вывод об относительной скорости гидролиза триацилглицеринов под действием липазы и роли желчи в этом процессе.

Практическое значение работы. При заболеваниях поджелудочной железы, в которой образуется липаза, может нарушаться переваривание жиров, и они выводятся в неизменном виде. Однако чаще всего наблюдается нарушение переваривания жиров при патологии печени и желчевыводящих путей, когда желчь либо не вырабатывается, либо не поступает в кишечник в силу препятствий в желчевыводящих путях. Поскольку желчные кислоты являются активаторами липазы, эмульгаторами жиров, а также участвуют в процессе всасывания жирных кислот, то при их отсутствии резко нарушается процесс переваривания липидов с выделением их в большом количестве с фекалиями (стеаторея). Определение активности липазы применяется в клинике после взятия кишечного сока с помощью зонда для установления причины патологии переваривания липидов. В фармации метод исследования активности липазы необходим для контроля качества лекарственных препаратов (панкреатин, фестал, панзинорм и др.), содержащих этот фермент.

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН (биоэнергетика)

Существует два основных типа энергетики живых организмов - фототрофный и хемотрофный. Первым обладают растения и фотосинтезирующие микроорганизмы, которые преобразуют энергию солнечного света в энергию фосфатных связей АТФ, а вторым - клетки организмов, в том числе человека и животных, использующие для образования АТФ энергию окислительно-восстановительных реакций.

Основная часть энергии в тканях человека и животных образуется аэробным путем в ходе окислительного фосфорилирования в митохондриях. Анаэробное образование энергии происходит в процессе гликолиза (гликогенолиза). Однако он играет вспомогательную роль.

Упрощенно аэробное образование энергии можно представить следующей схемой

Эффективность этого процесса зависит от активности дегидрогеназного звена (т.е. от наличия субстратов окисления S·H2 и активности дегидрогеназ), которое обеспечивает поступление водорода, связанного с НАД или ФАД, на дыхательную цепь митохондрий, а также от сопряжения дыхания и фосфорилирования (см. учебник с.204-214).

1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях

Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани

Цитохромоксидаза, или комплекс цитохромов а + а3, является заключительным компонентом дыхательной цепи митохондрий животных и растительных клеток. Этот фермент переносит электроны на кислород. Он прочно связан с внутренней мембраной митохондрий и извлекается только при ее разрушении. Цитохромоксидаза может окислять ряд синтетических субстратов, например, б-нафтол и N,Nґ-диметил-n-фенилендиамин (реактив НАДИ, названный по первым слогам обоих соединений). Реактив НАДИ используется для обнаружения этого фермента в тканях.

Реактивы. Реактив «НАДИ»*.

Оборудование. Ступка с пестиком; воронка для фильтрования; фильтровальная бумага; ножницы; стеклянные палочки; марля или бинт; пипетки вместимостью 1 мл; мерный цилиндр; водяная баня; аптечные весы с разновесами.

Материал. Мышечная ткань (свежая) забитого животного.

Метод основан на образовании в ходе реакции окисления диметил-n-фенилендиамина и б-нафтола цитохромоксидазой индофенолового голубого, интенсивность синей окраски которого пропорциональна активности фермента.

Ход определения. 5 г мышечной ткани измельчают ножницами и тщательно растирают в ступке, добавляя порциями 20 мл дистиллированной воды. Мышечную кашицу фильтруют через двойной слой марли и многократно промывают дистиллированной водой до бесцветной окраски промывных вод.

Бесцветную массу, которая содержит цитохромоксидазу, комплекс цитохромов и некоторые дегидрогеназы, отжимают между листами фильтровальной бумаги. Полученный остаток кашицы делят на три части: одну переносят в пробирку, а две другие оставляют на фильтровальной бумаге.

К кашице в пробирке приливают 1 мл дистиллированной воды и кипятят содержимое на водяной бане 1 мин. Пробирку охлаждают, осторожно сливают жидкость и мышечную кашицу с помощью стеклянной палочки переносят на другой лист фильтровальной бумаги.

На первую порцию мышечной кашицы (кипяченую) и вторую (некипяченую) наносят по 2-3 капли реактива НАДИ, третью (тоже некипяченую) - сначала смачивают раствором азида натрия, а через 3 мин на нее наносят 2-3 капли реактива НАДИ. Сравнивают характерные окраски проб.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

№ пробы	Материал	Фермент	Субстраты	Условия опыта	Окраска пробы
				температурная обработка	ингибиторы

Практическое значение работы. Цитохромоксидаза как гемсодержащий белок очень чувствительна к действию цианидов, сульфидов, азидов и прочих веществ, взаимодействующих с железом гема. При отравлении этими соединениями происходит угнетение цитохромоксидазы и развивается гистотоксическая гипоксия, т.е. кислородное голодание тканей, связанное с невозможностью использовать кислород как акцептор электронов и протонов в дыхательной цепи митохондрий. Метод выявления цитохромоксидазы реактивом НАДИ используется в клинике и цитологии для выявления этого фермента в биоптатах и мазках клеток крови с целью диагностики нарушений тканевого дыхания.

Работа 40. Демонстрация процесса окислительного фосфорилирования и действия на него разобщителей

Для исследования окислительного фосфорилирования определяют величину поглощения кислорода в тканях и одновременно убыль добавленного в среду неорганического фосфата. Это позволяет вычислить коэффициент фосфорилирования - Р/О. Потребление кислорода тканями при окислении субстратов не является достоверным показателем интенсивности окислительного фосфорилирования, поскольку кислород расходуется и в других, немитохондриальных, реакциях. Кроме того, активная утилизация его еще не означает аналогичного по интенсивности фосфорилирования, т.е. эти два процесса могут быть в той или иной степени разобщены. Использование неорганического фосфата в реакции этерификации: Фн+АДФ>АТФ происходит не только в ходе окислительного фосфорилирования, но и в гликолизе. При отсутствии в среде субстратов гликолиза или при ингибировании его и при создании необходимых условий для функции дыхательной цепи митохондрий можно считать, что почти весь Фн расходуется в ходе окислительного фосфорилирования и его убыль является индикатором этого процесса.

Реактивы. Хлорид калия, 0,15 М раствор; К-фосфатный буфер (рН 7,4), приготовленный из KH2PO4 (содержание неорганического фосфора 0.1 моль/л); малат натрия, 0,16 М раствор; хлорид магния, 0,6 М раствор; фторид натрия, 5,7 М раствор; АДФ, динатриевая соль, 9,1•10-2 М раствор; сукцинат натрия, 0,3 М раствор; 2,4-динитрофенол, 0,01 М раствор; азид натрия, 1 М раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты.

Оборудование. Штатив с пробирками; гомогенизатор с пестиком из тефлона; моторчик для гомогенизации; пипетки вместимостью 1 мл; бюретка вместимостью 25 мл; стеклянные палочки; воронка со складчатым бумажным фильтром; водяная баня с лабораторным термометром или баня аппарата Варбурга; часы; ФЭК.

Материал. Печень белой крысы.

Метод основан на измерении расхода добавленного неорганического фосфата Фн в ходе реакции окислительного фосфорилирования в митохондриях, содержащихся в гомогенатах печени.

Использование Фн в гликолизе блокируется содержащимся в среде инкубации фторидом натрия.

О действии разобщителя (2,4-динитрофенол) и ингибитора (азид натрия) окислительного фосфорилирования также судят по убыли неорганического фосфата в присутствии малата как субстрата окисления.

Неорганический фосфат утилизируется по схеме

H3PO4 + АДФ > АТФ + H2O

Определение содержания Фн до и после инкубации основано на реакции, приведенной в работе 11.

Ход определения. Животное забивают, извлекают печень и погружают ее в чашку Петри с раствором хлорида калия, стоящую на льду или на снегу. Тщательно промывают печень от крови средой выделения и промокают фильтровальной бумагой.

Навеску около 2 г отмытой ткани печени переносят на часовое стекло или в чашку Петри, стоящую на льду, и мелко измельчают ножницами. Измельченную ткань помещают в стакан гомогенизатора, куда предварительно налито 18 мл охлажденного раствора хлорида калия.

Стакан гомогенизатора помещают в лед или снег, находящийся в мешочке.

Ткань гомогенизируют в течение 40-50 с при вращении пестика 800-1200 об/мин, делая 40-50 движений стаканчика вверх-вниз.

В пять пробирок наливают по 1 мл инкубационной смеси следующего состава.

Компоненты	Состав смеси (в мл) в пробирках
	1	2	3	4	5
К-фосфатный буфер (рН 7,4)	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
Малат натрия	0,1	-	-	0,1	0,1
Сукцинат натрия	-	0,1	-	-	-
Хлорид магния	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Фторид натрия	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
АДФ•Na2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Дистиллированная вода	0,3	0,3	0,4	0,2	0,2
2,4-Динитрофенол	-	-	-	0,1	-
Азид натрия	-	-	-	-	0,1

Вносят во все пробы по 2 мл полученного гомогената печени, перемешивают стеклянной палочкой и помещают в штатив водяной бани при 37?С, снабженной устройством для встряхивания пробирок. Отмечают время начала инкубации.

Через 30 мин инкубации реакции во всех пробах останавливают, добавляя к каждой по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое их перемешивают и фильтруют в другие пробирки через складчатый бумажный фильтр.

Из каждой пробы отбирают по 1 мл безбелкового фильтрата в чистые пробирки и приливают к ним по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой, затем из бюретки добавляют по 7 мл дистиллированной воды и вновь перемешивают. Оставляют стоять 5 мин для развития окрашивания.

Перед фотометрией готовят стандартную пробу, для чего в пробирку вносят 0,1 мл фосфатного буфера, 0,9 мл трихлоруксусной кислоты, 1 мл реактива молибдата аммония и 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Содержимое перемешивают, затем добавляют из бюретки 7 мл дистиллированной воды и опять перемешивают. Оставляют стоять 5 мин для развития окрашивания.

Фотометрируют опытную и стандартную пробы против контрольной (1 мл трихлоруксусной кислоты и 9 мл дистиллированной воды) на ФЭКе при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание неорганического фосфора х (в мкмоль) в пробах рассчитывают по формуле

Еоп•10

х = ----------

Ест

где Еоп - экстинкция опытной пробы;

Ест - экстинкция стандартной пробы;

10 - количество неорганического фосфора в стандартной пробе, мкмоль.

Убыль Фн рассчитывают по разнице между количеством его в стандартной и соответствующей опытной пробах.

Оформление работы. Полученные данные внести в таблицу.

№ пробы	Субстрат окисления	Разобщители и ингибиторы	Содержание Фн в пробе, мкмоль	Убыль Фн, мкмоль

В выводе указать возможность протекания окислительного фосфорилирования без субстрата окисления и особенность действия на него разобщителей и ингибиторов; отметить практическое значение обнаруженных феноменов.

Практическое значение работы. Клетки и ткани организма человека отличаются друг от друга скоростью дыхания и связанного с ним фосфорилированием. Наиболее активное окислительное фосфорилирование отмечается в тканях, богатых митохондриями, например, в почках, сетчатке глаза, корковом веществе головного мозга, сердце, печени; менее развит этот процесс в скелетных мышцах, коже, а в эритроцитах человека он вообще отсутствует. В клинико-биохимических исследованиях используются методы определения окислительного фосфорилирования в лейкоцитах крови и биоптатах для оценки энергетического обмена при различных патологических состояниях, а также для изучения действия лекарств и ядов, которые могут проявлять свойства разобщителей или ингибиторов.

Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани

Для оценки вклада гликолиза в энергетику клеток измеряют скорость этого процесса при оптимальных условиях. С этой целью добавляют в среду, содержащую исследуемый материал (клетки, срезы или кусочки тканей, гомогенат ткани), один из субстратов гликолиза (гликогенолиза), чаще всего глюкозу, гликоген, фруктозобисфосфат и др., необходимые кофакторы и создают анаэробные условия. Обязательным компонентом при изучении скорости гликолиза является неорганический фосфат, который расходуется в этом процессе на образование АТФ из АДФ. Индикаторами гликолиза служат скорость убыли глюкозы или накопления молочной кислоты, а также потребление Фн при анаэробном распаде углеводов в тканях.

Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,0*; глюкоза, 10 г/л раствор, свежеприготовленный; трихлоруксусная кислота, 100 г/л раствор; сульфат меди (II), 100 г/л раствор; серная кислота, конц.; гваякол, 1,0 г/л раствор в 70%-ном этаноле; о-толуидиновый реактив*; фторид натрия, 3 М раствор; вазелиновое масло; оксид кальция, порошок, навески по 0,25 г в бумажных пакетиках.

Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; глазные пипетки; воронки со складчатыми бумажными фильтрами; стеклянные палочки; аптечные весы с разновесами.

Материал. Мышечная ткань (свежая) забитого животного.

Метод основан на выявлении убыли глюкозы и накопления молочной кислоты в среде под действием ферментов гликолиза мышечной ткани в присутствии и в отсутствие фторида натрия, являющегося ингибитором гликолиза. Глюкоза обнаруживается по реакции с о-толуидином, в результате чего образуется окрашенное соединение зеленого цвета при нагревании в среде с уксусной кислотой. Молочная кислота при нагревании с концентрированной серной кислотой превращается в ацетальдегид, дающий с гваяколом характерное красное окрашивание.

Ход определения. В три пробирки отмеривают по 2 мл фосфатного буфера и по 1 мл раствора глюкозы. Затем в первую пробу добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а во вторую - 0,2 мл раствора фторида натрия.

Мышечную ткань мелко измельчают ножницами и вносят во все пробирки по 1 г мышечной кашицы, содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой и приливают 10 капель вазелинового масла (для защиты от кислорода воздуха). Пробирки выдерживают на водяной бане при 37?С в течение 30 мин. После инкубации во вторую и третью пробы добавляют по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают.

Содержимое всех пробирок фильтруют через бумажный фильтр в чистые пробирки. С фильтратом проделывают реакции на глюкозу и молочную кислоту.

Для проведения реакции на глюкозу берут по 0,1 мл фильтрата, переносят его в чистые пробирки и добавляют в них по 0,4 мл воды и по 2,0 мл о-толуидинового реактива. Помещают пробирки в водяную кипящую баню на 8 мин, после чего охлаждают под струей холодной воды. Сравнивают интенсивность окраски исследуемых проб.

Для проведения реакции на молочную кислоту к оставшемуся фильтрату в обеих пробах добавляют по 5 капель раствора сульфата меди и по 0,25 г оксида кальция (для осаждения углеводов, которые мешают обнаружению молочной кислоты). Пробы оставляют стоять 10 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая их. Затем содержимое пробирок фильтруют через бумажный фильтр в две чистые пробирки, помещенные в лед или снег. Отбирают по 10 капель фильтрата и осторожно добавляют в каждую из них по 30 капель концентрированной серной кислоты. Все пробирки помещают на 5 мин в кипящую водяную баню (для превращения молочной кислоты в ацетальдегид). Затем пробирки охлаждают и добавляют по 2 капли спиртового раствора гваякола. Через 20 мин сравнивают интенсивность окрашивания в пробах.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

Исследуемая проба	Субстрат	Ингибитор	Реакция на глюкозу	Реакция на молочную кислоту

Сделать вывод о наличии гликолиза в мышечной ткани и о методических подходах к его изучению.

Практическое значение работы. При анаэробном распаде углеводов образуется две молекулы АТФ на одну молекулу расщепленной глюкозы, что является важным дополнительным источником образования энергии. В эритроцитах гликолиз является единственным способом производства энергии. В анаэробных условиях, когда организм испытывает недостаток кислорода, этот путь образования энергии является основным для сохранения жизнедеятельности тканей. В эксперименте и клинике определение скорости гликолиза в клетках крови и биоптатах широко используется для оценки образования энергии анаэробным путем. Кроме того, этот метод позволяет изучить механизм действия различных лекарственных препаратов и ядов, которые могут оказывать отрицательное действие, блокируя одну из стадий ферментативного процесса.

Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии

Реактивы. Стеклянные пластинки (9х12 см) с нанесенным тонким слоем диэтиламиноэтилцеллюлозы (ДЭАЭ-целлюлоза), являющейся анионообменной смолой; соляная кислота, 0,02 М раствор.

Оборудование. Химический стакан; глазная пипетка; лист белой бумаги; вентилятор; хроматоскоп.

Материал. Аденозинтрифосфат натрия, 1%-ный раствор для инъекций.

Метод основан на эффекте ионного обмена, состоящего в том, что адениннуклеотиды, имеющие отрицательный заряд, взаимодействуют с положительными группами ДЭАЭ-целлюлозы (неподвижная фаза), а при прохождении по адсорбенту раствора соляной кислоты нуклеотиды замещаются на анионы Cl?. При этом легче всего вытесняется АМФ, из-за чего он продвигается дальше всех, затем АДФ и АТФ, который остается рядом с линией старта Методика модифицирована В.И.Глобиным.. Просматривают хроматограмму в ультрафиолетовом свете, в котором нуклеотиды, вследствие поглощения при 260 нм, выглядят в виде темных пятен.

Ход определения. Стеклянную пластину с ДЭАЭ-целлюлозой кладут адсорбентом вверх на лист белой бумаги и, отступив от края пластинки на 2 см, проводят простым карандашом линию старта, а в центре очерчивают кружок диаметром 3-4 мм для нанесения исследуемой пробы. Наносят глазной пипеткой каплю раствора натрия аденозинтрифосфата в центр кружка и подсушивают пятно на воздухе в течение 5 мин с помощью вентилятора.

В химический стакан, который используют как хроматографическую камеру, наливают раствор соляной кислоты так, чтобы слой жидкости был высотой примерно 1 см. Опускают конец пластинки с нанесенной пробой в раствор соляной кислоты. Для герметичности стакан закрывают лоскутом резиновой перчатки, натянув его и закрепив с помощью резинового колечка.

После того как фронт растворителя достигает верхнего края пластинки, ее вынимают из стакана и подсушивают на воздухе с помощью вентилятора. Хроматограмму помещают в хроматоскоп и в ультрафиолетовом свете очерчивают простым карандашом темные пятна разделившихся адениннуклеотидов.

Оформление работы. Зарисовать положение пятен адениннуклеотидов на хроматограмме и сделать вывод о качестве исследуемого препарата АТФ для инъекций.

Практическое значение работы. Разделение нуклеотидов методом тонкослойной ионообменной хроматографии используется для изучения состава нуклеотидов и определения их содержания в тканях, а также для расчета энергетического заряда адениловой системы в норме и при различных патологических состояниях. В фармации этот метод используется для контроля качества препаратов, содержащих адениннуклеотиды.

Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу

Реактивы. Креатинфосфат, 0,006 М раствор; аденозиндифосфат динатриевая соль, 6,0 г/л раствор; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,2, содержащий 0,1 моль/л хлорида магния; сульфат цинка, 50 г/л раствор; гидроксид бария, 50 г/л раствор; щелочной реактив, содержащий 160 г/л карбоната натрия и 60 г/л гидроксида натрия; диацетил, рабочий раствор; б-нафтол, 10 г/л раствор; креатин, стандартный раствор концентрации 0,1 ммоль/л.

Примечание. Все перечисленные реактивы, кроме трис-буфера, готовят перед употреблением.

Оборудование. Штатив с пробирками; стеклянные палочки; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня с лабораторным термометром; центрифуга лабораторная с центрифужными весами.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении креатина, образующегося из креатинфосфата под действием креатинфосфокиназы, об активности которой судят по количеству выявляемого креатина.



Креатин образует с диацетилом и б-нафтолом комплексное соединение, интенсивность розовато-желтой окраски которого пропорциональна концентрации креатина.

Ход определения. В две пробирки последовательно вносят следующие реактивы (объемы растворов указаны в миллилитрах):

Реактив	Опытная пробирка	Контрольная пробирка
Трис-буфер	0,2	0,2
Дистиллированная вода	0,2	0,3
Креатинфосфат	0,1	0,1
Сыворотка крови	0,1	-

Обе пробирки помещают на 3 мин в водяную баню при 37?С, не вынимая из бани, прибавляют в них по 0,2 мл раствора АДФ (запускают креатинкиназную реакцию). Отмечают время начала инкубации.

Через 30 мин реакцию останавливают, последовательно добавляя в обе пробы по 0,2 мл гидроксида бария и сульфата цинка. Содержимое пробирок охлаждают и оставляют стоять 10 мин (для осаждения белка). Затем осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5-10 мин.

Отбирают по 0,5 мл надосадочной жидкости в две чистые пробирки и приливают в них по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл раствора б-нафтола и по 0,5 мл рабочего раствора диацетила. Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают на 20 мин в темное место для развития окрашивания.

Перед фотометрией готовят стандартную пробу и контроль стандарта. Для этого в одну пробирку (стандартная проба) вносят 0,5 мл раствора креатина, 3 мл дистиллированной воды, 1 мл б-нафтола и 0,5 мл рабочего раствора диацетила, а в другую (контроль стандарта) - те же реактивы, только вместо раствора креатина добавляют 0,5 мл дистиллированной воды. Обе пробирки выдерживают в темноте 20 мин.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной и стандартной против контроля стандарта на ФЭКе при 520-540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см.

Расчет. Активность креатинфосфокиназы рассчитывают по формуле

0,00005Еоп1,2•2•10000

х = ------------------------ ,

Ест0,5

где х - активность креатинфосфокиназы, ммоль/(ч•л);

0,00005 - содержание креатина в стандартной пробе, ммоль;

Еоп - экстинкция опытной пробы против контроля;