Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 2 и 5 мл; алюминиевая фольга; водяная баня; ФЭК.

Материал.

Сыворотка крови.

Моча, собранная за сутки, профильтрованная и разведенная перед анализом водой в 25 раз.

а. Определение содержания мочевины в сыворотке крови. Метод основан на способности мочевины в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в сильнокислой среде образовывать с диацетилмонооксимом соединение красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в исследуемой жидкости.

Ход определения. В опытную пробирку отмеривают 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки крови, в стандартную - такой же объем стандартного раствора мочевины и в контрольную - 0,1 мл дистиллированной воды. Добавляют во все пробирки по 2 мл цветного реактива и тщательно перемешивают их содержимое встряхиванием.

Все пробирки закрывают крышечкой из алюминиевой фольги и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин (точно!). Затем охлаждают их под струей холодной воды.

Измеряют экстинкцию стандартной и опытной проб против контрольной на ФЭКе при 540-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Примечание. Окраска неустойчива, поэтому измерение необходимо провести в течение 15 мин.

Расчет. Содержание мочевины х (ммоль/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

Еоп16,65•10

х = ---------- ,

Ест

где Еоп - экстинкция опытной пробы против контрольной;

Ест - экстинкция стандартной пробы против контрольной;

16,65 - концентрация мочевины в стандартной пробе, ммоль;

Азот мочевины (в ммоль/л) рассчитывают, разделив полученное значение содержания мочевины в сыворотке на 2,14 (число, выражающее отношение молекулярной массы азота мочевины к массе всей молекулы мочевины).

б. Определение содержания мочевины в моче. Принцип метода тот же, что и в предыдущей работе.

Ход определения. Для анализа используют 0,1 мл разведенной мочи и 0,1 мл стандартного раствора мочевины и обрабатывают эти пробы так же, как и сыворотку крови.

Расчет проводят по формуле

 ЕопV25•1,665

х = ---------- ,

Ест0,1•1000

где х - количество мочевины, ммоль/сут;

V - объем суточной мочи;

1,665 - содержание мочевины в 0,1 мл стандартной пробы, мкмоль;

Еоп - экстинкция опыта;

Ест - экстинкция стандарта;

0,1 - объем мочи, взятый на исследование, мл;

1000 - коэффициент пересчета мкмоль в ммоль.

в. Определение содержания мочевины в сыворотке крови экспресс-методом с помощью набора «Уреатест». Метод основан на способности уреазы разлагать мочевину с образованием аммиака, который окрашивает полоску реактивной хроматографической бумаги в голубой цвет. Высота окрашенной зоны пропорциональна концентрации мочевины, которую рассчитывают по калибровочному графику.

Ход определения. Сыворотку крови разводят водой в отношении 1:1. На пропитанный ферментом конец бумажной полоски в 3 мм от красной парафиновой полосы наносят специальной пипеткой 0,03 мл разведенной сыворотки крови. Полоску тотчас помещают в чистую сухую пробирку, герметически закрывают ее пробкой и ставят в термостат при 37?С. Через 20 минут полоску извлекают, измеряют высоту окрашенной в голубой цвет зоны.

Расчет. По калибровочному графику, входящему в набор «Уреатест», находят концентрацию мочевины в сыворотке крови.

Оформление работы. Сделать расчет содержания мочевины и азота мочевины в исследуемой сыворотке и моче. В выводе отметить возможные изменения в азотном обмене.

Практическое значение работы. В норме содержание мочевины в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,0 ммоль/л, а азота мочевины - 1,2-3,7 ммоль/л. Содержание мочевины в сыворотке крови значительно колеблется в зависимости от приема белков с пищей. Повышение уровня мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (когда нарушена их выделительная функция), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, а также в случае обезвоживания организма (в данном случае имеет место относительная, а не абсолютная форма азотемии). Снижение уровня мочевины в крови и выделения ее с мочой (в сутки в норме выделяется 333-582,8 ммоль/сут) наблюдается при заболевании печени (паренхиматозная желтуха, дистрофия печени, цирроз), что связано с нарушением мочевинообразовательной функции.

Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина по методу Брауна

Реактивы. Пикриновая кислота, насыщенный раствор*; соляная кислота, 0,1 моль/л; основной калибровочный раствор креатинина*; 12,5% раствор едкого натрия.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки на 0,2; 1,0; 2,0 и 5,0 мл; ФЭК; водяная баня.

Материал. Исследуемая моча.

Принцип метода. Основан на способности креатинина в щелочной среде с пикриновой кислотой образовывать комплекс оранжевого цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации креатинина. Определение креатина проводится после перевода его в креатинин при нагревании мочи в солянокислой среде.

Ход определения. В три меченные обычные пробирки внести по 0,2 мл концентрированной соляной кислоты (осторожно, только пипеткой с резиновой грушей!). В 1-ю и 2-ю пробирки добавить по 0,2 мл исследуемой мочи, предварительно разведенной в 5 раз: 1 пробирка служит для определения креатинина, 2 - креатина, 3 - контрольная. Вторую пробирку нагреть в течение 5 минут на бурно кипящей водяной бане, после чего охладить под струей водопроводной воды. Во все пробирки внести дистиллированную воду в следующих количествах: первая пробирка - 2,0 мл, вторая - 2,0 мл, третья - 2,2 мл и в каждую добавить по 0,6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и по 1,0 мл 12,5% раствора гидроксида натрия, тщательно перемешивают. Оставляют стоять на 10 минут при комнатной температуре, после чего во все три пробирки добавляют по 6,0 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность исследуемых растворов определяли на ФЭКе с длиной волны 507 нм в кювете на 10 м против контрольной пробы (третья пробирка). Количество определялось по калибровочному графику.

Расчет. Находят содержание свободного креатинина в первой пробирке по калибровочному графику, а затем, используя нижеприведенную формулу, проводят расчет:

a•5•1000•5

х = -------------- ,

1000•1000

где х - количество креатинина в г на 1 л мочи;

а - количество креатинина в мкг в 0,2 мл разведенной мочи, взятой для анализа;

5 - разведение мочи;

5 - для перевода количества креатинина с 0,2 мл мочи на 1 мл;

1000 - перерасчет на 1 л, числитель;

1000 - для перевода мкг в мг, знаменатель;

1000 - для перевода мг креатинина в г, знаменатель.

Расчет креатина - вторая пробирка содержит сумму свободного креатинина и креатинина, переведенного из креатина при нагревании в солянокислой среде. Из количества креатинина, полученного при определении суммы креатин-креатинин, вычитают количество параллельно исследуемого свободного креатинина и полученную разность умножают на 1,16 - коэффициент перевода креатинина в креатин.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора креатинина готовят разведение, как указано ниже:

Оформление работы. Рассчитать содержание креатина и креатинина в исследуемой пробе и в выводах дать оценку полученным результатам, сравнивая с нормой.

Практическое значение работы. Креатинин, наряду с мочевиной и солями аммония являются нормальными продуктами азотистого обмена и на его долю приходится около 2,5-7% всего азота мочи. Креатинина в норме выделяется с мочой: 4,4-17,7 ммоль/сутки или 0,5-2,0 г/сутки. В норме моча взрослых людей креатина не содержит. У детей имеет место физиологическая креатинурия, поэтому в моче он обнаруживается в небольших количествах. Появление креатина в моче взрослого человека связано с нарушением обмена креатина и наиболее часто встречается при поражении мышечной ткани (мышечная дистрофия, мышечная атрофия, миастения, миозит, миотония), Е-авитаминозе, при тонических судорогах, усиленном распаде тканевых белков. При этом содержание креатинина в моче понижается.

2. Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов

Распад нуклеиновых кислот и их мономеров до конечных продуктов можно выразить следующей схемой:

Нуклеиновые > Нуклеотиды > Пурины, > Мочевая кислота, кислоты пиримидины в-аланин и аммиак

О состоянии нуклеинового и нуклеотидного обмена судят по активности ферментов, участвующих на разных стадиях их распада и превращения, а также по содержанию мочевой кислоты - конечного продукта обмена пуриновых оснований.

Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в сыворотке крови по А.А. Покровскому, А.И. Арчакову и О.Н. Любимцевой

Реактивы. ДНК, 1 г/л раствор в ацетатном буфере, 0,1 М с рН 5,0; хлорная кислота, 0,5 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; термостат, отрегулированный на 37?С; холодильник; центрифуга с центрифужными весами; часы; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на спектрофотометрическом измерении при 260 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК, образующихся под действием ДНКазы, содержащейся в исследуемом материале:

ДНК, ДНКаза

высокополимерная -------- (n + 1) фрагментов ДНК

+ nН2О

Ход определения. В опытную и контрольную пробирки отмеривают по 1,2 мл раствора ДНК. Затем в опытную пробу добавляют 0,2 мл сыворотки крови и перемешивают содержимое встряхиванием.

Помещают обе пробы на 30 мин в термостат при 37?С, после чего в контрольную пробирку приливают 1,6 мл хлорной кислоты и 0,2 мл сыворотки крови, а в опытную - такой же объем хлорной кислоты. Содержимое проб перемешивают.

Ставят пробирки на 30 мин в холодильник при 4?С, а затем обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин (для осаждения негидролизованной ДНК). Надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 260 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формуле

х =Е2602•500 ,

где х - активность ДНКазы в Е260/г•л;

2 - коэффициент пересчета на 1 час;

500 - коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемом материале, сделать вывод о присутствии кислой ДНКазы в сыворотке крови и практическом значении работы.

Практическое значение работы. Кислая ДНКаза сосредоточена в лизосомах клеток различных тканей, поэтому в научных исследованиях определение этого энзима используют для контроля чистоты выделяемой фракции лизосом. Кроме того, кислая ДНКаза является индикатором повреждения или повышенной проницаемости мембран лизосом, что имеет практическое значение при оценке действия лизосомотропных препаратов и патологического процесса.

Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта

Реактивы. Реактив Фолина*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; карбонат натрия, насыщенный раствор; мочевая кислота, стандартный раствор 0,02 мг/мл, свежеприготовленный.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфорновольфрамовый реактив (реактив Фолина) с образованием соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации данной кислоты.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят по 1,5 мл сыворотки крови, дистиллированной воды и трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают, через 5 мин центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин.

Берут две чистые градуированные пробирки: опытную и стандартную; добавляют в них реактивы в соответствии с таблицей.

Через 10 мин обе пробы фотометрируют против воды на ФЭКе при 510-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет проводят по формуле

 Еоп0,01•2000

х = ---------- ,

Ест168

где х - содержание мочевой кислоты в сыворотке крови, ммоль/л;

Еоп - экстинкция опытной пробы;

Ест - экстинкция стандартной пробы;

0,01 - масса мочевой кислоты в пробе стандартного раствора, взятого для реакции, мг;

2000 - коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

168 - молекулярная масса мочевой кислоты.

Оформление работы. Рассчитать содержание мочевой кислоты в сыворотке крови и сделать вывод о возможных изменениях пуринового обмена.

Практическое значение работы. В норме содержание мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,10-0,40 ммоль/л, а с мочой выделяется 2,36-5,9 ммоль в сутки. Повышенное содержание мочевой кислоты наблюдается в крови и моче при многих патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеидов (лейкозах, диабете, аллергии и др.). Резко увеличивается концентрация мочевой кислоты при подагре, это сопровождается отложением солей мочевой кислоты в суставах и различных тканях организма. Понижение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови отмечается при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов и кортикотропина (АКТГ).

3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена

Для оценки состояния порфиринового обмена используют определение пигмента билирубина, являющегося продуктом распада гемпротеидов. Существуют два типа билирубина: неконъюгированный (свободный, который с диазореактивом дает непрямую реакцию, т.е. после растворения в этаноле) и конъюгированный (связанный с глюкуроновой кислотой, который сразу реагирует с диазореактивом). По соотношению фракций билирубина судят об изменении пигментного обмена.

Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу

Реактивы. Кофеиновый реактив*; хлорид натрия, 9 г/л раствор; диазореактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина давать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розовато-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разнице между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного билирубина.

Ход определения. В три пробирки вносят согласно таблице необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного - на 5-10 мин (при длительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин).

По истечении указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭКе при 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина вычитают экстинкцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят по ним содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику (рис. 11). Свободный (неконъюгированный) билирубин рассчитывают по разнице между величинами общего и связанного билирубина.

Оформление работы. Рассчитать содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и сделать вывод о причине возможных отклонений этих показателей в исследуемом материале.

Практическое значение работы. В норме концентрация общего билирубина в сыворотке крови составляет 8,0-20,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю неконъюгированного (свободного) билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% - на долю конъюгированного (связанного) билирубина (2,0-5,0 мкмоль/л). Исследование содержания билирубина проводится в клинике для дифференциальной диагностики желтух. Желтушная окраска кожных покровов проявляется при уровне билирубина в крови выше 27 мкмоль/л. При надпеченочных желтухах (гемолитические анемии, желтуха новорожденных и др.) увеличивается содержание свободного билирубина в крови, при печеночных желтухах, возникающих вследствие поражения собственно клеток печени, повышается концентрация связанного билирубина в крови, а при подпеченочных желтухах, к которым относится механическая, наблюдается возрастание уровня как свободного, так и, в большей степени, связанного билирубина.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПАТОЛОГИЯ

Биохимические исследования с целью выявления молекулярных болезней чрезвычайно важны в педиатрии, поскольку своевременная диагностика их помогает раннему лечению с более благоприятным исходом. При ферментопатии блокируется цепь биохимических превращений в тканях, поэтому ранним признаком такого заболевания является накопление в крови и повышенное выделение с мочой веществ, служащих субстратом для поврежденного ферментного белка. В то же время концентрация продуктов данной ферментативной реакции в биологических жидкостях понижена. Поэтому первоначально у больных с подозрением на молекулярную патологию ставят качественную реакцию на вещества, накопления которых ожидают. При положительных пробах проводят их количественное определение. Для уточнения энзимопатии исследуется качественно и количественно соответствующий фермент в сыворотке и клетках крови, а также в биоптатах.

1. Экспресс-диагностика патологии аминокислотного обмена

Работа 66. Выявление гипераминоацидурии

Реактивы. Нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне с добавлением 1 мл концентрированной уксусной кислоты на 100 мл жидкости; глицин, стандартный 20 мМ раствор.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х40 мм; сушильный шкаф, отрегулированный на 60?С; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая*.

Принцип метода см. работу 1, б.

Ход определения. В трех пробирках готовят серию разведений стандартного раствора глицина в 2,5 и 10 раз, при этом концентрация азота глицина в пробах составляет соответственно 10,4 и 2 ммоль/л.

На две полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле соответственно нормальной и патологической мочи, а еще на четыре - по 1 капле неразведенного и разведенного в 2,5 и 10 раз стандартного раствора глицина. Пятна подсушивают на воздухе.

На высушенные пятна наносят по 1-2 капли раствора нингидрина, подсушивают на воздухе и затем помещают полоски на 15 мин в сушильный шкаф при 60?С, подвешивая их на крючках.

Сравнивают интенсивность окраски проб нормальной и патологической мочи с окраской глицина на полосках фильтровальной бумаги. Цветная шкала соответствует следующим концентрациям глицина: 20. 10, 4, 2 ммоль/л.

Оформление работы. Оценить примерное содержание азота аминокислот в нормальной и патологической моче. Сделать вывод о наличии гипераминоацидурии у больного ребенка и указать возможные ее причины.

Практическое значение работы. В норме экскреция азота аминокислот составляет 0,29-5,35 ммоль/сут. У ребенка его выделяется 0,07-0,15 ммоль/кг массы тела в сутки, причем 2/3-3/4 этого количества экскретируется в ночное время. Гипераминоацидурия наблюдается при молекулярных болезнях, возникающих вследствие дефекта белков эпителия канальцев почек, переносящих аминокислоты и способствующих их реабсорбции, или в результате нарушения обмена аминокислот в тканях. Окончательно наследственная причина гипераминоацидурии устанавливается после исключения ряда заболеваний (цирроз печени, гепатиты, дистрофия, рахит и т.д.), тоже приводящих к повышенному выделению аминокислот с мочой.

Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии

Фенилкетонурия, или фенилпировиноградная олигофрения, связана с дефектом фермента фенилаланингидроксилазы, вследствие чего нарушается превращение фенилаланина в тирозин. При этом увеличивается содержание фенилаланина и продуктов его обмена (в частности, фенилпировиноградной кислоты) в крови и моче.

Реактивы. Фенилаланин, стандартный раствор 0,06 г/л; растворитель (бутанол, уксусная кислота и вода в соотношении 15:15:10); нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне; хлорид железа (III), 10%-ный раствор; набор «Биофан П» (ГДР), содержащий индикаторную бумагу с цветной шкалой.

Оборудование. Хроматографическая бумага 11х11; микропипетки; чашка Петри; ножницы; сушильный шкаф, отрегулированный на 90-100?С; фильтровальная бумага; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; глазные пипетки.

Материал.

Моча, нормальная и патологическая, содержащая фенилпировиноградную кислоту.

Плазма крови здорового и больного человека с повышенным содержанием фенилаланина.

а. Экспресс-определение фенилаланина в плазме крови методом бумажной радиальной хроматографии. Метод основан на различной скорости передвижения фенилаланина по хроматографической бумаге вследствие разности коэффициентов распределения его между неподвижной и подвижной фазами растворителя. Положение аминокислот на хроматограмме, которая представлена в виде концентрических кругов, выявляется нингидриновой реакцией.

Ход определения. Складывают квадрат хроматографической бумаги вчетверо и делают вырез в центре его диаметром около 1 см.

Квадрат хроматографической бумаги простым карандашом делят на секторы, нумеруют их от 1 до 4, отступив от центра выреза на 1 см, и намечают карандашом в каждом секторе кружки для нанесения проб. Помещают квадрат на ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки высотой 2 см и вставленную в центральный вырез.

Наносят микропипеткой в обведенный кружок 1-го сектора 0,02 мл стандартного раствора фенилаланина, затем подсушивают пятно с помощью вентилятора и на высушенное место наносят 0,02 мл плазмы крови здорового человека; в кружок 2-го сектора наносят 0,02 мл плазмы здорового человека и 3-й сектор - 0,02 мл плазмы обследуемого больного пациента. Оставляют бумагу на воздухе до полного высыхания нанесенных проб.

В чашку Петри наливают растворитель, кладут бумажный квадрат на края чашки Петри, при этом конец ножки погружается в растворитель. Закрывают чашку крышкой и оставляют при комнатной температуре, пока фронт растворителя не достигает диаметра около 5 см (отметку карандашом сделать заранее). После этого хроматограмму высушивают в сушильном шкафу при 90-100?С, опрыскивают ее раствором нингидрина и вновь помещают в сушильный шкаф на 10 мин.

В отрицательных пробах (содержание фенилаланина ниже 0,07 г/л) окрашивается пятно нанесенной плазмы и небольшая окружающая часть. Пятно со стандартным раствором фенилаланина (0,06 г/л) и плазмой здорового человека (0,01 г/л) содержит в сумме 0,07 г/л фенилаланина. Исследуемые образцы, дающие такой же или больший ореол, считают положительными. В пробах, взятых у больных фенилкетонурией, обнаруживается четкий ореол диаметром около 3,5 см.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, сравнить величину окрашенных зон в трех секторах и сделать вывод относительно изменений у больного пациента.

б. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче. Метод основан на взаимодействии енольной формы фенилпировиноградной кислоты с хлоридом железа FeCl3 с образованием комплексного соединения сине-зеленого цвета.

Ход определения. В одну пробирку наливают 0,5 мл мочи здорового, а в другую - больного человека, добавляют по 5 капель раствора хлорида железа (III) и наблюдают за появлением окрашивания.

Эту реакцию дают различные вещества, хотя окраска их соединений с хлоридом железа FeCl3 неодинакова. При наличии в моче достаточных количеств фенилпировиноградной кислоты развивается сине-зеленое или темно-зеленое окрашивание, исчезающее через 5-10 мин. Сходное окрашивание может давать билирубин мочи.

в. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче с помощью набора «Биофан П».

Ход определения. Индикаторную бумажку смочить мочой и через 30 с сравнить окраску индикатора с цветной шкалой.

Оформление работы. Сравнить характер окрашивания в нормальной и патологической моче, сделать вывод о предполагаемой молекулярной болезни и указать причины.

Практическое значение работы. В норме содержание фенилаланина в плазме крови составляет у детей до 1 месяца 75-100 мкмоль/л (0,025-0,05 г/л) и от 2 месяцев до 14 лет 25-75 мкмоль/л. С мочой его экскретируется у детей до года 6,0-24,0 и от года до 14 лет 6,0-72,0 мкмоль/сут. Применяемые пробы на присутствие фенилпировиноградной кислоты в моче здорового ребенка отрицательны.

При фенилкетонурии содержание фенилаланина в крови повышается до 600-2400 мкмоль/л, а выделение с мочой составляет до 3,0-12,0 мкмоль/сут. Пробы на фенилпировиноградную кислоту в моче становятся положительными. Причем содержание ее в суточной моче составляет 0,05-3,0 г или 0,3-18 ммоль.

При поражениях печени (вирусный гепатит, отравление гепатотропными ядами) нарушается гидроксилирование фенилаланина, который вследствие трансаминирования превращается в фенилпировиноградную кислоту. Поэтому у таких больных увеличивается содержание фенилаланина в сыворотке крови и выделение фенилпировиноградной кислоты с мочой соответственно тяжести течения заболевания.

Работа 68. Диагностика тирозиноза пробой Миллона на тирозин и 4-гидроксифенилпировиноградную кислоту

Тирозиноз связан с недостатком фермента 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназы, вследствие чего тормозится превращение 4-гидроксифенилпировиноградной кислоты и тирозина. При этом содержание их в биологических жидкостях увеличивается.

Реактивы. Реактив Миллона*; L-тирозин, стандартные растворы 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 г/л.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая.

Принцип метода см. работу 1, г.

Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят 1 каплю мочи здорового, а на другую - больного пациента и высушивают полоски на воздухе. На каждое пятно наносят 1 каплю реактива Миллона. Через 2 мин отмечают появление характерного оранжевого окрашивания.

Для полуколичественной оценки результатов на четыре полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле стандартных растворов тирозина, соответствующих концентраций 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 г/л. Подсушивают полоски на воздухе и в эти же зоны вносят по капле реактива Миллона.

Нижняя граница чувствительности реакции при содержании исследуемых субстанций 0,3 г/л. Сравнивают интенсивность окраски исследуемых проб мочи с цветной шкалой стандартных растворов тирозина и устанавливают примерное содержание определяемых субстанций в моче.

Оформление работы. Зарисовать цветную шкалу тирозина и окраску исследуемых проб мочи, дать полуколичественную оценку последним. В выводе указать на возможность применения пробы Миллона для экспресс-диагностики тирозиноза.

Практическое значение работы.

В норме содержание тирозина в плазме крови у детей до 1 месяца составляет 90-140 и у детей от 2 месяцев до 14 лет - 55-110 мкмоль/л; экскреция с мочой этой аминокислоты у детей до года равна 4-30 и от года до 14 лет - 5-88 мкмоль/сут. При тирозинозе концентрация в этих биологических жидкостях увеличивается в 2 раза и более и пробы на присутствие их становятся положительными.

Работа 69. Выявление алкаптонурии пробой на гомогентизиновую кислоту

Алкаптонурия - наследственное заболевание, связанное с дефектом гомогентизинатоксидазы, осуществляющей превращение гомогентизиновой кислоты в фумарилацетоуксусную. Пи этом заболевании накапливается в средах организма гомогентизиновая кислота.

Реактивы. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония*; дигидрофосфат калия, 1%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая*.

а. Проба на гомогентизиновую кислоту со щелочью. Метод основан на окислении гомогентизиновой кислоты кислородом воздуха в щелочной среде с образованием пигментного продукта сине-фиолетового цвета.

Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель нормальной, а в другую - патологической мочи, добавляют по 2 капли раствора гидроксида натрия, встряхивают и наблюдают за изменением окраски 1-2 мин.

Проба положительна при наличии сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующего о присутствии гомогентизиновой кислоты.

б. Проба на гомогентизиновую кислоту с молибденовым реактивом. Метод основан на способности гомогентизиновой кислоты восстанавливать молибдат аммония с образованием молибденовой сини (см. работу 11).

Ход определения. В одну пробирку вносят 2 капли мочи здорового, в другую - 2 капли мочи больного пациента. В каждую пробирку добавляют по 10 капель воды и по 4 капли раствора однозамещенного фосфата калия. Пробирки встряхивают.

Проба положительна при наличии синего окрашивания, обусловленного присутствием в моче гомогентизиновой кислоты.

Оформление работы. Отметить наличие гомогентизиновой кислоты в исследуемой моче; в выводе указать на возможность использования применяемых проб для диагностики.

Практическое значение работы. Пробы на гомогентизиновую кислоту используются для диагностики алкаптонурии, так как в норме эта кислота в моче отсутствует.

Работа 70. Выявление цистинурии иод-азидной пробой на цистин и гомоцистин в моче

Реактивы. Иод-азидный реактив (1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл 0,1 М раствора иода и доводят объем до 100 мл этанолом); L-цистин, стандартные растворы концентрации 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 г/л.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая*.

Метод основан на способности иод-азидного реактива обесцвечиваться в присутствии цистина или гомоцистина.

Ход определения. На две полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле нормальной и патологической мочи, высушивают на воздухе и на высушенные пятна добавляют по 1 капле иод-азидного реактива.

На четыре полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле стандартных растворов цистина, высушивают на воздухе и добавляют на высушенные участки по 1 капле иод-азидного реактива.

Проба считается положительной, если окраска реактива выцветает в течение 5 мин. Нижняя граница чувствительности метода 0,3 г/л. Реакцию оценивают по шкале стандартов цистина от 0,3 до 0,6 г/л.

Оформление работы. Сравнить пробы с нормальной и патологической мочой; по шкале стандартов цистина определить примерное содержание его в моче больного пациента.

Практическое значение работы. Цистинурия - молекулярная патология, возникающая из-за недостатка белка, участвующего в транспорте и реабсорбции в канальцах почек цистина и гомоцистина. В норме с мочой цистина выделяется 4-350 мкмоль/сут. При цистинурии его экскреция повышается до 1-4 ммоль/сут. Для обнаружения наследственной или приобретенной цистинурии используется иод-азидная проба во время массовых обследований детского контингента. Своевременная диагностика позволяет снизить осложнения, наблюдающиеся при этом заболевании, а именно: образование цистиновых камней в почках. При проведении иод-азидной пробы следует учитывать ложно-положительную реакцию ангидрида аргининоянтарной кислоты, ацетона, некоторых лекарственных средств.

2. Экспресс-диагностика патологий углеводного обмена

Работа 71. Выявление пентозурии пробой Биаля

Пентозурия возникает из-за недостатка белка, участвующего в транспорте пентоз и способствующего их реабсорбции в канальцах почек.

Реактивы. Орциновый реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; пипетки вместимостью 5 мл.

Материал. Моча, нормальная и патологическая*.

Принцип метода см. работу 16, б.

Ход определения. В две пробирки отмеривают по 5 мл орцинового реактива и по 1 мл соответственно нормальной и патологической мочи. Затем осторожно нагревают на водяной бане до закипания. При наличии в моче пентоз развивается яркая желто-зеленая окраска.

Оформление работы. Сравнить окраску проб нормальной и патологической мочи и сделать вывод о возможности использования данной реакции для диагностики пентозурии.

Работа 72. Выявление фруктозурии пробой Селиванова

Реактивы. Резорцин, 0,05%-ный раствор в 20%-ной соляной кислоте.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 2 мл; водяная баня.

Материал. Моча, нормальная и патологическая*.

Метод основан на превращении фруктозы при нагревании и в присутствии соляной кислоты в гидроксиметилфурфурол, который конденсируется с резорцином, образуя соединение красного цвета.

Ход определения. В две пробирки наливают по 1 мл раствора резорцина и добавляют в одну из них 2 мл нормальной, а в другую - патологической мочи. Обе пробирки нагревают в водяной бане до закипания. При наличии в моче фруктозы появляется интенсивное красное окрашивание. Оценку пробы производят в момент закипания; при более длительном нагревании положительную реакцию может дать и глюкоза.

Оформление работы. Сравнить окраску исследуемых проб и сделать вывод о практическом применении пробы Селиванова.

Работа 73. Выявление мукополисахаридозов пробой с толуидиновым синим на мукополисахариды

Мукополисахаридозы - врожденное нарушение обмена кислых гетерополисахаридов. При этом заболевании появляются мукополисахариды в моче. Аналогичное явление наблюдается также при ревматоидном артрите и других повреждениях соединительной ткани.

Реактивы. Толуидиновый синий, 0,1%-ный раствор в водном ацетоне, разведенном с водой в соотношении 4:1; уксусная кислота, 10%-ный раствор.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х20 мм; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая*.

Метод основан на образовании окрашенных продуктов (пурпурного цвета) при взаимодействии мукополисахаридов с толуидиновым синим в кислой среде.

Ход определения. На одну полоску фильтровальной бумаги наносят каплю нормальной мочи, на вторую - каплю патологической. Полностью высушивают их при комнатной температуре и помещают в раствор толуидинового синего. Через 1 мин бумажки вынимают из красящего раствора и отмывают в растворе уксусной кислоты.

Проба положительна при развитии пурпурной окраски, говорящей о наличии мукополисахаридов в моче.

Оформление работы. Отметить наличие окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данной пробы.

Практическое значение работы. Полуколичественные методы анализа субстанций называются «просеивающими» или скрининг-тестами. Они позволяют осуществлять отбор больных с предполагаемыми наследственными или приобретенными дефектами обмена; их применяют при массовом обследовании больших контингентов детей для выявления наиболее распространенных и новых молекулярных болезней, при которых повышено выделение углеводов и продуктов их обмена. Эти вещества дают положительные реакции при проведении скрининг-тестов. В дальнейшем при выявлении молекулярной патологии проводится тщательное биохимическое обследование с помощью точных количественных методов.

Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче

Реактивы. Реактив Эрлиха*, насыщенный раствор натрия ацетата; хлороформ; бутиловый спирт; бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0-5,0).

Оборудование. Пипетки на 5,0 и 10 мл; штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными пробирками.

Материал. Моча (подвергается исследованию в течение 2-3-х часов после мочеиспускания).

Метод основан на взаимодействии порфобилиногена с п-диметиламинобензальдегидом с образованием соединения, окрашенного в красный цвет.

Ход определения. В пробирке смешивают 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают стеклянной палочкой. Затем измеряют рН индикаторной бумагой, значение рН должно быть в интервале 4,5-5,0, если рН меньше 4,0 добавляют раствор ацетата натрия для установления нужного рН. Если окраска не образуется - результат отрицательный. При образовании розовой или красной окраски добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний водный слой становится бесцветным или желтым - результат отрицательный. При сохранении окрашивания водной фазы переносят 6-8 мл водного слоя в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 2:1 и встряхивают. Обычно фазы разделяются быстро, в противном случае смесь центрифугируют. При переходе окраски в бутиловый слой результат отрицательный, а если водная фаза остается окрашенной - результат положительный для порфобилиногена.

Примечание. При хранении мочи свыше 3-х часов при комнатной температуре реакция может быть ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением порфобилиногена в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2-3 часа, ее хранят в холодильнике при 4?С или в замороженном состоянии. При хранении в холодильнике и доведении рН мочи до 6,0-7,0 порфобилиноген стабилен длительное время.

Оформление работы. Отметить характер развившегося окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данного определения.

Практическое значение работы. В норме порфобилиноген в моче не обнаруживается (0,2 мг/л). Данным методом он выявляется при концентрации, превышающей 6 мг/л ) при различных формах печеночных порфирий - острая перемежающая, копропротопорфирия, наследственная копропорфирия).

Работа 75. Количественное определение содержания дельта-аминолевулиновой кислоты в моче

Реактивы. Уксусная кислота ледяная; хлорная кислота 57%; натрия ацетат 3-х водный; дельта-аминолевулиновая кислота гидрохлорид; уголь активированный с дисперсностью 0,25-1 мм; ацетил-ацетон; п-диметиламинобензальдегид; ацетатный буфер рН 3,6*; взвесь угля*; реактив Эрлиха*; беззольные фильтры (синяя лента), калибровочный раствор*.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки вместимостью 0, 1, 2,0 и 10 мл; пробирки с притертыми пробками; спектрофотометр.

Материал. Моча. Хранится в холодильнике, рН мочи должен быть равен 6,0, для чего добавляют на 10 мл мочи 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

Метод основан на способности дельта-аминолевулиновой кислоты взаимодействовать с п-диметиламинобензальдегидом после удаления порфобилиногена и других мешающих определению веществ с помощью активированного угля. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации данной кислоты в пробе.

Ход определения. К 1 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взвеси активированного угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию взбалтывают 1 минуту и фильтруют через бумажный фильтр. В две пробирки (контрольную и опытную) отбирают по 2 мл фильтрата. В опытную пробу добавляют 0,05 мл ацетилацетона, в контрольную - такое же количество ацетатного буфера. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем пробирки помещают на 20 минут в кипящую водяную баню, охлаждают, доводят объем жидкости ацетатным буфером до 2 мл и в каждую пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха, перемешивают. Через 15 минут спектрофотометрируют опытную пробу против контрольной при длине волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение часа.

Расчет. Содержание дельта-аминолевулиновой кислоты проводят по калибровочному графику, условия построения которого представлены в таблице.

Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора в две пробирки (контрольную и опытную), которые обрабатывают как указано выше. По полученным данным строят калибровочный график.

Расчет. При расчете рекомендуется проводить пересчет на 1 г креатинина, т.к. диурез за сутки может быть различным.

Содержание АЛК в моче рассчитывают по формуле с использованием калибровочного графика:

С·10

АЛК = ---------- ,

А·2

где С - количество АЛК в пробе (мкмоль), найденное по калибровочному графику;

А - содержание креатинина в пробе (г);

10 - коэффициент разведения мочи;

2 - объем фильтрата (мл).

Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в микромоли - 0,0076.

Оформление работы. По полученным экстинкциям сделать расчет содержания дельта-аминолевулиновой кислоты и вывод о причине возможных изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание АЛК в моче 3,9-19 мкмоль/г креатинина (0,52-2,5 мг/г креатинина). Выделение аминолевулиновой кислоты с мочой увеличивается при патологических процессах, связанных с нарушением порфиринового обмена, а также при интоксикации свинцом, бензолом и другими токсическими веществами.

Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона

Реактивы. Уксусная кислота ледяная; эфир медицинский; соляная кислота 1,4 моль/л; йод, спиртовой раствор 0,039 моль/л; раствор йода в соляной кислоте (200 объемов соляной кислоты и 1 объем спиртового раствора йода).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 2,0 и 5,0; делительные воронки, спектрофотометр.

Материал. Свежевыделенная моча (срок хранения не более 3-х часов).

Метод основан на способности йода переводить копропорфириноген в копропорфирин, который определяется спектрофотометрически по разнице оптической плотности при трех длинах волн.

Ход определения. В делительную воронку вносят 2 мл мочи, 0,2 мл ледяной уксусной кислоты, 5 мл эфира и встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. К эфирному слою, содержащему копропорфирин и копропорфириноген, добавляют 5 мл раствора йода в соляной кислоте для перевода копропорфириногена в копропорфирин, встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз нижний слой переносят в пробирку, термостатируют при 37?С, в течение 5 минут. Затем содержимое пробирки встряхивают и измеряют оптическую плотность раствора в кюветах с толщиной слоя 1 см при трех длинах волн: 380, 402 и 430 нм против 1,41 моль/л раствора соляной кислоты.

Расчет проводят по формуле:

[2·E402 - (E430 + E380)] • 2,093·1,52 нмоль/г креатинина

КП = ----------------------------------------------------

А

где Е402, Е430, Е380 - оптическая плотность раствора при соответствующих длинах волн;

А - содержание креатинина в пробе (г);

1,52 - коэффициент пересчета микрограмм КП в наномоль;

2,093 - коэффициент для расчета содержания КП, предложенный Римингтоном.

Оформление работы. По полученным результатам сделать расчет содержания копропорфирина и сделать вывод о причине возможных изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание копропорфирина в моче 30,5-122 нмоль/г креатинина (20-80 мкг/г креатинина). Повышение содержания копропорфириа в моче наблюдается при наследственной копропорфирии, острой перемежающейся порфирии, эритропоэтической уропорфирии, а также при циррозе, гепатите, свинцовой интоксикации.

РЕГУЛЯТОРЫ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

К регуляторам метаболизма можно отнести витамины, гормоны, гормоноподобные вещества и медиаторы. Свою функцию они осуществляют посредством модификации активности ферментов или влияния на их количество в клетках. Поэтому при исследовании данной группы биологических соединений применяют как методы качественного и количественного анализа этих веществ и продуктов их обмена, так и оценку состояния системы регуляторов организма по их действию на соответствующие звенья метаболизма.

1. Исследование витаминов

Работа 77. Качественные реакции на витамины

Реактивы. Хлороформ; серная кислота, конц.; сульфаниловая кислота, 1%-ный раствор; нитрит натрия, 5%-ный раствор, свежеприготовленный; карбонат натрия, 10%-ный раствор; азотная кислота, конц.; диэтилдитиокарбамат натрия, 2%-ный спиртовой раствор; гидроксид натрия, 4%-ный спиртовой раствор; гидросульфит натрия, порошок; хлорид железа (III), кристаллический; тиомочевина, кристаллическая.

Оборудование. Штатив с пробирками; скальпель; весы аптечные с разновесами; беззольные фильтры; флуороскоп.

Материал.

Рыбий жир.

Токоферол, 0,1%-ный спиртовой раствор.

Витамин К, насыщенный раствор в 70%-ном этаноле.

Тиамин, порошок.

Рибофлавин, 0,002%-ный раствор.

Рибофлавинмононуклеотид, 0,1%-ный раствор в ампулах, из которого готовят 0,002%-ный раствор.

Флавинат, лекарственный препарат в ампулах, содержащий ФАД, 0,002%-ный раствор.

Чай сухой.

Витамин В12, раствор в ампулах.

а. Проба Друммонда на ретинол (витамин А). Метод основан на способности концентрированной серной кислоты отнимать воду от ретинола с образованием окрашенных продуктов.

Ход определения. В пробирку вносят 2 капли рыбьего жира, 5 капель хлороформа и 1-2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, переходящее в буро-красное.

б. Обнаружение кальциферола (витамин Д). Метод основан на взаимодействии кальциферола с гидрохлоридом анилина с образованием окрашенных продуктов.

Ход определения. В сухую пробирку помещают 10 капель анилинового реактива и прибавляют 5 капель рыбьего жира. Содержимое пробирки осторожно при постоянном перемешивании нагревают до кипения и кипятят в течение 30 с. В присутствии витамина Д желтая эмульсия приобретает вначале грязно-зеленое, а затем буро-красное или красное окрашивание.

в. Качественная реакция на токоферол (витамин Е). Метод основан на образовании соединений хиноидной структуры, окрашивающихся в красный цвет, при действии сильных окислителей (концентрированной азотной кислоты) на токоферол.

Ход определения. В сухую пробирку вносят 5 капель спиртового раствора токоферола и добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты. Встряхивают. Наблюдают за развитием красного окрашивания.

г. Качественная реакция на нафтохинон (витамин К). Метод основан на взаимодействии диэтилдитиокарбамата с витамином К в щелочной среде с образованием комплекса голубого цвета.

Ход определения. В пробирку вносят 4 капли спиртового раствора диэтилдитиокарбамата натрия и 4 капли раствора гидроксида натрия. Встряхивают и наблюдают за развитием окраски.

д. Обнаружение тиамина (витамин В1). Метод основан на способности тиамина образовывать с диазофенилсульфоновой кислотой комплекс оранжево-красного цвета в щелочной среде.

Ход определения. В пробирку вносят 5 капель раствора сульфаниловой кислоты и прибавляют 5 капель раствора нитрита натрия. К полученному диазореактиву добавляют на кончике скальпеля порошок тиамина и 5 капель раствора карбоната натрия. Встряхивают. Появляется оранжево-красное окрашивание.

е. Обнаружение рибофлавина (витамин В2 и флавиновых коферментов. Метод основан на способности окисленных форм рибофлавина и флавиновых коферментов (ФМН и ФАД) давать в ультрафиолетовом свете желто-зеленую флуоресценцию, интенсивность которой зависит от их концентрации. Восстановленные формы флавинов не флуоресцируют.