Затем спиртовой экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр. Если раствор будет мутным, то фильтрование повторяют через тот же фильтр. Фильтрат используют для анализа.

б. Обнаружение фосфатидилхолинов в экстрактах. Метод основан на нерастворимости фосфатидилхолинов в ацетоне, способности их образовывать эмульсии в воде и давать комплексное соединение с хлоридом кадмия, выпадающее в виде хлопьевидного осадка.

Ход определения. Наливают в сухую пробирку 2 мл ацетона и по каплям прибавляют спиртовой фильтрат, полученный в предыдущем опыте. Наблюдают за помутнением жидкости и выпадением осадка.

В пробирку вносят 20 капель дистиллированной воды и постепенно приливают 5 капель спиртового фильтрата мозга. Встряхивают содержимое и наблюдают за образованием устойчивой белой эмульсии.

К смеси добавляют 1 мл спиртового фильтрата мозга и прибавляют 0,5 мл спиртового раствора хлорида кадмия. Отмечают выпадение хлопьевидного осадка.

в. Выявление составных компонентов фосфатидилхолинов. Метод основан на гидролизе выделенных фосфатидилхолинов в растворе гидроксида натрия и постановке качественных реакций на составные части их молекул: жирные кислоты, глицерин, холин и фосфорную кислоту. Жирные кислоты обнаруживают добавлением соляной кислоты к гидролизату, содержащему растворимые натриевые соли жирных кислот; в результате образуются нерастворимые свободные жирные кислоты, всплывающие на поверхность.

Холин при нагревании превращается в триметиламин, имеющий запах селедочного рассола нагревание

HOCH2 -- CH2 -- N+(CH3)3 > N(CH3)3 + НО -- CH2 -- CH2 -- OH

Триметиламин обладает выраженными основными свойствами, поэтому выявляется по посинению лакмусовой бумажки. Акролеин обнаруживается по характерному раздражающему запаху. Реакция, на которой основано обнаружение фосфорной кислоты, изложена в работе 11.

Ход определения.

Гидролиз фосфатидилхолинов. Спиртовой экстракт (фильтрат) из ткани мозга упаривают в пробирке на водяной бане и добавляют 3 мл раствора гидроксида натрия. Кипятят в течение 10 мин.

Открытие холина. В ту же пробирку вносят 20 капель гидролизата и нагревают. Образующийся из холина триметиламин обнаруживают по появлению запаха селедочного рассола. К отверстию пробирки подносят влажную красную лакмусовую бумажку и наблюдают изменение ее окраски.

Открытие жирных кислот. К оставшемуся гидролизату прибавляют по каплям раствор соляной кислоты до кислой реакции среды, обнаруживаемой по лакмусовой бумаге. На поверхность жидкости всплывают в виде хлопьевидной массы высшие жирные кислоты. Содержимое пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр, на котором задерживаются жирные кислоты. Фильтрат нейтрализуют (по лакмусовой бумажке), прибавляя по каплям раствор гидроксида натрия, и упаривают на водяной бане досуха. Сухой остаток используют для реакций на глицерин и фосфорную кислоту.

Открытие глицерина. Часть сухого остатка переносят в сухую пробирку, добавляют несколько кристаллов безводного гидросульфата калия и осторожно нагревают. Появляется характерный запах акролеина.

Открытие фосфорной кислоты. Оставшийся сухой остаток сплавляют в тигле с небольшим количеством (одна глазная лопатка или на кончике скальпеля) порошка нитрата калия и карбоната натрия (сплавление проводят в вытяжном шкафу!). После охлаждения тигля к сплаву добавляют раствор азотной кислоты, смесь сливают в пробирку. К 2 мл реактива молибдата аммония приливают небольшими порциями испытуемый раствор. Смесь нагревают до кипения. При стоянии образуется желтый осадок фосфомолибдата аммония.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы и описать признаки, по которым обнаруживается соответствующее вещество.

Материал	Исследуемый компонент	Реакция (проба)	Результат реакции

В выводе указать на присутствие анализируемых фосфолипидов в ткани мозга и практическую значимость проведенного исследования.

Практическое значение работы. В клинико-биохимических исследованиях качественные реакции на фосфолипиды и их компоненты используются для обнаружения их в экстрактах биологического материала, а в фармации - при анализе лекарственных препаратов, содержащих фосфолипиды. При разделении фосфолипидов эти реакции применяются для проявления хроматограмм, а также для разработки методов количественного определения фосфолипидов.

Работа 18. Качественные реакции на стероиды

Стероидные соединения - стерины и стериды, широко распространены в животных и растительных организмах. Типичным представителем стероидов организма животных (зоостеринов) является холестерин, который находится в тканях и жидкостях в свободном виде или в виде холестеридов, т.е. эфиров пальмитиновой, стеариновой или олеиновой кислот. Особенно богата холестерином нервная ткань, где его содержится до 20-30 г/кг, причем больше всего холестерина в белом веществе головного и спинного мозга, где его концентрация достигает 40-55 г/кг. Высоко содержание холестерина в ланолине, который используется в фармации для приготовления мазей.

Холестерин извлекается из биологического материала хлороформом, горячим этиловым спиртом, диэтиловым эфиром, ацетоном и др. На практике чаще всего используют смеси органических растворителей. В воде холестерин набухает и образует эмульсии; в отличие от других липидов он не разрушается под действием концентрированных щелочей.

К растительным стеринам (фитостерины) относятся эргостерин, стигмастерин, в-ситостерин, фукостерин, которые содержатся в растительных маслах, плодах, водорослях и т.д. В лекарственных растениях (наперстянка, горицвет, ландыш, кендырь и др.) имеются сердечные гликозиды, агликоны которых представляют собой тоже скелет стерана.

Реактивы. Сульфат кальция (гипс), порошок; хлороформ; серная кислота, конц.; уксусный ангидрид; смесь формалина с конц. серной кислотой (1:50).

Оборудование. Штатив с пробирками; весы аптечные; ступка с пестиком; стеклянная пластинка (100х100 мм); лопаточка; воронка с бумажным фильтром; сушильный шкаф, отрегулированный на 60?С; скальпель; пипетка вместимостью 5 мл; глазные пипетки.

Материал.

Мозг лабораторного животного.

Растительное масло.

Для выделения холестерина 3 г ткани мозга тщательно растирают с двукратным количеством гипса. Густой гомогенат распределяют лопаточкой по стеклянной пластинке и высушивают в сушильном шкафу при 60?С. Высушенную массу счищают скальпелем в сухую ступку, растирают и переносят в сухую пробирку. В пробирку добавляют 6 мл хлороформа и содержимое взбалтывают 5 мин. Отфильтровывают хлороформный экстракт через сухой бумажный фильтр в сухую пробирку и проделывают с ним перечисленные ниже реакции.



а. Реакция Гупперт-Сальковского. Метод основан на дегидратации молекулы холестерина под действием концентрированной серной кислоты с образованием холестерилена, имеющего красную окраску.

Ход определения. В пробирку наливают 1 мл хлороформного экстракта мозга и осторожно подслаивают по стенке пробирки 1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку легко встряхивают. На границе двух жидкостей появляется кольцо красного цвета, затем вся жидкость принимает последовательно красную, оранжевую и красно-фиолетовую окраску.

б. Реакция Либермана-Бурхарда. Метод основан на дегидратации холестерина с последующим соединением двух образовавшихся молекул холестерина в бихолестадиен:

Бихолестадиен в присутствии уксусного ангидрида и сульфокислоты дает сульфопроизводные зеленого цвета.

Ход определения. В сухую пробирку наливают 2 мл хлороформного экстракта мозга и добавляют в нее 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется вначале красное окрашивание, переходящее затем в сине-зеленое и зеленое.

в. Реакция Витби. Метод, как и в предыдущих реакциях, основан на образовании окрашенных производных дегидратированного и окисленного холестерина под действием серной кислоты.

Ход определения. В одну пробирку вносят 2 мл хлороформного экстракта мозга, в другую - 2-3 капли растительного масла и 1 мл хлороформа. В обе пробы добавляют по 20 капель смеси формалина с серной кислотой и встряхивают. Растворы делятся на два слоя - верхний (хлороформный) окрашивается в яркий вишневый цвет, нижний (кислотный) - в тусклый буро-красный с зеленой флуоресценцией.

Из хлороформного слоя обеих пробирок отбирают пипеткой несколько капель, переносят в другие (сухие!) пробирки и прибавляют по 2 капли уксусного ангидрида. Вишневая окраска переходит в сине-зеленую.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отмечая их знаками «+» или «-».

В выводе указать на присутствие в исследуемом материале соответствующих стероидов, специфичность использованных реакций и их практическое значение.

Материал	Исследуемый компонент	Реакция	Окраска раствора	Результат

Практическое значение работы. Реакции на холестерин используются для обнаружения холестерина при гистохимическом и цитохимическом исследовании тканей, клеточных мазков и биологических жидкостей. Это имеет значение при нарушениях обмена холестерина, сопровождающихся отложением его в сосудах (атеросклероз), в коже (ксантоматоз) и т.д. Эти реакции характерны и для родственных холестерину соединений - стероидных гормонов, желчных кислот, растительных стеринов, поэтому применяются для качественного анализа лекарственных препаратов, содержащих указанные вещества, и для разработки методов их количественного определения.

ФЕРМЕНТЫ

Ферменты (энзимы) - биологические катализаторы белковой природы. Они содержатся во всех тканях, клетках, внутриклеточных органоидах и биологических жидкостях. Без них не осуществляется ни один химический процесс в организме. Разработка методов выделения и очистки ферментов дала возможность получить их в чистом и кристаллическом виде. Это позволило изучить структуру ферментов, активные и регуляторные центры их молекул, механизм действия, роль простетических групп в катализе и т.д. Как любые белки, ферменты подвержены денатурации, поэтому процедура их получения из биологического материала (ткани животных и растений, микроорганизмы, жидкости) должна быть щадящей, т.е. вестись при температуре 0-4?С, при рН 5-9 (за исключением особых случаев). Среда для извлечения ферментов не должна содержать примесей тяжелых металлов, которые инактивируют ферменты.

Ферменты делятся на простые и сложные. У простых ферментов функцию контактного и каталитического участков активного центра выполняют только радикалы аминокислот; у сложных - в состав активного центра входят также коферменты и ионы металлов. Сложные ферменты без кофакторов не активны, что нужно учитывать при их идентификации.

1. Сравнительное действие ферментов и небиологических катализаторов

Ферменты в отличие от небиологических катализаторов (металлы, кислоты и т.д.) обладают высокой эффективностью катализа, специфичностью действия, способностью ускорять реакции в мягких условиях.

Работа 19. Сравнение действия б-амилазы слюны и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала

Реактивы. Крахмал, 1%-ный раствор в 0,3%-ном растворе хлорида натрия, свежеприготовленный; раствор иода в иодиде калия*; реактив Фелинга*; пероксид водорода, 10%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; воронка с ватой; стеклянные палочки; глазные пипетки; водяная баня с термометром; пипетки вместимостью 5 мл.

Материал.

Разбавленная слюна. Для ее получения промывают рот водой от остатков пищи. Набирают в рот порцию дистиллированной воды около 20 мл и держат ее примерно 2 мин, смешивая языком со слюной. Жидкость со слюной выпускают в стаканчик и профильтровывают через вату в пробирку. Фильтрат используют для работы.

Соляная кислота, 10%-ный раствор.

Метод основан на изучении скорости гидролиза крахмала, определяемого по убыли субстрата (крахмал) реакцией с раствором иода или по приросту продукта (мальтоза), выявляемого реакцией Фелинга (образование красного осадка оксида меди). Реагентом на крахмал и декстрины служит иод, образующий с ними окрашенные комплексные соединения (табл.6). Амилоза крахмала при этом дает с иодом комплекс синего цвета, гликоген - красно-бурого, а декстрины в зависимости от молекулярной массы окрашиваются в красно-бурый или желтоватый цвет. Последний обусловлен не образованием комплекса, а находящимся в среде иодом.

Мальтоза как восстанавливающий дисахарид выявляется реакцией Фелинга, которая основана на способности углеводов в щелочной среде восстанавливать ионы Cu2+, содержащиеся в жидкости Фелинга в виде комплексного соединения с тартратами, до оксида меди красного цвета, выпадающего в осадок.

Таблица 6. Проба с иодом на крахмал и продукты его гидролиза

Крахмал и продукты его гидролиза	Окрашивание с иодом
Крахмал	Синее
Амилодекстрины	Фиолетовое
Эритродекстрины	Красное
Ахродекстрины	Желтое (окраска раствора иода) или бесцветное
Мальтодекстрины	То же
Мальтоза	То же

Чем выше скорость катализа, тем быстрее исчезает (положительная иод-крахмальная проба) синее окрашивание и усиливается реакция Фелинга на мальтозу.

Ход определения. Берут три пробирки: в первую вносят 1 мл воды, во вторую - 1 мл раствора соляной кислоты, в третью - 1 мл разбавленной слюны. Добавляют во все пробы по 5 мл раствора крахмала, перемешивают их стеклянной палочкой и ставят первую и третью пробирки в водяную баню при 38?С, а вторую - в кипящую водяную баню. Через 15 мин пробирки охлаждают. Из каждой пробирки отбирают по 5 капель в другие пробирки, добавляют по 1-2 капли раствора иода и сравнивают окрашивание проб.

Для определения мальтозы отбирают по 3 мл из каждой пробирки, прибавляют по 1 мл реактива Фелинга и нагревают верхний слой смеси до кипения. Отмечают появление в пробах красного осадка оксида меди (I).

Оформление работы. Результаты заносят в таблицу.

Катализатор	Субстрат реакции	Продукт реакции	Выявление	Результат
			субстратов	продуктов

В выводах указать разницу в действии катализаторов на скорость гидролиза крахмала.

2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам

Все ферменты в зависимости от типа катализируемых химических реакций делятся на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы). Внутри каждого класса ферменты подразделяются на подклассы, подподклассы, которые уточняют природу ферментативной реакции (номенклатуру и систему нумерации ферментов см. учебник, с.125-129).

Для обнаружения ферментов каждого класса в биологическом материале имеются свои особенности, поэтому необходимо определить условия для протекания ферментативной реакции. Качественные реакции на ферменты используются в клинике для обнаружения ферментов в мазках крови, биоптатах и микропрепаратах при энзимоцитохимических исследованиях, а также в гигиенической практике при постановке проб на присутствие ферментов в продуктах питания (молоко, картофель и т.д.). При разделении ферментов методом электрофореза их идентификацию также производят с помощью качественных реакций.

Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале

В реакциях, катализируемых оксидоредуктазами, окисляемый субстрат рассматривается как донор водорода или электронов, а акцептором могут быть природные вещества (коферменты - НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, КоQ, кислород, органические соединения, цитохромы и др.) и ксенобиотики.

Для большинства ферментов этого класса рекомендуются названия: дегидрогеназы и редуктазы. В тех случаях, когда акцептором служит О2, используется термин оксидаза, а если кислород в ходе реакции включается в состав субстрата, то фермент называется оксигеназа. Пероксидаза является ферментом, использующим Н2О2 в качестве акцептора, а каталаза - ферментом, катализирующим реакции, где донорно- акцепторную пару составляют две молекулы Н2О2.

Реактивы. Формальдегид, 0,4%-ный раствор; метиленовый синий, 0,01%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; пипетки вместимостью 1 и 5 мл.

Материал.

Картофельный сок (сырой картофель натирают на терке и отжимают через два слоя марли).

Свежее коровье молоко.

а. Выявление альдегидоксидазы (альдегид: кислород оксиредуктаза; КФ 1.2.3.1) в молоке.

Метод основан на визуальном наблюдении за обесцвечиванием метиленового синего (МС), связывающего водород, который отщепляется с участием альдегидоксидазы от субстрата.

Альдегидоксидаза катализирует реакцию дегидрирования различных альдегидов, например, формальдегида.

Водород переносится на ФАД+, являющийся коферментом данного фермента, а затем на конечный акцептор - кислород - по уравнению

Альдегидоксидаза

НС = О + Н2О + ФАД+ Н - С = О + ФАД•Н2

¦ ¦

Н ОН

Альдегидоксидаза

ФАД•Н2 + О2 ФАД+ + Н2О2

При добавлении МС - искусственного акцептора водорода - в бескислородных условиях образуется его восстановленная форма (лейкоформа) МС•Н2.

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть, то он вновь приобретет синюю окраску:

МС•Н2 + О2 > МС + Н2О2

Ход определения. В две пробирки вносят по 5 мл свежего молока и добавляют в первую 1 мл воды, а во вторую такой же объем раствора формальдегида. В обе пробы приливают по 1 мл раствора метиленового синего, содержимое перемешивают и приливают 3-4 капли вазелинового масла (для предохранения жидкой смеси от контакта с кислородом воздуха).

Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 37?С. Через 5-10 мин сравнивают изменение окрашивания в пробах. Сильно встряхнув, вновь отмечают переход окраски.

б. Выявление пероксидазы (донор: Н2О2 оксидоредуктаза; КФ 1.11.1.7) в картофеле и в молоке. В основе метода лежит реакция с бензидином (см. работу 9, а).

Ход определения. В две пробирки наливают по 1 мл соответственно сырого молока и картофельного сока. Добавляют в обе пробы по 5 капель спиртового раствора бензидина и по капле раствора пероксида водорода. Отмечают характерное окрашивание.

Оформление работы. Результаты занести в таблицу и отметить характерное окрашивание индикатора реакции.

Материал	Выявленный фермент	Субстрат (донор)	Акцептор	Индикатор реакции	Результат

В выводах указать на присутствие в биологическом материале изучаемых ферментов и практическое значение работы.

Работа 21. Обнаружение холинэстеразы (ацетилхолинацилгидролаза; КФ 3.1.1.7) в сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа

Реактивы. Полоски фильтровальной бумаги, смоченные субстратно-индикаторным раствором (0,2 г ацетилхолина-бромида и 0,1 г дибромсульфофталеина растворить в 7 мл 96%-ного этанола).

Оборудование. Предметные стекла; пинцеты; микропипетки; часы; водяная баня.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на изменении окраски индикатора дибромсульфофталеина (от синей до зеленой и желтой), происходящем в результате освобождения уксусной кислоты при гидролизе ацетилхолина холинэстеразой:

O

¦ холинэстераза

(CH3)3N+ЇCH2ЇCH2ЇOЇCЇ CH3 + H2O

(CH3)3N+ЇCH2ЇCH2OH + CH3COOH

ацетилхолин холин уксусная кислота

Ход определения. На чистое предметное стекло наносят каплю сыворотки крови, на нее пинцетом опускают полоску бумаги, которая тут же окрашивается в синий цвет. Засекают время. Пробу накрывают вторым предметным стеклом и отмечают время появления желтого окрашивания бумаги.

Оформление работы. Занести результаты (время появления желтого окрашивания индикаторной бумаги от момента помещения ее на каплю сыворотки крови) и сравнить их с нормой, которая колеблется от 5 до 20 мин. Сделать вывод о присутствии изучаемой гидролазы в сыворотке крови.

Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу В.И. Товарницкого и Е.Н. Волуйской

Реактивы. Фруктозо-1,6-бисфосфата, натриевая соль, 1%-ный раствор*; смесь на альдолазу*, раствор 2,4-динитрофенилгидразина 0,1%-ный раствор, трихлоруксусная кислота 10%-ный раствор, едкий натрий 3%-ный раствор, калибр. раствор*.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки на 0,2; 0,1; 1,0; 2,0; 5,0 мл; центрифуга; термостатирующая водяная баня; фотоэлектроколориметр.

Материал. Исследуемая сыворотка крови.

Метод основан на определении дигидроксиацетонфосфата (ДОФ), образующегося в ходе расщепления фруктозобисфосфата с участием альдолазы:

Дигидроксиацетонфосфат при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразином образует гидразон, который в щелочной среде имеет коричнево-бурую окраску:

Ход определения. В центрифужную пробирку (опытная проба) к 0,2 мл смеси на альдолазу с фруктозо-1,6-бисфосфатом (смешать 1,75 мл смеси на альдолазу с 0,25 мл фруктозо-1,6-бисфосфата) внести 0,1 мл сыворотки крови. В другую центрифужную пробирку (контрольная проба) взять 0,175 мл смеси на альдолазу без фруктозо-1,6-бисфосфата и добавить 0,1 мл сыворотки крови. Обе пробирки поместить в термостат при температуре 37?С на 1 час. По истечении времени пробирки вынуть из термостата и добавить к контрольной пробе 0,025 мл раствора фруктозо-1,6-бисфосфата. Для осаждения белков в обе пробирки внести по 0,3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугировать 10 минут при 3000об/мин, слить центрифугат в другую пробирку и, добавив по 0,6 мл 3% раствора едкого натрия, оставить стоять на 10 минут при комнатной температуре. Затем прилить по 0,6 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и пробы поместить на 10 минут в термостат или водяную баню при температуре 37?С, затем добавить 4,2 мл 3% раствора едкого натрия. Фотометрировать на ФЭКе при длине волны 530-540 нм (зеленый светофильтр) в кювете на 0,5 см против контрольной пробы.

Примечание. Так как окраска неустойчива, то фотометрировать следует сразу после добавления едкого натрия.

Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику находят активность фермента в мкмоль/ч•л.

Построение калибровочного графика

В ряд пробирок (см. приложение) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают водой и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента.

№ пробирки	Калибровочный раствор диоксиацетона, мл	Дистил. вода, мл	Диоксиацетон в пробе, мкмоль	Фруктозо-1,6-бис-фосфат в пробе, мкмоль
1	0,05	0,45	0,5	0,25
2	0,10	0,40	1,0	0,50
3	0,20	0,30	2,0	1,0
4	0,30	0,20	3,0	1,5
5	0,40	0,10	4,0	2,0

Оформление работы. После определения активности фермента по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений.

Практическое значение работы. В норме активность фруктозо-1,6-бис-фосфатальдолазы составляет 3,6-21,8 мкмоль/ч•л. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях печени, поражении ее гепатотропными ядами, а также в случае нарушений со стороны сердечной и скелетной мышц (инфаркт миокарда, прогрессирующая мышечная дистрофия, миозит и т.д.).

Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы (D-глюкозо-6-фосфат кетол-изомераза; КФ 5.3.1.9) в сыворотке крови

Реактивы. Субстратная смесь для выявления глюкозофосфат-изомеразы*, трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; резорцин, 0,1%-ный раствор в 3,6%-ной соляной кислоте; соляная кислота, 36%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторный термометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении фруктозо-6-фосфата, образующегося в ходе изомеризации глюкозо-6-фосфата под действием глюкозофосфат-изомеразы



Фруктозо-6-фосфат образует с резорцином в присутствии соляной кислоты соединение красного цвета.

Ход определения. В две пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови. В одну из них (опытную) добавляют 1 мл субстратной смеси и перемешивают. Помещают обе пробирки на 30 мин в водяную баню при 37?С, а по окончании инкубации в них приливают по 1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (для остановки реакции). В контрольную пробу доливают 1 мл субстратной смеси.

После перемешивания содержимое каждой пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отбирают по 1 мл фильтрата в чистые пробирки, приливают по 1 мл резорцина и по 3 мл раствора соляной кислоты. Смеси энергично встряхивают и оставляют для развития окраски. Отмечают разницу окрашивания в пробах.

Оформление работы. Отметить различие окраски проб и сделать вывод о присутствии фермента в сыворотке крови.

3. Изучение кинетических свойств ферментов

Кинетика ферментативных реакций - это раздел энзимологии, который изучает зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ (т.е. субстратов и ферментов) и от условий их взаимодействия, т.е. от температуры, концентрации компонентов, рН среды, состава среды, присутствия модификаторов и т.д. Изучение кинетики ферментативных реакций показывает не только их отличия от небиологических катализаторов, обусловленные прежде всего белковой природой ферментов, но и многообразие условий, от которых зависит правильное определение активности любого фермента.

Скорость реакции, т.е. убыль субстрата или прирост количества продукта за определенные промежутки времени, является мерой каталитической активности фермента или просто активностью фермента.

Использование методов качественного анализа субстратов и продуктов реакции позволяет выявить присутствие фермента в биологическом материале, а количественное определение их дает возможность определить содержание фермента или его активность в расчете на единицу массы или объема исследуемого образца.

Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере б-амилазы слюны

Реактивы. Крахмал, 1%-ный раствор, свежеприготовленный; раствор иода в иодиде калия*; фосфатно-цитратный буфер, 0,1 М с рН 5,6; 6,4; 6,8; 7,2 и 8,0*.

Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; бюретка вместимостью 25 мл; химические стаканы (для льда или снега).

Материал. Слюна разбавленная (см. работу 18).

а. Зависимость скорости реакции от количества фермента. Метод основан на определении скорости гидролиза крахмала, выявляемого пробой с иодом, в зависимости от количества добавленной б-амилазы слюны.

Ход определения. Разводят исходную разбавленную слюну водой в пробирках в 20, 40, 80 и 160 раз. Берут четыре пробирки и вносят в каждую 1 мл одного из полученных разведений слюны. В пробирки из бюретки добавляют по 4 мл раствора крахмала, быстро помещают их в водяную баню при 38?С и засекают время начала реакции.

Через каждые 1-2 мин отбирают по 2 капли жидкости из каждой пробы и приливают к ним по 1 капле раствора иода в иодиде калия. Вначале пробы дают синее, затем красно-фиолетовое и, наконец, красное окрашивание.

Отмечают с точностью до 0,5 мин время от начала опыта до появления в каждой из четырех пробирок красного окрашивания - стадия образования эритродекстринов из крахмала.

Оформление работы. Результаты изобразить графически, откладывая по оси ординат v - скорость реакции (величина, обратная времени образования эритродекстринов), а по оси абсцисс [C] - относительную концентрацию амилазы (разведение). Сделать вывод о зависимости скорости реакции от концентрации фермента и сравнить с той же зависимостью для небиологических катализаторов.

б. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. Метод основан на определении скорости гидролиза б-амилазой слюны крахмала в зависимости от температуры.

Ход определения. В пробирку помещают 5 капель слюны, кипятят 1-2 мин на водяной бане и остужают. В две другие помещают по 5 капель некипяченой слюны.

Вносят во все пробы по 10 капель раствора крахмала и ставят первую и вторую пробирки в водяную баню при 38?С, а третью - в воду со льдом или снегом на 3 мин. Затем прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора иода в иодиде калия и сравнивают развивающуюся окраску.

Оформление работы. Данные оформляют в виде таблицы, делают вывод о зависимости ферментативной реакции от температуры и причинах этой зависимости.

Фермент	Субстрат	Окрашивание с иодом	Температура

в. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды. Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала, определяемого пробой с иодом, под действием б-амилазы слюны при разных рН среды. В результате устанавливается оптимум рН действия б-амилазы.

Ход определения. В пять пробирок отмеривают по 10 капель растворов фосфатно-цитратного буфера со следующими значениями рН: 5,6; 6,4; 6,8; 7,2; 8,0. Прибавляют во все пробы по 5 капель разведенной в 10 раз слюны и по 10 капель раствора крахмала и ставят пробирки в водяную баню при 38?С. Через 1-2 мин отбирают по 1 капле содержимого в другие пробирки и приливают по 1 капле раствора иода в иодиде калия. Отмечают время наступления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) в каждой из пяти проб.

Оформление работы. Данные оформить графически, откладывая по оси абсцисс значения рН среды и по оси ординат - время (в мин), которое необходимо для гидролиза крахмала до стадии эритродекстринов. Сделать вывод об оптимуме рН действия б-амилазы слюны.

Практическое значение работы. Кинетические свойства ферментов изучаются для подбора оптимальных условий (концентрация субстрата, оптимум рН среды и температуры, ионный состав среды), определения активности ферментов в научных и клинических исследованиях, а также при стандартизации ферментных препаратов. Неверно подобранные стандартные условия определения конкретного фермента приводят к ошибкам в диагностике заболеваний и контроле качества ферментных препаратов.

4. Специфичность действия ферментов

Ферменты в отличие от небиологических катализаторов обладают высокой специфичностью. Однако степень специфичности разных энзимов неодинакова, что позволяет клеткам живых организмов приспосабливаться к изменениям среды.

Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности уреазы (карбамидамидогидролаза; КФ 3.5.1.5.)

Реактивы. Мочевина, 1%-ный раствор; тиомочевина, 1%-ный раствор; ацетамид, 1%-ный раствор; фенолфталеин, 0,5%-ный спиртовой раствор; лакмусовая бумага.

Оборудование. Аптечные весы с разновесами; штатив с пробирками; глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 мл.

Материал. Соевая мука.

Метод основан на определении аммиака, образующегося под действием уреазы соевой муки на мочевину:

уреаза

H2N Ї C Ї NH2 + H2O 2NH3^ + CO2^

¦

O

мочевина

Выделение аммиака обнаруживается по запаху и по изменению окраски фенолфталеина и красной лакмусовой бумаги. Сравнивают возможность гидролиза уреазой веществ, сходных по строению с мочевиной:

H2N Ї C Ї NH2

¦

S

Тиомочевина

CH3 Ї C Ї NH2

¦

O

ацетамид

Ход определения. В одну пробирку помещают 1 мл раствора мочевины, во вторую - тиомочевины, в третью - ацетамида.

В каждую пробирку добавляют примерно 100 мг соевой муки и 2 капли раствора фенолфталеина, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять при комнатной температуре.

Следят за появлением розовой окраски содержимого в пробирках. Выделение аммиака обнаруживают также по запаху и с помощью влажной лакмусовой бумажки, которую подносят к отверстию пробирок. Сравнивают результаты выявления аммиака в трех пробах.

Оформление работы. Данные оформить в виде таблицы, сделать вывод о специфичности уреазы и ее практическом значении.

Фермент	Субстрат	Пробы на аммиак
		Фенолфталеин	Запах	Лакмусовая бумага

Практическое значение работы. Ферменты с абсолютной субстратной специфичностью, к которым относится уреаза, катализируют превращение только одного вещества. Эти ферменты используют в клинической биохимии и фармации как аналитические реагенты для определения веществ, к которым они имеют абсолютную специфичность. Например, уреаза используется для определения мочевины в биологическом материале и лекарственных препаратах.

Работа 26. Специфичность действия амилазы (б-1,4-глюкан-4-глюкангидролаза; КФ 3.2.1.1.) и сахаразы (в-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза; КФ 3.1.1.26)

Реактивы. Крахмал, 1%-ный раствор; сахароза, 2%-ный раствор; реактив Фелинга*.

Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; глазные пипетки.

Материал.

Слюна, разбавленная (см. работу 19).

Сахараза, извлеченная из дрожжей. (Для получения сахаразы из дрожжей 2 г дрожжей размять в ступке, растереть, добавив 10-12 мл дистиллированной воды. Содержимое из ступки перенести в пробирку и поставить в водяную баню при 37?С на 10-15 мин. Отцентрифугировать смесь при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, которая содержит фермент сахаразу, слить и использовать в работе).

Метод основан на сравнительном изучении гидролиза б-амилазой и сахаразой разных субстратов, содержащих гликозидные связи: крахмала и сахарозы. Гидролиз крахмала и сахарозы оценивают пробой Фелинга на восстанавливающие сахара (мальтоза, глюкоза).

Ферменты катализируют реакции по схеме:

б-Амилаза

Крахмал + nH2O Декстрины + Мальтоза

Сахараза

Сахароза + H2O Глюкоза + Фруктоза

Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую - такой же объем раствора сахарозы. Для выявления специфичности б-амилазы в обе пробы добавляют по 5 капель разбавленной слюны, перемешивают встряхиванием и ставят в водяную баню при 38?С на 10 мин. Затем с жидкостью в обеих пробирках проделывают пробу с реактивом Фелинга (см. работу 19) и сравнивают окраску.

Для выявления специфичности сахаразы в одну пробирку наливают 10 капель раствора крахмала, а в другую - сахарозы и прибавляют к ним по 5 капель экстракта сахаразы дрожжей. Пробы перемешивают встряхиванием и помещают в водяную баню при 38?С на 10 мин, после чего с жидкостью обеих пробирок проделывают пробу с реактивом Фелинга. Сравнивают окраску.

Оформление работы. Данные занести в таблицу, сделать вывод о специфичности изученных ферментов и обозначить, к какому типу специфичности они относятся.

Фермент	Субстрат	Проба с реактивом Фелинга	Специфичность действия

Практическое значение работы. Ферменты с абсолютной и относительной групповой субстратной специфичностью, обладающие меньшей избирательностью действия на субстраты, участвуют, как правило, в гидролизе питательных веществ или превращении чужеродных соединений. В частности, б-амилаза и сахараза проявляют специфичность не к структуре субстрата в целом, а к типу гликозидных связей, находящихся в соответствующих углеводах.

5. Модификаторы активности ферментов

Вещества, изменяющие активность ферментов (модификаторы), делятся на активаторы и ингибиторы. Они стимулируют или угнетают активность фермента, влияя на его активный или аллостерический центры. Модифицирующее влияние различных соединений на активность фермента устанавливают путем кинетических исследований.

Работа 27. Активаторы и ингибиторы б-амилазы слюны

Реактивы. Крахмал, 0,5%-ный раствор; хлорид натрия, 1%-ный раствор; сульфат меди (II), 1%-ный раствор; фенилтиомочевина. 0,02%-ный раствор; раствор иода в иодиде калия*.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки; водяная баня с лабораторным термометром; часы.

Материал. Слюна, полученная, как в работе 18, и разведенная водой в 10 раз.

Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала (продукт гидролиза крахмала обнаруживают пробой с иодом) под действием б-амилазы слюны до и после добавления фенилтиомочевины, ионов Cl? и Cu2+.

Ход определения. Берут четыре пробирки и наливают по 10 капель: в первую - дистиллированной воды, во вторую - раствора хлорида натрия, в третью - раствора сульфата меди и в четвертую - раствора фенилтиомочевины, а затем по 20 капель раствора крахмала и по 1 капле разведенной слюны. Содержимое перемешивают встряхиванием, помещают пробирки в водяную баню при 38?С и засекают время начала инкубации.

Через каждые 1-2 мин из проб отбирают в другие пробирки по 1 капле жидкости и добавляют 1 каплю раствора иода в иодиде калия. Отмечают время появления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) при проведении реакции с иодом в каждой из пробирок.

Оформление работы. Результаты занести в таблицу, сделать вывод о действии изученных веществ и о предполагаемом типе ингибиторов.

Фермент	Модификатор активности	Субстрат	Время образования эритродекстринов, мин (проба с иодом)

Работа 28. Действие конкурентных ингибиторов на сукцинат-дегидрогеназу (сукцинат: акцептор оксидоредуктаза; КФ 1.3.99.1) мышечной ткани

Реактивы. Малоновая кислота, 1%-ный раствор, нейтрализованный NaOH; сукцинат натрия, 1%-ный раствор; метиленовый синий, 1%-ный раствор; вазелиновое масло.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня; лабораторный термометр.

Материал. Мышечная кашица, полученная после забоя животного.

Метод основан на сравнительном определении активности сукцинатдегидрогеназы по обесцвечиванию в ходе реакции метиленовой сини (МС) как акцептора водорода в присутствии и в отсутствии малоновой кислоты.

Образующийся ФАД•Н2 восстанавливает метиленовую синь (МС•Н2), в результате чего происходит обесцвечивание раствора. Сравнивая визуально уменьшение интенсивности синего окрашивания с пробами, содержащими разные количества малоновой кислоты (НООС - СН2 - СООН), делают вывод о типе действия ее на фермент.

Ход определения. В три пробирки помещают по 3-4 г мышечной кашицы и добавляют в первую пробирку 0,8 мл воды, во вторую 0,2 мл раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, а в третью - 0,8 мл раствора малоновой кислоты.

Во все пробирки приливают по 1 мл раствора сукцината натрия, по 1 капле раствора метиленового синего и после перемешивания по 3-4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню при 37?С. Через 3-5 мин наблюдают обесцвечивание раствора.

Оформление работы. Сравнить интенсивность голубого окрашивания в трех пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Практическое значение работы. Конкурентные ингибиторы различных ферментов широко применяются в биохимических исследованиях и в практической медицине как лекарственные препараты. В частности, малоновая кислота как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы используется в экспериментах на животных для того, чтобы изучить изменения в обмене веществ в тканях при блокаде этого фермента, а также для исследования самого механизма конкурентного торможения.

Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови

Реактивы. Пероксид водорода, 3%-ный раствор; азид натрия, 1%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки.

Материал. Цельная кровь, разведенная водой в 10 раз.

Метод основан на визуальном сравнении интенсивности выделения пузырьков газа (кислорода) при разложении пероксида водорода с участием каталазы крови в отсутствии и в присутствии азида натрия NaN3.

Ход определения. В две пробирки вносят по капле крови и добавляют в одну их них 2 капли воды, а в другую - такой же объем раствора азида натрия. Пробы встряхивают.

Через 2 мин прибавляют в обе пробирки по 2 мл раствора пероксида водорода и сравнивают интенсивность выделения пузырьков газа.

Оформление работы. По полученным данным сделать вывод о действии азида натрия на каталазу крови и указать на практическое значение работы.

Практическое значение работы. Неконкурентными ингибиторами геминовых ферментов (цитохромы, цитохромоксидаза, каталаза и пероксидаза) являются азиды и цианиды, которые взаимодействуют с железом гема, входящего в активный центр, подавляя тем самым каталитическую активность этих ферментов. Благодаря этому азиды и цианиды являются сильными ядами. Учитывая, что они неконкурентные ингибиторы, снять их действие можно только теми веществами, которые связывают их и освобождают из активного центра фермента.

6. Количественное определение активности ферментов

В клинико-биохимических лабораториях широко используется количественное определение активности ферментов для диагностики заболеваний, а также для контроля за проводимым лечением. В фармации оно необходимо для контроля качества ферментных препаратов, а в научных биохимических исследованиях - для наблюдения за процедурой очистки фермента.

Об активности фермента судят по количеству превращенного субстрата или образовавшегося продукта реакции за определенный промежуток времени. Скорость ферментативной реакции графически описывается в виде гиперболы - кривая Михаэлиса-Ментен, поэтому для правильного измерения активности ферментов необходимо соблюдать ряд правил. Определение следует вести в стандартных условиях, т.е. при насыщающих концентрациях субстрата или субстратов, оптимуме рН среды и постоянной температуре, которые должны поддерживаться весь период наблюдения. При изучении сложных ферментов в среду добавляют необходимые кофакторы. Эти условия обеспечивают нулевой порядок реакции, при которой ее скорость лимитируется только концентрацией исследуемого фермента. Измерять активность фермента нужно не за любой отрезок времени, а только за начальный, когда скорость реакции протекает линейно, т.е. за единицу времени превращается одно и то же количество субстрата (это так называемая начальная скорость реакции).

В зависимости от способа регистрации все методы определения ферментативной активности можно подразделить на два типа: метод отбора проб и непрерывного наблюдения. В первом случае перед инкубацией и через определенные отрезки времени в ходе реакции отбирают пробы раствора, осаждают белок и определяют в безбелковой жидкости содержание субстратов или продуктов реакции. По полученным данным строят кривую зависимости образования продуктов реакции от времени и рассчитывают активность фермента. Во втором случае наблюдение ведут непрерывно или автоматически регистрируют ход реакции, если субстрат (или продукт реакции) поглощает в определенной области спектра или флуоресцирует, что позволяет постоянно следить за изменением его концентрации в среде за выбранные промежутки времени.

Метод непрерывной регистрации очень чувствителен, удобен и экономичен, так как для него требуются небольшие количества биологического материала или ферментного препарата. Он широко применяется при количественном измерении активности окислительных ферментов, для действия которых необходимы никотинамидные коферменты. Окисленные формы их (НАД+ и НАДФ+) не поглощают при 340 нм, а восстановленные (НАД•Н2 и НАДФ•Н2) имеют максимум абсорбции при этой длине волны. Поэтому скорость ферментативной реакции определяют по степени восстановления окисленных форм данных коферментов или по степени окисления восстановленных форм.

Для выражения активности таких ферментов используют молярный коэффициент экстинкции восстановленных форм НАД и НАДФ, который при 340 нм равен 6,22•106 см2/моль, или 6,22•103л•моль-1•см-1. Это означает, что если в процессе реакции произошло изменение экстинкции на 6,22•106, то это указывает на образование (или убыль) 1 моля восстановленного кофермента в расчете на 1 мл реакционной смеси. Если экстинкция изменяется на 6,22•103 или на 6,22, то соответственно образуется (или расходуется) в ходе реакции 1 ммоль или 1 мкмоль восстановленных коферментов на 1 мл среды. Можно также наблюдать за скоростью ферментативной реакции по поглощению восстановленного НАД и НАДФ при 366 нм. Молярный коэффициент экстинкции в этом случае равен 3,3•106 см2/моль.

Концентрацию исследуемого фермента подбирают таким образом, чтобы обеспечить изменение экстинкции на 0,010-0,100 за 1 мин. Если этот показатель выше, то проба, содержащая фермент, разводится, если ниже, то берется больший объем изучаемого образца.

Для непрерывного наблюдения за ходом реакции по светопоглощению восстановленных форм НАД (НАДФ) или других субстратов при определенной длине волны требуются спектрофотометры. Однако, современный фотоэлектроколориметр типа КФК-2 позволяет проводить измерения ферментативной активности, например, при 366 нм (расчет производится по экстинкции раствора НАД•Н или НАДФ•Н с известной концентрацией).

При невозможности наблюдать за реакцией непрерывно активность фермента измеряют методом отбора проб, причем содержание субстратов и продуктов реакции определяют разными способами. Наиболее распространены колориметрические методы.

Правила выражения активности ферментов в единицах СИ были изложены ранее (см. с.11). Температура, при которой проводится определение, указывается при выражении активности фермента.

Работа 30. Количественное исследование активности препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу

Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М с рН 7,4*; пируват натрия, раствор 2•10-2 М на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4; НАД•Н динатриевая соль, свежеприготовленный 6•10-3 М раствор в дистиллированной воде.

Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; стеклянная палочка; секундомер; СФ или ФЭК типа КФК-2.

Материал. Разведенный продажный препарат фермента 0,2 мкг/мл. Кристаллический препарат в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония, имеющий активность около 200 ФЕ/мг белка, разводят в 1000 раз 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,4 перед опытом (1 ФЕ соответствует 1 мкмоль превращенного субстрата за 1 мин) Если нет в наличии продажного препарата лактатдегидрогеназы, то кристал. суспензию фермента можно получить из скелетных мышц кролика (см. Г.А.Кочетов. Пр.рук.по энзимологии.М.,Высш.шк.,1980, с.71)..

Метод основан на непрерывном измерении скорости окисления НАД•Н2, используемого на восстановление пирувата в реакции, катализируемой ЛДГ. По уменьшению экстинкции НАД•Н2 при 340 нм рассчитывают количество превращенного субстрата за единицу времени. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимое превращение пирувата в лактат:

Н

¦

СН3ЇСЇСООН + НАД·Н2 НАД+ + СН3ЇСЇСООН

¦ ¦

О ОН

пируват лактат

Равновесие реакции сдвинуто вправо, поэтому при изучении ЛДГ удобнее использовать в качестве субстрата пируват и НАД•Н2 и по скорости окисления последнего рассчитать активность этого фермента.

Ход определения. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 2,4 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора НАД•Н2 и 0,1 мл образца фермента. Перемешивают стеклянной палочкой и ставят в кюветодержатель.

Устанавливают шкалу отсчета экстинкции на 0,400 и ручкой «щель» выводят стрелку гальванометра (при открытой шторке) на нуль. В течение 1 мин проверяют отсутствие неферментативного окисления НАД•Н2 (в этом случае экстинкция не падает).

Добавляет в кювету 0,3 мл раствора пирувата натрия (запускают реакцию), быстро перемешивают, ручкой «щель» при открытой шторке возвращают стрелку гальванометра к нулевой отметке и включают секундомер.

Снимают показания экстинкции (падение ее, начиная от отметки 0,400) через каждые 30 с в течение 2-3 мин. Если условия реакции подобраны верно, то за каждые 30 с наблюдается примерно одинаковое уменьшение экстинкции.

Расчет. Удельную активность ЛДГ х (мкмоль•мин-1•мг-1) рассчитывают по формуле

 ?Емин3,0•1000

х = -------------- ,

6,22•0,02

где ?Емин - изменение экстинкции в ходе реакции за 1 мин;

6,22 - коэффициент экстинкции 1 мкмоль НАД•Н2 в 1 мл среды;

3,0 - объем инкубационной смеси, мл;

0,02 - количество белка в кювете, мкг;

1000 - коэффициент пересчета количества белка в миллиграммы.

Оформление работы. Рассчитать удельную активность ферментного препарата, молекулярную активность ЛДГ (учитывая, что ее молекулярная масса 135000). Сделать вывод о качестве исследуемого препарата (сохранность исходной активности, %).

Практическое значение работы. Принципы измерения активности лактатдегидрогеназы спектрофотометрическим методом непрерывного наблюдения используются при исследовании других ферментных препаратов, очищенных ферментов и в клинико-биохимических лабораториях при количественном определении активности ферментов в биологических жидкостях и биоптатах в норме и при патологии.

Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Реактивы. Лактат натрия, 0,45 М раствор или нейтрализованная гидроксидом натрия молочная кислота той же концентрации; пирофосфат натрия, 0,03 М раствор (Na4P2O7•10H2O растворить в 50 мл воды, довести рН до 8,8 с помощью 1 М соляной кислоты и долить водой до 500 мл); НАД, свежеприготовленный раствор 3мг/мл; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 1 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор; пируват натрия, раствор для построения калибровочного графика (содержит 11 мкг пирувата натрия или 8,8 мкг пировиноградной кислоты в 1 мл).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; ФЭК; водяная баня с лабораторным термометром.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

СН3ЇСНЇСООН + НАД+ СН3Ї СЇСООН + НАД·Н2

¦ ¦

ОН О

лактат пируват

Пируват с 2,4-динитрофенилгидразином образует соответствующий гидразон, имеющий красно-бурое окрашивание в щелочной среде, интенсивность которого прямо пропорциональна содержанию кетокислоты:

Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД+ и ставят на 5 мин в водяную баню при 37?С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 37?С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл раствора гидроксида натрия, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ пробы	Пируват натрия, мл	Пирофосфат натрия, мл	Дистиллированная вода, мл	Содержание пирувата в пробе, мкмоль	Единицы активности ЛДГ, ммоль/ч•л	Экстинкция
1	0,1	0,8	0,5	0,01	1,2
2	0,2	0,8	0,4	0,02	2,4
3	0,4	0,8	0,2	0,04	4,8
4	0,6	0,8	-	0,06	7,2
5	0,8	0,6	-	0,08	9,6

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс - соответствующие им единицы активности ЛДГ, выраженные в ммоль/(ч•л).

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможном изменении активности и его причинах.

Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8-4,0 ммоль/(ч•л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.