Ест - экстинкция стандартной пробы против контроля стандарта;

2 - коэффициент пересчета на час инкубации;

1,2 - объем проб до центрифугирования;

0,5 - объем надосадочной жидкости, взятой на исследование;

10000 - коэффициент пересчета на литр сыворотки крови.

После сокращения формула приобретает следующий вид:

2,4Еоп

х = --------

Ест

Оформление работы. Рассчитать активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови и по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений.

Практическое значение работы. Больше всего креатинфосфокиназы в мышечной (скелетная мышца и сердце) и нервной тканях, в которых она участвует в переносе энергии. В остальных тканях и органах ее активность в 100-1000 раз ниже. Поэтому при повреждении мышечной и нервной тканей или при заболеваниях, вызывающих повышение их проницаемости, имеет место «утечка» фермента из тканей и повышение его количества в крови. В норме активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови составляет 0,30-0,70 ммоль/(ч•л). В клинической практике определение активности этого фермента используется при диагностике инфаркта миокарда (причем повышение активности его наблюдается через 3 ч после начала некротического процесса и достигает максимума через 24 ч), а также при дистрофии скелетных мышц, поражении нервной ткани.

2. Анализ пигментов и окислительных процессов фотосинтезирующих организмов

В клетках фотосинтезирующих организмов имеется система пигментов (хлорофиллы, фикобилины, каротиноиды) избирательно улавливающие кванты света в видимой области спектра, которые затем трансформируются в энергию фосфатных связей АТФ. В темновой период суток эти организмы преобразуют энергию окислительно-восстановительных реакций в энергию АТФ как хемотрофы.

В митохондриях животных и растительных клеток функционируют сходные ферменты биологического окисления и системы трансформации энергии в дыхательной цепи. Исследование этих процессов проводится аналогичными методами, что и в гетеротрофных организмах. В то же время в растениях отмечается высокая активность ряда оксидаз (пероксидаза, полифенолоксидаза и др.), принимающих участие в окислении вторичных продуктов обмена.

Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений

Реактивы. Этанол, 96%-ный; бензин; гидроксид бария, насыщенный раствор; аскорбиновая кислота, кристаллическая; соляная кислота, 10%-ный раствор.

Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; капельницы; пипетки вместимостью 5 мл; аптечные весы с разновесками; ступка с пестиком.

Материал. Листья крапивы, сушеные.

а. Экстрагирование пигментов из листьев крапивы. Метод основан на способности хлорофилла и других пигментов под действием горячего спирта переходить в раствор, при этом хлорофилл при взаимодействии со спиртом превращается в этилхлорофиллид - сложный эфир, в котором остаток фитола замещен остатком этилового спирта.

Ход определения. 0,5 г сушеной крапивы растирают в ступке с 5,0 мл этилового спирта, переносят в пробирку и нагревают на водяной бане при 90-100?С до закипания спирта. Содержимое фильтруют через бумажный фильтр в другую пробирку. Фильтрат, содержащий хлорофиллид, ксантофилл и другие пигменты, имеет зеленый цвет с интенсивной красной флюоресценцией. Его используют для исследования.

б. Разделение пигментов по Краусу. Метод основан на различной способности пигментов растворяться в бензине: хлорофилл, хлорофиллид растворимы, а ксантофилл нерастворим в нем.

Ход определения. К 10 каплям полученного фильтрата прибавляют равный объем бензина, содержимое тщательно встряхивают, постукивая пальцем по дну пробирки. Наблюдают за окраской пигментов, содержащихся в разных растворителях.

в. Осаждение хлорофилла. Метод основан на способности эфирных групп при омылении раствором гидроксида бария образовывать бариевые соли хлорофиллидов А и В, нерастворимых в воде; жидкость над осадком имеет желтую окраску вследствие присутствия в вытяжке каротина и ксантофилла.

Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 20 капель раствора гидроксида бария и тщательно взбалтывают. Наблюдают за происходящими изменениями.

г. Восстановление хлорофилла аскорбиновой кислотой. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать хлорофилл, приобретающий вследствие этого желтое окрашивание.

Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 2 капли воды, несколько кристалликов аскорбиновой кислоты и в течение 3-5 мин нагревают в водяной бане при 70-80?С. Наблюдают за изменением окраски.

д. Получение феофитина из хлорофилла. Метод основан на способности соляной кислоты связывать ион магния, входящий в состав хлорофилла, с образованием феофитина, имеющего оливково-бурый цвет.

Ход определения. К 5 каплям фильтрата прибавляют 1 каплю раствора соляной кислоты. Наблюдают за изменением окраски.

Оформление работы. Дать оценку качественным реакциям на пигменты растений. В выводах обосновать значение хлорофилла и других пигментов для фотосинтетических процессов.

Практическое значение работы. Методы разделения и анализа пигментов фотосинтетического аппарата растений используются для изучения физико-химических свойств, фотохимической активности и характеристики их состава на разных стадиях онтогенеза растений и влияния на него факторов внешней среды.

Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу А.Н. Бояркина

Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 5,4*; пероксид водорода, 0,03%-ный раствор; бензидин, 0,92 г/л раствор на ацетатном буфере*.

Оборудование. Колбы вместимостью 25 мл; пипетки вместимостью 5 мл; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Листья растений, свежие.

Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы.

Реакция описывается уравнением.

Ход определения. Навеску 100 мг растительного материала помещают в ступку и растирают, прибавляя порциями 10 мл дистиллированной воды. Растертую массу переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы настаивают 10 мин, затем сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Для определения активности фермента берут кювету с толщиной слоя 2 см и наливают в нее по 2 мл водной вытяжки из листьев, ацетатного буфера и раствора бензидина. Ставят кювету в кюветодержатель и устанавливают стрелку прибора на нулевую отметку, затем добавляют 2 мл раствора пероксида водорода пипеткой с широким носиком (чтобы сильная струя перемешала жидкость в кювете) и одновременно с добавлением пероксида включают секундомер. Раствор в кювете начинает синеть и по мере нарастания интенсивности окраски стрелка прибора отклоняется. Отмечают время от начала приливания раствора пероксида водорода до достижения стрелкой гальванометра отметки 0,250. Повторяют определение трижды и берут среднее значение времени.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по формуле

?Е 25•1000

х = ----------------

t•d 0,1•2

где х - активность пероксидазы, Е•с-1•кг-1 (Е - единица экстинкции);

?Е - изменение экстинкции, равное 0,250;

t - время реакции, с;

d - толщина слоя кюветы, равная 2;

1000 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;

0,1 - навеска, г;

2 - объем пробы, мл.

После сокращений формула принимает вид

15625

х = ----------

t

Оформление работы. Рассчитать и сравнить активность пероксидазы в исследуемом материале; в выводе отметить биологическое значение фермента.

Практическое значение работы. Пероксидаза выполняет две функции: собственно пероксидазную, т.е. окисляет вещества с участием пероксида водорода, и оксидазную, т.е. катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия пероксида водорода. Этот фермент проявляет перокисдазную активность в отношении практически всех фенолов (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.), ароматических аминов (бензидин, n-фенилендиамин и др.), аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д.

В то же время пероксидаза, обладая оксидазной функцией, способна участвовать в окислении флороглюцина, НАД•Н2, НАДФ•Н2, индолилуксусной кислоты, оксалата, фенилпирувата и т.д.

В практике широко используют определение активности пероксидазы для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена при физиологических и патологических процессах. Пероксидаза, выделенная из хрена, широко используется как аналитический реагент при проведении клинико-биохимических исследований. Поэтому метод измерения активности фермента необходим для контроля качества продажного препарата фермента.

ОБМЕН УГЛЕВОДОВ

Методы исследования обмена углеводов необходимы для диагностики сахарного диабета и других эндокринных заболеваний, энзимопатий, функции печени, почек и т.д. Одним из информативных показателей состояния углеводного обмена является уровень глюкозы в крови, исследование которого чаще всего проводится в клинике. Реже прибегают к изучению содержания других сахаров и гликогена, а также к определению концентрации молочной и пировиноградной кислот. При наследственных нарушениях метаболизма углеводов известную диагностическую ценность представляет определение активности участвующих в нем ферментов.

Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови о-толуидиновым методом

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 30 г/л раствор; о-толуидиновый реактив*; глюкоза, основной стандартный 27,8 мМ раствор, свежеприготовленный.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 1 и 5 мл; водяная баня; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Кровь, взятая из пальца.

Метод основан на способности глюкозы при нагревании с о-толуидином в растворе уксусной кислоты давать зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы.

Ход определения. В центрифужную пробирку отмеряют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Из пальца обследуемого берут микропипеткой 0,1 мл крови и выдувают в пробирку с трихлоруксусной кислотой. Смесь в пробирке перемешивают встряхиванием и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Отбирают 0,5 мл центрифугута в другую пробирку и добавляют в нее 2 мл о-толуидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 8 мин, после чего охлаждают под струей холодной воды.

Для постановки стандартной пробы вместо крови берут 0,1 мл разведенного в 5 раз стандартного раствора глюкозы, добавляют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты и с 0,5 мл полученной смеси проводят реакцию с о-толуидиновым реактивом.

Фотометрируют опытную и стандартные пробы на ФЭКе при 590-650 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см в сравнении с дистиллированной водой.

Расчет. Содержание глюкозы в крови х (моль/л) рассчитывают по формуле

Еоп Сст

х = ---------- ,

Ест

где Еоп - экстинкция опыта,

Ест - экстинкция стандарта;

Сст - концентрация глюкозы в стандартной пробе, равная 5,55 ммоль/л.

Оформление работы. Рассчитать концентрацию глюкозы в крови обследуемого и сделать вывод о причинах возможных изменений ее уровня.

Практическое значение работы. Методы, применяемые для определения глюкозы, не всегда дают истинное содержание ее в крови, поэтому существуют понятия - «истинная» глюкоза и сахар крови. Последний показатель включает всю сумму восстанавливающих углеводов и некоторые редуцирующие вещества неуглеводной природы (глутатион, креатин, мочевая кислота). Поэтому содержание сахара в крови выше, чем показатель истинной глюкозы.

Среди методов, позволяющих определить концентрацию истинной глюкозы в биологическом материале, следует отметить о-толуидиновый и глюкозооксидазный.

В норме содержание сахара в крови составляет 0,8-1,2 г/л, а глюкозы - 2,8-4,0 ммоль/л. Увеличение уровня сахара в крови (гипергликемия) наблюдается при сахарном диабете, при избытке в организме глюкокортикоидов - гормонов коры надпочечников, при стрессовых состояниях, при употреблении с пищей большого количества углеводов и т.д. Низкое содержание сахара в крови (гипогликемия) имеет место при голодании, нарушении всасывания глюкозы в тонком кишечнике (малосорбция), при избытке инсулина в организме (гиперинсулинизм) и т.д.

Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Реактивы. 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; натрий фосфат двузамещенный, 0,25 моль/л*; раствор глюкозооксидазы*; фенолфталин 0,5%; рабочий реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,0; 2,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Кровь, взятая из пальца.

Метод основан на способности глюкозооксидазы при определенном оптимуме рН действия катализировать распад глюкозы с образованием перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина, который в нейтральной области бесцветен, а в щелочной области окрашен в красный цвет.

Ход определения. 0,03 мл крови выливают в 1,5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 2 мл 0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли (приблизительно 0,1 мл) раствора глюкозооксидазы. Перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре на 1 час, затем добавляют 2 мл рабочего реактива и через 30 мин фотометрируют в кювете на 10 мм при длине волны 530 нм (зеленый светофильтр).

Одновременно ставят контрольную пробу, в которую берут 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и далее проводят как и опытную пробу.

Расчет. Расчет проводят по калибровочному графику.

Оформление работы. По экстинкции рассчитывают содержание глюкозы в крови, сравнивают ее содержание с нормой и делают вывод о возможных отклонениях.

Практическое значение работы. (См. определение содержания глюкозы в крови орто-толуидиновым методом).

Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; сульфат меди (II), 20%-ный и 4%-ный растворы; оксид кальция, порошок, навеска 0,5 г; серная кислота, конц.; n-гидроксидифенил, свежеприготовленный щелочной раствор (50 мг n-гидроксидифенила растворяют в 3 мл 3%-ного раствора гидроксида натрия).

Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; пипетки на 0,1 и 1 мл; стеклянные палочки; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Кровь, взятая из пальца.

Метод основан на способности молочной кислоты при нагревании с концентрированной серной кислотой переходить в ацетальдегид, дающий с n-гидроксидифенилом характерную фиолетовую окраску, интенсивность которой пропорциональна концентрации молочной кислоты:



Ход определения. В центрифужную пробирку отмеривают 0,5 мл дистиллированной воды и вносят в нее 0,1 мл крови, взятой микропипеткой из пальца обследуемого. Микропипетку промывают той же водой.

К содержимому пробирки добавляют 1 мл раствора уксусной кислоты и помещают ее на 10 мин в лед (для лучшего осаждения белков), после чего центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают в чистую центрифужную пробирку, добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора сульфата меди и 0,5 г порошка оксида кальция и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Появляется голубое окрашивание (если окрашивание зеленоватое, то проба дальнейшей обработке не подвергается). Смесь оставляют стоять на 30 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. Затем ее центрифугируют 5 мин при 100 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку, приливают 1 каплю 4%-ного сульфата меди и осторожно наслаивают 3 мл концентрированной серной кислоты, погрузив при этом пробирку в лед и непрерывно помешивая содержимое стеклянной палочкой. После этого пробирку помещают в кипящую водяную баню на 5 мин и затем охлаждают ее в водяной бане до 20?С.

К охлажденной смеси приливают 1 каплю (0,05 мл щелочного раствора n-гидроксидифенила и ставят пробирку в водяную баню при 30?С на 30 мин, время от времени взбалтывая содержимое. В пробирке за это время развивается голубое окрашивание. Пробирку помещают на 90 с (точно!) в бурно кипящую водяную баню. За это время голубая окраска переходит в фиолетовую. Затем смесь охлаждают и фотометрируют на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см против воды.

Расчет. Содержание молочной кислоты х (ммоль/л) рассчитывают по формуле

с1000

х = ---------- ,

0,1•1000

где с - количество молочной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, ммоль;

0,1 - объем крови, взятый на исследование, мл;

1000 в числителе - коэффициент пересчета на 1 л крови;

1000 в знаменателе - коэффициент перевода микромолей в миллимоли.

Оформление работы. Рассчитать содержание молочной кислоты в крови обследуемого. В выводе указать на возможные сдвиги концентрации молочной кислоты и их причины.

Практическое значение работы. В норме содержание молочной кислоты в крови составляет 0,50-2,0 ммоль/л. Увеличение ее содержания может наблюдаться при усиленной мышечной работе, при заболеваниях, сопровождающихся развитием гипоксии (недостаточность сердечной деятельности, хронические бронхиты, анемия и т.д.).

Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 5%-ный раствор; 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ), 0,1%-ный раствор в 2 М растворе соляной кислоты; толуол; карбонат натрия, 10%-ный раствор; гидроксид натрия, 1,5 М раствор.

Оборудование. Пенициллиновые флакончики с полиэтиленовыми пробками; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; бюретка вместимостью 25 мл; пипетка с резиновой грушей; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Кровь.

Принцип метода см. работу 31.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл крови, приливают 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают встряхиванием и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

В пенициллиновый флакон отбирают 1 мл центрифугата, прибавляют 2 мл воды и 1 мл раствора 2,4-ДНФГ, перемешивают встряхиванием, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 мин.

К содержимому флакона добавляют 5 мл толуола, закрывают флакон пробкой и встряхивают 3 мин. После расслоения фаз отсасывают пипеткой с резиновой грушей нижний слой и отбрасывают его.

К оставшемуся во флаконе слою толуола приливают 4 мл раствора карбоната натрия, закрывают флакон пробкой и встряхивают 3 мин. После расслоения жидкостей отбирают из нижнего слоя 3 мл в пробирку и добавляют в нее 3 мл раствора гидроксида натрия (появляется красно-бурое окрашивание).

Через 5 мин фотометрируют пробу на ФЭКе при 415 нм (светофильтр синий) в кювете с толщиной слоя 1 см против воды.

Расчет. Содержание пировиноградной кислоты х (ммоль/л) рассчитывают по формуле

с 1000•3

х = ------------ ,

4•1000

где с - количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль;

1000 в числителе - коэффициент пересчета на литр крови;

1000 в знаменателе - коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

4 - объем добавленного раствора карбоната натрия, мл;

3 - объем раствора карбоната натрия, отобранного для проведения реакции, мл.

Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание пировиноградной кислоты в крови и сделать вывод о причине возможных его изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание пирувата в крови составляет 0,1-0,13 ммоль/л. Его уровень повышается при недостатке в организме тиамина (витамина В1), а также в результате действия ингибиторов пируватоксидантного комплекса (арсенат, люизит и др.).

ОБМЕН ЛИПИДОВ

Для изучения состояния липидного обмена в организме используется определение содержания липидных компонентов в биологических жидкостях. Разные липиды входят в состав сложноорганизованных комплексов - липопротеидов - или адсорбируются белками, в основном альбуминами, плазмы или сыворотки крови. В крови содержатся хиломикроны, образующиеся в слизистой тонкого кишечника и поступающие в нее с лимфой, пре-в-липопротеиды (липопротеиды очень низкой плотности), в-липопротеиды (липопротеиды низкой плотности) и б-липопротеиды (липопротеиды высокой плотности). Апопротеиды трех последних классов липопротеидов синтезируются в печени, поэтому по содержанию липопротеидов в крови судят не только о липидном обмене, но и функции печени.

При исследовании обмена липидов в клинике определяют содержание липопротеидов, общих липидов, включающих сумму всех липидных веществ сыворотки или плазмы крови, а также отдельные их фракции - триацилглицерины, неэтерифицированные жирные кислоты, свободный и этерифицированный холестерин, фосфолипиды.

Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом

Реактивы. Серная кислота, конц.; фосфованилиновый реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки для отмеривания сильных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 10 мл; стеклянные палочки; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности продуктов распада ненасыщенных липидов образовывать с фосфованилиновым реактивом соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Ход определения. В опытную пробирку (сухую!) вносят 0,1 мл сыворотки крови и 2,9 мл концентрированной серной кислоты (осторожно! Специальными пипетками!), а в контрольную - 0,1 мл дистиллированной воды и 2,9 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин (осторожно!). Затем обе пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Из опытной и контрольной пробирок отбирают по 0,2 мл охлажденного содержимого в другие пробирки, в которые предварительно наливают фосфованилинового реактива по 3 мл в обе пробирки.

После тщательного перемешивания стеклянной палочкой пробы ставят на 45 мин в темное место при комнатной температуре (для развития окрашивания).

Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр), в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание общих липидов в сыворотке крови х (г/л) рассчитывают по формуле

m10000•3

х = -------------- ,

0,2•1000

где m - масса общих липидов в пробе, найденная по калибровочному графику (рис.6), мг;

10000 - коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

1000 - коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

3 - общий объем исходной смеси (0,1 мл сыворотки крови + 2,9 мл концентрированной серной кислоты), мл;

0,2 - объем смеси, взятой для проведения цветной реакции, мл.

Оформление работы. По найденному значению экстинкции рассчитать содержание общих липидов в крови, указав на возможные изменения в их содержании и причину этих изменений. В выводах отметить практическое использование метода определения общих липидов в клинической лаборатории для выявления нарушений липидного обмена.

Практическое значение работы. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови (нормолипемия) составляет 4,0-8,0 г/л. При физиологических условиях увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наблюдается через 1-4 ч после принятия богатой жирами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипемия). Гиперлипемия проявляется при многих патологических состояниях: у больных сахарным диабетом отмечается резко выраженная гиперлипемия (до 20,0 г/л), при заболеваниях почек (липоидном нефрозе), при поражении печени (циррозе печени и остром гепатите), при ожирении, при врожденной гиперлипемии, атеросклерозе и у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Работа 51. Определение содержания в- и пре- в-липопротеидов сыворотки крови турбидиметрическим методом по Бурштейну и Самай

Реактивы. Хлорид кальция, 0,025 М раствор; гепарин, содержащий 1000 единиц в 1 мл.

Оборудование. Микропипетки; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности гепарина образовывать с в- и пре-в-липопротеидами сыворотки крови комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок. Степень помутнения раствора пропорциональна содержанию этих липопротеидов в сыворотке крови.

Ход определения. В контрольную и опытную кюветы ФЭКа с толщиной слоя 0,5 см наливают по 2 мл хлорида кальция. Устанавливают шкалу прибора на нулевую отметку при 720 нм (красный светофильтр).

В опытную кювету приливают микропипеткой 0,2 мл сыворотки, несколько раз промывая пипетку. Отмечают исходное значение экстинкции (Е1). Затем добавляют микропипеткой 0,04 мл гепарина, несколько раз промывая ее, и перемешивают содержимое кюветы. Ровно через 4 мин (по секундомеру) вновь измеряют экстинкцию (Е2).

Расчет. Содержание в- и пре-в-липопротеидов х (г/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

х = (Е2 - Е1)11,65 ,

где 11,65 - эмпирический коэффициент пересчета содержания в- и пре-в-липопротеидов на г/л.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции рассчитать содержание определяемых липопротеидов в сыворотке крови и сделать вывод о возможных их изменениях.

Практическое значение работы. В норме содержание липопротеидов в сыворотке крови составляет 3,6-6,5 г/л. Наиболее часто наблюдается увеличение содержания в-липопротеидов в сыворотке крови. Повышение уровня липопротеидов тесно связано с повышением содержания холестерина в крови; им наиболее богаты в-липопротеиды. Повышение в- и пре-в-липопротеидов имеет место при заболеваниях, связанных с нарушением липидного обмена (атеросклероз, сахарный диабет и др.). Концентрация в- и пре-в-липопротеидов в сыворотке крови имеет значение не только для выявления нарушений липидного обмена, но и как показатель функции печени (гепатиты).

Работа 52. Определение содержания холестерина в сыворотке крови по методу Илька

Реактивы. Реактив Илька*.

Оборудование. Пипетка для отмеривания концентрированных кислот; термостат, отрегулированный на 37?С; микропипетки; штатив с пробирками; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на реакции Либермана-Бурхарда (см. работу 18, б). Интенсивность изумрудно-зеленой окраски пропорциональна содержанию холестерина.

Ход определения. В пробирку вносят 2,1 мл реактива Илька и приливают 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови, которую добавляют медленно, так чтобы она стекла по стенке пробирки. Пробирку энергично встряхивают 10-12 раз и помещают в термостат на 20 мин при 37?С. Фотометрируют на ФЭКе при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против реактива Илька.

Расчет. Содержание холестерина определяют по калибровочному графику (рис. 7).

Примечание. При проведении реакции нужно пользоваться абсолютно чистыми и сухими пробирками и пипетками. Соотношение компонентов реактива Илька рассчитано так, что белки сыворотки крови не выпадают в осадок. Появление мути может быть вызвано лишь наличием воды в реактиве или посуде.

Оформление работы. Рассчитать содержание холестерина в исследуемой сыворотке крови и по результатам сделать вывод о возможных нарушениях в обмене холестерина.

Практическое значение работы. Содержание холестерина в сыворотке крови у здоровых людей, определенное методом Илька, составляет 3,0-6,2 ммоль/л. Повышенная концентрация холестерина в сыворотке крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, врожденных нарушениях обмена, заболеваниях печени и т.д.

Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов в сыворотке крови

Метод основан на определении концентрации органического фосфата, освободившегося при кислотном гидролизе. Измерение содержания неорганического фосфата проводится реакцией с молибдатом аммония, принцип которой см. работу 11.

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 0,6 М раствор; реактив молибдата аммония*; хлорная кислота, конц.; восстанавливающий реактив*.

Оборудование. Фильтровальная бумага; центрифуга с центрифужными весами; штатив с пробирками; пипетки для забора концентрированных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; песчаная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,2 мл сыворотки и 2,8 мл дистиллированной воды, в контрольную - 3 мл дистиллированной воды. Добавляют в обе пробирки по 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают для перемешивания содержимого.

Центрифугируют опытную пробу 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку переворачивают на фильтровальную бумагу до полного стекания жидкости. Затем в обе пробирки приливают по 1 мл концентрированной хлорной кислоты (специальной пипеткой, осторожно!), помещают в каждую из них по две стеклянные бусинки и встряхивают их содержимое. Пробы ставят на гидролиз в песчаную баню при 180?С на 20-30 мин (до обесцвечивания раствора).

Пробирки охлаждают на воздухе до комнатной температуры, прибавляют по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл свежеприготовленного восстанавливающего реактива. Тщательно перемешивают содержимое пробирок и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.

Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 630 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание общих фосфолипидов х (г/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

m5000•25

х = ------------ ,

10

где m - масса неорганического фосфата в пробе, найденная по калибровочному графику (рис. 8), мг;

5000 - коэффициент пересчета на литр сыворотки крови;

10 - коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

25 - коэффициент пересчета (липидный фосфор составляет 4% относительной молекулярной массы фосфолипидов).

Для пересчета липидного фосфора на ммоль/л необходимо полученные результаты умножить на коэффициент 0,323.

Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание общих фосфолипидов и липидного фосфора в сыворотке крови. Сделать вывод относительно полученных данных.

Практическое значение работы. Фосфолипиды сыворотки (плазмы) крови входят в состав липопротеидов, обусловливая вместе с белком полярные свойства этих смешанных макромолекул и их растворимость. В норме содержание общих фосфолипидов составляет 1,5-3,6 г/л, или 2,0-3,5 ммоль/л липидного фосфора. Важным показателем является индекс фосфолипиды/холестерин, который в физиологических условиях равен 1-1,5. Этот индекс снижается при атеросклерозе, гипертонической болезни, заболеваниях печени. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови (гиперфосфолипидемия) наблюдается при сахарном диабете, гипотиреозе, при поражении почек и т.д. Пониженный уровень их встречается при тяжелых формах острого гепатита, жировом перерождении печени, тиреотоксикозе.

Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии

Метод основан на различной скорости перемещения липидных фракций сыворотки крови (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, глицериды) в тонком слое адсорбента при движении через него органического растворителя. Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности, и для их обнаружения полученные хроматограммы обрабатывают парами иода.

Реактивы. Этанол - диэтиловый эфир (3:1); хлороформ; растворитель для хроматографии: н-гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (73:25:2); иод металлический.

Оборудование. Пластинки хроматографические Силуфол УФ254; камера для хроматографии; водяная баня; камера для проявления хроматограмм; хроматоскоп.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В мерной колбе вместимостью 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спирто-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню, охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спирто-эфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в широкогорлую пробирку, выпаривают досуха в кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.

В хроматографическую камеру наливают 2-3 мл растворителя. Пастеровской пипеткой наносят на хроматографическую пластину, отступя 1 см от края, 0,01-0,02 мл хлороформного экстракта, помещают пластину в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3-5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю, не доходя до него 0,5 см.

Полученную хроматограмму извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят в камеру для проявления, на дно которой предварительно насыпают кристаллы металлического иода. Сосуд закрывают и подогревают в водяной бане при 60?С. Возгоняющийся иод вступает в реакцию с липидными фракциями.

Через 1 мин хроматограмму извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем неидентифицированные соединения, холестерин, моноглицериды, свободные жирные кислоты, триглицериды и эфиры холестерина.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, указав на ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Указать в выводах возможность дальнейшего количественного определения липидных компонентов.

ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ

В обмене белков можно условно выделить два этапа: первый - распад белков (в том числе апопротеинов сложных белков) до аминокислот и второй превращение аминокислот до конечных продуктов метаболизма (мочевина, СО2 и Н2О) или до некоторых азотсодержащих производных (биогенные амины, креатин, порфирины и т.д.). Для оценки состояния белкового обмена организма исследуют содержание белков и отдельных их фракций в сыворотке крови, аминокислот, а также активность ферментов, катализирующих отдельные стадии превращения белков и аминокислот.

Работа 55. Определение содержания белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом

Реактивы. Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1; 2,5 и 10 мл; палочки стеклянные; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности отдельных белковых фракций сыворотки крови осаждаться в виде мелкой взвеси в фосфатных растворах определенной концентрации. Степень мутности раствора пропорциональна содержанию белковых фракций.

Ход определения. Нумеруют шесть пробирок: 0, 1, 2, 3, 4, 5 и ставят их в штатив. В пробирку «0» (контрольная) вносят 5 мл дистиллированной воды, а в пробирки 1-4 по 5 мл соответствующих рабочих буферных растворов.

В пробирку № 5 наливают 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного раствора фосфатного буфера, содержимое тщательно перемешивают.

Из пробирки № 5 переносят 0,5 мл в контрольную пробирку и по 0,5 мл в пробирки № 1-4, после чего содержимое их перемешивают стеклянной палочкой.

Через 15 мин определяют степень мутности (экстинкцию) растворов № 1-4 против контрольной (нулевая проба) на ФЭКе при 610-640 нм (светофильтр красный) в кювете с толщиной слоя 1 см (перед фотометрией пробирки встряхивают).

Расчет. Подобранные концентрации растворов фосфатного буфера позволяют осаждать разные фракции белков в зависимости от их изоэлектрической точки. В пробирке № 1 осаждаются все фракции; № 2 - все фракции глобулинов; № 3 -в- и г-глобулины и № 4 - только г-глобулины. Исходя из этого, рассчитывают содержание отдельных белковых фракций в процентах или в абсолютных величинах (в г/л).

В процентах расчет проводят следующим образом. Вычисляют Е для каждой фракции:

для альбуминов Е = Е1 - Е2;

для б-глобулинов Е = Е2 - Е3;

для в-глобулинов Е = Е3 - Е4;

для г-глобулинов Е = Е4

Полученные значения Е для каждой белковой фракции складывают и условно принимают за 100%, после чего находят содержание для каждой фракции х (в %) по формуле

Еоп 100%

х = ---------- ,

Еобщ

где Еоп - экстинкция данной фракции,

Еобщ - сумма экстинкций всех фракций.

Для расчета содержания белковых фракций в абсолютных значениях предварительно определяют концентрацию белка в сыворотке крови биуретовым методом (см. работу 8) и затем делают расчеты по формуле

Еоп С

х = ---------- ,

Еобщ

где х - содержание данной фракции, г/л;

С - концентрация белка в сыворотке крови, определенная биуретовым методом, г/л.

Оформление работы. Рассчитать процентное и абсолютное содержание белковых фракций в сыворотке крови (для расчета в абсолютных единицах можно использовать данные содержания белка в сыворотке крови, полученные в работе 8), а также альбумин/глобулиновый индекс и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме содержание белковых фракций в сыворотке крови следующее: альбумины 35-60 г/л и глобулины 25-35 г/л, из них б1-глобулины 2,5-5%, б2-глобулины 7-13%, в-глобулины 8-14% и г-глобулины 12-22%. В абсолютных единицах концентрация б1-глобулинов равна 2,0-5,0, б2-глобулинов 4,0-7,0, в-глобулинов 5,0-9,0 и г-глобулинов 8,0-17,0 г/л. Индекс альбумины/глобулины колеблется от 1,5 до 2,3. При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержания альбуминов и возрастанием содержания б-глобулинов, а в более поздние сроки - увеличением концентрации г-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня б2 и г-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови; при злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз печени) сопровождаются снижением альбуминов, которые образуются в печеночной ткани, и относительным увеличением г-глобулинов.

Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по А.А. Покровскому, А.И. Арчакову и О.Н. Любимцевой

Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 4,0; гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере с рН 4,0*; трихлоруксусная кислота, 8%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на спектрофотометрическом определении при 280 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза гемоглобина, образующихся под действием катепсинов сыворотки крови.

Реакция протекает по уравнению

Катепсины

Глобин -------------- (n + 1) Фрагменты глобина

+ nН2О

Экстинкцию кислоторастворимых продуктов гидролиза глобина (пептиды, свободные аминокислоты) измеряют при 280 нм на спектрофотометре. В этой области спектра в основном поглощает тирозин и в меньшей степени триптофан и фенилаланин.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 1 мл раствора гемоглобина и 0,5 мл сыворотки крови, а в контрольную - те же вещества в том же объеме и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивают встряхиванием.

Ставят пробирки на 60 мин в водяную баню при 37?С, после этого приливают к опытной пробе 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают содержимое встряхиванием. Центрифугируют пробы 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет. Проводят с использованием калибровочного графика на тирозин или молярного коэффициента экстинкции тирозина:

Е5000

х = ------------ ,

0,436

где х - активность катепсинов, ммоль тирозина/(ч•л);

Е - экстинкция опытной пробы против контрольной;

5000 - коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

0,436 - коэффициент экстинкции 1 ммоля тирозина.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать активность катепсинов в сыворотке крови, сделать вывод и отметить практическое значение определения данного фермента.

Практическое значение работы. Катепсины, гидролизующие белки в кислой зоне рН, специфичны для лизосом тканей, поэтому в научных исследованиях их определяют как индикаторы чистоты лизосомальной фракции. При поражении органов, особенно при некрозах, активность катепсинов в сыворотке крови увеличивается. Это явление отмечено при инфаркте миокарда, причем степень повышения ферментативной активности в сыворотке крови зависит от глубины и распространенности некротического очага в сердце.

Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

Реактивы. Субстратные растворы № 1 и № 2*; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,1%-ный раствор на 2 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении пировиноградной кислоты, которая является одним из продуктов реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой, или продуктом декарбоксилирования оксалацетата, образующегося в реакции, катализируемой аспартатаминотрансферазой. Образовавшаяся пировиноградная кислота определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (см. работу 31).

Ход определения. Определение активности ферментов проводят по схеме

Последовательность операций	АлАТ	АсАТ
	опыт	контроль	опыт	контроль
Внесение субстратных растворов	Раствор № 1 - 0,5мл	Раствор № 1 - 0,5мл	Раствор № 2 - 0,5мл	Раствор № 2 - 0,5мл
Нагревание	5 мин при 37?С	5 мин при 37?С
Добавление 2,4-ДНФГ	-	1,0 мл	-	1,0 мл
Добавление сыворотки	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл
Инкубация	30 мин при 37?С	60 мин при 37?С
Добавление 2,4-ДНФГ	0,5 мл	-	0,5 мл	-
Экспозиция	20 мин при 18-20?С	20 мин при 18-20?С
Добавление гидроксида натрия	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл
Экспозиция	10 мин при 18-20?С	10 мин при 18-20?С

Фотометрируют опытные пробы против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет производят по формулам:

m10000 m10000•2

х(АсАТ) = -------- или х(АлАТ) = -------- ,

1000 1000

где х - активность ферментов, ммоль/(ч•л);

m - количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику (рис. 9), мкмоль;

10000 - коэффициент пересчета на 1 л сыворотки;

1000 - коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

2 - для пересчета на 1 ч.

Практическое значение работы. В норме активность аланинаминотрансферазы составляет 0,1-0,68, а аспартатаминотрансферазы 0,1-0,45 ммоль/(ч•л).

Определение активности АсАТ и АлАТ и их отношения широко используется в клинической практике для выявления патологических процессов в различных органах. В миокарде более высокая активность АсАТ, чем АлАТ, в печени обратное соотношение активности этих ферментов. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови с одновременным повышением коэффициента АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит и т.д.) более выраженно повышается активность АлАТ и снижается коэффициент АсАТ/АлАТ.

Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови по Табору и Мелеру в модификации В.А. Буробина

Реактивы. L-гистидина моногидрохлорид, 0,2 М раствор (418 мг в 100 мл), доведенный с помощью 1 М раствора NaOH до рН 8,2; пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,2*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; активирующий раствор, содержащий восстановленный глутатион и альбумин*; уроканиновая кислота, 0,001 М раствор для построения калибровочного графика (8,7 мг дигидрата уроканиновой кислоты растворяют в 0,001 М растворе NaOH в мерной колбе вместимостью 50 мл).

Оборудование.

Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; термостат, отрегулированный на 37?С; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на измерении экстинкции уроканиновой кислоты, образующейся из гистидина под действием гистидазы, в зоне ее максимального поглощения при 264 нм в кислой среде.

Ферментативная реакция протекает по уравнению



Ход работы. В две пробирки - контрольную и опытную - вносят по 0,3 мл пирофосфатного буфера, по 0,5 мл исследуемой сыворотки и по 1 мл активирующего раствора. В опытную пробирку приливают 1 мл раствора гистидина и доводят объем пробы до 3 мл дистиллированной водой. Перемешивают содержимое встряхиванием.

Обе пробирки помещают на 2 ч в водяную баню или термостат при 37?С, затем добавляют в пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

После этого в контрольную пробу приливают 1 мл активирующего раствора, объем ее доводят до 3 мл дистиллированной водой и перемешивают содержимое встряхиванием.

Пробы центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной работы против контрольной на спектрофотометре при 264 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Для построения калибровочного графика в семь пронумерованных пробирок вносят компоненты, перечисленные в приведенной ниже таблице, в указанных количествах.

Для приготовления рабочего раствора уроканиновой кислоты берут ее исходный 0,001 М раствор и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.

Доводят объем всех проб до 3 мл дистиллированной водой, добавляют во все пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают содержимое. Центрифугируют пробы 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию, как указано выше.

№№ пробы	Рабочий раствор уроканиновой кислоты, мл	Пирофосфатный буфер, мл	Активирующий раствор, мл	Раствор гистидина, мл	Содержание уроканиновой кислоты в пробе, мкмоль
1	0	0,3	1,0	1,0	0
2	0,05	0,3	1,0	1,0	0,005
3	0,10	0,3	1,0	1,0	0,010
4	0,15	0,3	1,0	1,0	0,015
5	0,20	0,3	1,0	1,0	0,020
6	0,30	0,3	1,0	1,0	0,030
7	0,40	0,3	1,0	1,0	0,040

Расчет производят по формуле

Е200

х = ---------- ,

2

где х - активность гистидазы в сыворотке крови, мкмоль/(ч•л);

Е - содержание уроканиновой кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль;

200 - коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

2 - коэффициент пересчета на 1 ч.

Оформление работы. По полученным экстинкциям рассчитать активность гистидазы в сыворотке крови, сравнить ее с нормой и указать причины возможных отклонений.

Практическое значение работы. Гистидаза содержится преимущественно в печени и коже человека и относится к органоспецифичным для них ферментам. При поражении этих органов, главным образом печени, наблюдается поступление этого фермента в кровь. В норме активность гистидазы в сыворотке крови определяется в виде следов примерно у 1-2% здоровых пациентов. Лишь у грудных здоровых детей регистрируется активность этого фермента в сыворотке крови. При заболеваниях печени в сыворотке крови выявляется гистидазная активность, причем степень ее увеличения характеризует тяжесть патологического процесса.

Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина в моче по Нейману и Логану в модификации П.Н. Шараева

Реактивы. Сульфат меди (II), 0,01 М раствор; пероксид водорода, 6%-ный раствор; серная кислота, 6 М раствор; реактив Эрлиха (5%-ный раствор n-диметиламинобензальдегида в н-пропаноле или изопропаноле); гидроксид натрия, 2,5 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; стеклянные палочки; термостат; вода со льдом (или снегом) в стакане; водяная баня; ФЭК.

Материал. Моча, предварительно профильтрованная.

Метод основан на взаимодействии продукта окисления и декарбоксилирования гидроксипролина с n-диметиламинобензальдегидом, в результате чего образуется окрашенное соединение розового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации гидроксипролина в пробе.

Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл профильтрованной мочи, раствора сульфата меди (II), раствора гидроксида натрия и раствора пероксида водорода. Содержимое обеих пробирок перемешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин, затем их ставят в термостат при 70?С на 5 мин, периодически встряхивая до полного прекращения выделения пузырьков. Затем пробы охлаждают в воде со льдом или снегом. К охлажденным пробам приливают по 4 мл раствора серной кислоты и по 2 мл реактива Эрлиха и перемешивают содержимое пробирок стеклянной палочкой. После этого опытную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 80 с, а контрольную - на то же время в воду со льдом или снегом.

Измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб против воды на ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 1 см. Из экстинкции опытной пробы вычитают экстинкцию контрольной пробы и полученную величину используют для нахождения содержания гидроксипролина в пробе по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика отмеривают в одну пробирку 1 мл воды («слепая» проба), а в пять других (стандартные пробы) - по 1 мл раствора гидроксипролина с концентрацией его 1, 10, 15, 20 и 25 мкг/мл.

Далее пробы обрабатывают так же, как и описанные выше опытные, измеряют экстинкцию стандартных проб против «слепой» при тех же условиях.

Расчет производят по формуле

ЕV

х = ---------- ,

1000

где х - содержание гидроксипролина в моче, мг/сут;

Е - содержание гидроксипролина в пробе, найденное по калибровочному графику по разнице экстинкций опытной и контрольной проб, мкг;

V - суточный объем мочи, мл;

1000 - коэффициент пересчета микрограммов в миллиграмы.

Практическое значение работы. Гидроксипролин входит в состав только белков соединительной ткани - коллагена и эластина, в которых содержание данной аминокислоты составляет соответственно 10-15 и 1,5%. Выделение гидроксипролина с мочой, а также концентрация его в плазме или сыворотке крови зависит, в основном, от скорости синтеза коллагена, образования коллагеновых фибрилл и интенсивности распада коллагена в тканях.

В норме экскреция свободного гидроксипролина с мочой у взрослого человека составляет 1-8 мг, или 7,6-61,0 мкмоль в сутки. Повышенное выделение его с мочой отмечается при повреждении соединительной ткани, сопровождающемся распадом коллагена (например, при ревматизме, системной склеродермии, поражении костей и др.). Динамическое наблюдение за экскрецией гидроксипролина с мочой может дать информацию о формировании рубца в постинфарктном очаге миокарда.

ОБМЕН АЗОТСОДЕРЖАЩИХ НЕБЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ

Основную часть азотсодержащих небелковых соединений составляют нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, порфирины и ряд других веществ, которые образуются в процессе их обмена. В широком смысле к азотсодержащим небелковым компонентам относят пептиды, аминокислоты и некоторые продукты обмена последних. Однако исследование пептидов и аминокислот более информативно для состояния белково-аминокислотного обмена, а некоторые продукты их метаболизма, определяемые в клинике (так называемый остаточный азот, мочевина и др.), характеризуют в целом состояние азотистого обмена.